إعادة بناء وتحليل ثلاثي الأبعاد للهياكل العصبية الرقيقة تحت الخلوية باستخدام بيانات الفحص المجهري الإلكتروني لشعاع الأيونات المركز

Jaclyn McCoy; Marc Nahmani

doi:10.3791/63030

Method Article

إعادة بناء وتحليل ثلاثي الأبعاد للهياكل العصبية الرقيقة تحت الخلوية باستخدام بيانات الفحص المجهري الإلكتروني لشعاع الأيونات المركز

DOI:

10.3791/63030

⸱

September 20th, 2021

Jaclyn McCoy¹ , Marc Nahmani¹

¹Division of Sciences & Mathematics, School of Interdisciplinary Arts & Sciences, University of Washington, Tacoma

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خط أنابيب منهجي مرن لتحديد العمليات العصبية الرقيقة تحت الخلوية وتصورها وتحديدها ضمن أحجام صور الفحص المجهري الإلكتروني للأشعة الأيونية المركزة باستخدام حزم برامج مفتوحة المصدر سهلة الاستخدام.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسمح التطورات الحديثة في تقنيات المجهر الإلكتروني الماسح الآن بالتحليل السريع ثلاثي الأبعاد (3D) للعمليات تحت الخلوية فائقة النحافة. هنا ، يتم تقديم خط أنابيب منهجي لتحديد العمليات العصبية الرقيقة وتصورها وتحليلها ، مثل تلك التي تسقط في العروات قبل المشبكية للخلايا العصبية الأخرى (تسمى "العمود الفقري"). باستخدام حزم البرامج المتاحة مجانا ، يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام شجرة القرار لتحديد الهياكل الخلوية الفرعية العصبية الشائعة باستخدام المعايير المورفولوجية داخل أحجام صور المجهر الإلكتروني لمسح الحزمة الأيونية المركزة (FIB-SEM) ، مع إيلاء اهتمام خاص لتحديد مجموعة متنوعة من العمود الفقري التي تسقط في أعمدة ما قبل المشبكي. على وجه الخصوص ، يصف هذا البروتوكول كيفية تتبع المشابك داخل نقاط الاشتباك العصبي لإنتاج إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لهذه الإسقاطات الفرعية الرقيقة ، وعصباتها الأم ، وشركائها بعد المشبكي. بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن البروتوكول قائمة بالبرامج مفتوحة المصدر المتاحة مجانا لتحليل بيانات FIB-SEM ويقدم نصائح (على سبيل المثال ، التنعيم ، الإضاءة) نحو تحسين عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد للتصور والنشر. يوفر هذا البروتوكول القابل للتكيف نقطة دخول إلى التحليل النانوي السريع للهياكل الخلوية داخل أحجام صور FIB-SEM.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غالبا ما تستفيد التحقيقات في علاقات البنية والوظيفة للمكونات الخلوية الفرعية الرقيقة بالنانومتر من التصور والتحليل ثلاثي الأبعاد¹. ومع ذلك ، فقد تم تقييد دراسات الفحص المجهري الإلكتروني للمقطع التسلسلي زمنيا ومكانيا بسبب ضرورة استخدام سكين ماسي لقطع ومحاذاة مئات إلى آلاف المقاطع التسلسلية فائقة النحافة ≥40 نانومتر. حدت هذه القيود من القدرة على أخذ عينات وتحليل فعال للهياكل الفرعية الخلوية الرقيقة (قطرها <40 نانومتر) ، وقد أعاقت ضرورة أن تصبح بارعا في التقسيم التسلسلي فائق النحافة تطبيق التحليلات الهيكلية ثلاثية الأبعاد²^،³. ومع ذلك ، فإن التطورات الحديثة في المجهر الإلكتروني لمسح الحزمة الأيونية المركزة (FIB-SEM) قد أحدثت ثورة في سرعة ودقة أحجام الصور التي يمكن الحصول عليها وتسمح الآن بالتحليل الكمي للهياكل الفرعية الخلوية الرقيقة مثل الشبكة الإندوبلازمية الملساء⁴^،⁵ ، والمشابك العصبية³^،⁶ ، والحويصلات المشبكية⁷^،⁸ على نطاق واسع. بالإضافة إلى ذلك ، أدى الاستخدام الأوسع لأحجام صور FIB-SEM إلى تسريع تطوير مستودعات حجم الصور FIB-SEM^{التي يمكن} الوصول إليها مجانا 9 وبرامج التحليل ثلاثية الأبعاد (على سبيل المثال ، Espina¹⁰ و IMOD¹¹ و Neuromorph¹² و Reconstruct¹³ و TrakEM¹⁴) التي توسع نطاق هذه التكنولوجيا وتمكن الآن من إجراء تحقيقات في بنية ووظيفة الهياكل دون الخلوية الدقيقة.

إحدى هذه الميزات الخلوية الفرعية ذات المستوى النانوي هي "العمود الفقري" المشبكي العصبي. الشوكولات رقيقة (~ 0.06-0.15 ميكرومتر عرض ، 0.1-1 ميكرومتر) ، نتوءات تشبه الأصابع تنبثق من خلية عصبية واحدة وتصبح مغلفة بواسطة العصبية (على سبيل المثال ، عروة ما قبل المشبكي) من خلية عصبية^{أخرى 15}^،¹⁶. تم الإبلاغ عن Spinules المضمنة في العمليات العصبية في أدبيات المجهر الإلكتروني لما يقرب من 60 عاما¹⁷ ، والنتوءات الشبيهة بالعمود الفقري هي سمة محفوظة¹⁸^،¹⁹^،²⁰ و²¹^،²² في كل مكان من المشابك الاستثارية. ومع ذلك ، على الرغم من انتشار المغزلات المشبكية ، إلا أن وظيفتها (وظائفها) لا تزال غامضة ، وهناك ندرة في البيانات الضرورية لشرح وفرة والحفاظ عليها الهيكلي. يرجع هذا النقص في التوصيف التجريبي للسبيكات في الغالب إلى صعوبة التحليل الكمي لانتشار العمود الفقري وأحجامه. أبعادها الصغيرة هي الأنسب للتحليلات باستخدام دقة z (عمق) لم يكن من الممكن تحقيقها سابقا (أي ≤15 نانومتر).

هنا ، يتم تقديم خط أنابيب تحليل FIB-SEM لتحديد وتصور وتحليل الهياكل الخلوية الفرعية الرقيقة (ذات المقاطع العرضية ≤40 نانومتر) التي يمكن أن تكون بمثابة نقطة دخول للوافدين الجدد والخبراء في FIB-SEM على حد سواء. يعمل هذا البروتوكول كدليل تمهيدي لتحديد الهياكل الخلوية الفرعية العصبية داخل حجم صورة 3D FIB-SEM ، مع التركيز على كيفية استخدام معايير محددة للتعرف على الأنواع الفرعية من العمود الفقري والمشابك وتصنيفها. بالإضافة إلى ذلك ، يوضح البروتوكول كيفية استيراد أحجام الصور إلى منصة برمجية مجانية للتحليل ثلاثي الأبعاد (إعادة البناء) ، واستخدام هذا البرنامج لتتبع المعاصير داخل المشابك العصبية المثيرة ، وإنتاج إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لهذه الإسقاطات تحت الخلوية ، والخلايا العصبية الأم ، وتغليف العروات قبل المشبكي. أخيرا ، يوضح البروتوكول كيفية استخدام برنامج تمزيق ثلاثي الأبعاد مجاني مفتوح المصدر (Blender) لتنعيم "الجلد" في عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد للتصور والنشر المحتمل ، مع تفصيل المزايا والمزالق المحتملة لهذه التقنية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بيانات حجم الصورة وحجم الكائن تحت الخلوي: الاعتبارات والتسجيل

احصل على حجم صورة FIB-SEM عالي الجودة لمنطقة الاهتمام التي تحتوي على الكائنات الخلوية الفرعية ذات الاهتمام.
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول أجزاء من حجم صورة FIB-SEM من القشرة البصرية الأولية للنمس المراهق المتأخر (24.2 × 16.2 × 2.4 ميكرومتر ، 4 نانومتر فوكسيل متناحية) ، وحجم FIB-SEM يمكن الوصول إليه مجانا من الحصين CA1 للفئران البالغة (10.2 × 7.7 × 5.3 ميكرومتر ؛ فوكسل متناحية) 5 نانومتر) الذي يوفره مختبر نوت (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). من الأهمية بمكان تحضير كتل الأنسجة ل FIB-SEM باستخدام بروتوكول يحافظ على تفاصيل البنية التحتية وينتج تباينا عاليا في ظل ظروف التصوير FIB-SEM²³^،²⁴. الأهم من ذلك ، يجب تصوير الأنسجة بحيث تكون دقة فوكسيل صورة FIB-SEM الناتجة <0.5 × حجم قطر أصغر بنية تحت الخلوية ذات الأهمية. على سبيل المثال ، نظرا لأن مواقع نتوء العمود الفقري في عرومات ما قبل المشبكية يمكن أن يصل قطرها إلى 30 نانومتر ، فإن حجم فوكسل <15 نانومتر سيكون مناسبا لأخذ عينات من هذه الهياكل فوق معيار Nyquist. بالإضافة إلى ذلك ، من المفيد تصوير الأنسجة بدقة متناحية(متساوية في جميع الأبعاد) (على سبيل المثال ، فوكسل 5 × 5 × 5 نانومتر) لتمكين تصور وإعادة بناء الهياكل الدقيقة التي لها أبعاد متساوية في جميع مستويات x / y / z.
قم بتنزيل وتثبيت توزيع فيجي ل ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
قم بمحاذاة حجم الصورة.
ملاحظة: بينما تنتج أنظمة FIB-SEM الحديثة وحدات تخزين صور محاذاة تقريبا، قد لا يزال تسجيل صورة إلى صورة يعاني من انحراف البكسل الفرعي.
1. في فيجي، انتقل إلى الإضافات | التسجيل واختر تسجيل Virtual Stack Slices. راجع دليل المستخدم للحصول على المساعدة (https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). ابدأ بالتسجيل الجامد ثم استخدم تقنية Affine إذا لزم الأمر.
قم بتغيير حجم الصورة.
1. افتح وحدة تخزين الصورة المحاذاة في فيجي بالنقر فوق ملف | استيراد | تسلسل الصور والانتقال إلى المجلد الذي يحتوي على الصور المحاذاة.
2. في نافذة الحوار ، انقر فوق فرز الأسماء رقميا إذا تم تسمية الصور بترتيب رقمي. انقر فوق استخدام المكدس الافتراضي للحصول على أداء أسرع في فيجي.
3. بمجرد فتح الصورة ، انقر فوق صورة | الخصائص وإدراج الحجم الفعلي لوحدات بكسل حجم الصورة بالميكرومتر في مربعات ارتفاع البكسل وعرضه وعمقه. اكتب um OR μm في كل صندوق من الصناديق الموجودة في أقصى اليمين. احفظ وحدة تخزين الصورة المحاذاة هذه كملف .tiff بالنقر فوق ملف | حفظ باسم | تيف.
  ملاحظة: إذا تم تغيير حجم الصورة، فيجب أن يشير الجزء العلوي من الصورة الآن إلى حجم الصورة بالميكرومتر (على سبيل المثال، 9.82 × 8.65 ميكرومتر).

2. تحديد العمود الفقري والمشبكي

أثناء التمرير عبر المكدس (باستخدام مفاتيح الأسهم أو عجلة الماوس) ، ارجع إلى شجرة قرار تحديد العصبية (الشكل 1) وأمثلة على الخلايا العصبية المقطعة (الشكل 2) لتحديد وتحديد الأشياء ذات الأهمية.
1. تحديد العمود الفقري المشبكي على أنها نتوءات مرتبطة بالغشاء من عصبية تصبح مغلفة بالكامل داخل عصبية قبل المشبكي أو ما بعد المشبكي.
  ملاحظة: يتطلب تحديد العمود الفقري المشبكي الإيجابي دليلا مرئيا على غزو غشاء الكائن البارز في الغشاء المقلوب لبنية ما قبل المشبكي أو ما بعد المشبكي ووجود العمود الفقري المرتبط بالغشاء مغلف بالكامل بغشاء الهيكل قبل أو ما بعد المشبكي في صورة واحدة على الأقل.
جعل مناطق الفائدة (ROIs) في فيجي
1. انقر فوق أداة مناسبة في شريط أدوات فيجي (على سبيل المثال ، الأداة البيضاوية) ثم انقر فوق الصورة واسحب عليها لتشكيل عائد استثمار. سجل عائد الاستثمار هذا في مدير عائد الاستثمار عن طريق كتابة الحرف "T."
  ملاحظة: يجب أن يظهر مدير عائد الاستثمار الآن مع إحداثيات الصورة كاسم افتراضي.
2. أعد تسمية عائد الاستثمار حسب الرغبة بالنقر فوق الزر إعادة تسمية في مدير عائد الاستثمار وكتابة الاسم المطلوب في مربع النص الذي يظهر. إعادة تسمية عائد الاستثمار بناء على المعايير الكمية (على سبيل المثال ، يمكن تسمية العروة¹² قبل المشبكية التي يتم تحليلها ولها مشابك مع عمودين الفقريين بعد المشبكي B12_s ، ق).
  ملاحظة: لإقران كل عائد استثمار ب "شريحة" صورة واحدة (بدلا من وجودها في مجموعة الصور بأكملها) ولجعل أسماء عائد الاستثمار مرئية على الصور الفردية ، انقر فوق هذه الخيارات في مدير عائد الاستثمار | المزيد | نافذة الخيارات ثم انقر فوق خانات الاختيار إظهار الكل والتسميات في الجزء السفلي من مدير عائد الاستثمار. لاحظ أن هذه الخطوة مهمة عند حفظ عائد الاستثمار داخل وحدة تخزين الصورة لأن إقران عائد الاستثمار بوحدة تخزين الصورة بالكامل بدلا من الصور الفردية يمكن أن يؤدي إلى العد المزدوج للكائنات داخل وحدة التخزين.
3. لحفظ جميع عائد الاستثمار حاليا في مدير عائد الاستثمار كملف، أولا، انقر فوق الزر إلغاء التحديد في مدير عائد الاستثمار، وانقر فوق الزر "المزيد"، ثم قم بالتمرير لأسفل إلى حفظ.
  ملاحظة: يمكن الآن فتح ملف .zip المحفوظ هذا في فيجي لإعادة تحميل كل عائد الاستثمار هذا في مدير عائد الاستثمار.

3. تحديد مجال الاهتمام ونقل حجم الصورة إلى برنامج تحليل 3D

حدد ما إذا كان من المرغوب فيه نقل وحدة تخزين الصورة بالكامل إلى برنامج إعادة البناء والتحليل ثلاثي الأبعاد، أو إذا كان يجب إنشاء مكدس فرعي أصغر (انظر 3.3.2) لتحليل عدد أقل من الصور و/أو منطقة الاهتمام من المكدس الأصلي.
قم بإجراء دراسة "تجريبية" صغيرة على مساحة صغيرة نسبيا تحتوي على الكائنات (الكائنات) ذات الأهمية لتقدير حجم التأثير وعدد الكائنات ذات الأهمية المطلوبة للحصول على القوة المطلوبة للمقارنات الإحصائية. استخدم تقديرا متحفظا لحجم حجم الصورة المطلوب لأخذ عينات من الكائنات ذات الأهمية إذا كانت هذه الكائنات الخلوية الفرعية موزعة بشكل غير موحد داخل وحدة تخزين الصورة.
لاستخدام جزء من حجم الصورة للتحليل ثلاثي الأبعاد، قم أولا بتكرار حجم الصورة بالنقر فوق صورة | مكرر.
1. لاستخدام جزء تم اقتصاصه من الصورة للتحليل ، اختر أداة المستطيل من شريط أدوات فيجي وارسم منطقة الاهتمام المطلوبة ؛ إذا لم يكن هذا مرغوبا فيه ، فتابع إلى الخطوة التالية.
2. الانتقال إلى الصورة | مكدسات | أدوات | اصنع Substack. اكتب نطاق الصور المراد تضمينها داخل المكدس الفرعي (على سبيل المثال، قم بتضمين الصور من 1 إلى 500 عن طريق كتابة 1 - 500) في مربع النص.
3. راجع اعتبارات أخذ العينات أعلاه (ملاحظة بعد 1.1) لتحديد دقة z المطلوبة بناء على حجم الكائنات (الكائنات) محل الاهتمام. على سبيل المثال ، إذا كان حجم الصورة يحتوي على عمق فوكسل يبلغ 5 نانومتر ، فمن الممكن أخذ عينة من الكائن محل الاهتمام على فترات 10 نانومتر في البعد z بحيث تحتفظ فيجي بكل صورة أخرى في المكدس الفرعي. للقيام بذلك ، اكتب رقم الصورة n بعد النطاق (على سبيل المثال ، لتضمين كل صورة أخرى فقط في نطاق صورة من 1 إلى 500 ، اكتب 1 - 500 - 2).
  ملاحظة: سيكون لكل حزمة برامج تحليل ثلاثي الأبعاد (انظر الجدول 1) متطلبات استيراد الملفات الخاصة بها. يركز هذا البروتوكول على استيراد وحدات تخزين الصور المحفوظة كملفات .tiff إلى برنامج وحدة تخزين الصورة ، إعادة البناء.

إعادة بناء 4. 3D وتحليل الهياكل الفرعية الخلوية الرقيقة في إعادة البناء

ملاحظة: من المفيد للغاية استخدام ماوس مزود بعجلة أثناء استخدام إعادة البناء. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم إجراء معظم أو كل التتبعات يدويا ، فإن استخدام القلم لرسم الخطوط العريضة على جهاز كمبيوتر مزود بشاشة تعمل باللمس يمكن أن يزيد بشكل كبير من كفاءة التتبع.

قم بتنزيل Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) وتثبيته للاستخدام على جهاز كمبيوتر يعمل بنظام Microsoft Windows في بيئة أصلية أو افتراضية.
ابدأ إعادة بناء جديدة عن طريق إنشاء مجلد جديد لملفات إعادة الإعمار ، بالنقر فوق السلسلة | جديد، وحفظ إعادة البناء هذه (ملف .ser) باسم الملف المطلوب في المجلد الذي تم إنشاؤه للتو.
قم باستيراد وحدة تخزين الصورة .tiff المحفوظة إلى إعادة الإنشاء.
1. الانتقال إلى السلسلة | استيراد | الصور، انقر فوق تحديد في نافذة استيراد الصور ، وحدد موقع ملف وحدة تخزين الصورة. في نافذة استيراد الصور ، ابحث عن ملفات وحدة تخزين الصورة التي تظهر كسطر منفصل لكل صورة في وحدة التخزين.
2. هام: اكتب حجم البكسل الصحيح في مربع النص Pixel Size ليتوافق مع حجم x/y pixel (بالميكرومتر) لحجم الصورة. بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقر فوق الزر "استيراد " في نافذة استيراد الصور .
  ملاحظة: بمجرد استيراد الصور، يجب أن تكون هناك صورة في منتصف نافذة إعادة البناء ، ويجب أن تكون قائمة استيراد الصور فارغة.
3. إذا كانت هناك صورة في منتصف نافذة إعادة إنشاء وكانت قائمة استيراد الصور فارغة ، فانقر فوق إنهاء في نافذة استيراد الصور .
4. اضبط سمك القسم (أي ارتفاع فوكسل أو البعد z) بالنقر فوق القسم | سرد الأقسام ، وتمييز جميع الأقسام المدرجة ، ثم النقر فوق تعديل | السماكة في قائمة قائمة الأقسام وكتابة سمك المقطع (بالميكرومتر) في مربع النص (على سبيل المثال ، 0.005 لمقطع بسمك 5 نانومتر).
  ملاحظة: تذكر أنه في حالة العمل مع مكدس فرعي من وحدة تخزين صورة أصلية أكبر تتضمن فقط كل قسم n (انظر الخطوة 3.3.3) ، فمن الضروري حساب هذه الأقسام "المفقودة" في سمك القسم الإجمالي. على سبيل المثال ، إذا كان سمك قسم حجم الصورة الأصلي (المعروف أيضا باسم ارتفاع فوكسيل) 0.005 ميكرومتر ، ويتضمن المكدس الفرعي كل قسم ثالث فقط (على سبيل المثال ، 1-500-3) ، فإن سمك القسم لهذا المكدس الفرعي هو 0.015 ميكرومتر (أي 0.005 ميكرومتر × 3 أقسام).
اصنع آثارا للأشياء ذات الأهمية.
1. انتقل إلى المسلسل | الخيارات | علامة التبويب الأسماء/الألوان لإعطاء الكائن الجديد اسما. اختر لونا للمخطط التفصيلي والتعبئة الداخلية لآثار الكائن، ثم انقر فوق موافق.
  ملاحظة: ستحاول إعادة البناء توصيل جميع التتبعات بنفس اسم كائن واحد. ارجع إلى دليل إعادة البناء لاصطلاحات تسمية التتبع (على سبيل المثال ، لا تدرج مسافات في الأسماء). تتبع الألوان هي فقط لتصور الآثار. يمكن تغيير لون إعادة بناء هذا الكائن ثلاثية الأبعاد بسهولة لاحقا.
2. على شريط الأدوات، حدد أداة الرسم اليدوي التي تشبه قلم رصاص. اضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر واسحب الماوس لتتبع غشاء الكائن. اترك زر الماوس الأيسر لإكمال التتبع تلقائيا. انقر فوق Page Up / Page Down أو استخدم عجلة الماوس للتقدم إلى القسم البصري التالي في حجم الصورة وقم بعمل تتبعات تدريجية حتى يكتمل الهيكل.
تتبع المغزل المشبكي
ملاحظة: تظهر المغزلات المدمجة داخل العروات قبل المشبكية كهياكل شفافة مرتبطة بالغشاء ، وأحيانا مع مادة معتمة تشبه الأكتين و / أو طيات تشبه الغشاء في داخلها.
1. تقدم من خلال حجم الصورة وحدد موقع غزو العمود الفقري في العروة قبل المشبكية ، مع الحرص على التمييز بين العمود الفقري والشبكة الإندوبلازمية ، والفجوات ، والجسيمات الداخلية ، والبلعمة الذاتية ، والعضيات الأخرى تحت الخلوية.
  ملاحظة: على عكس العضيات المرتبطة بالغشاء ، تأكد من أن العمود الفقري المشبكي يصدر دائما من (أي الغشاء المقلوب) من العصبية / الخلايا الدبقية ويتم استقبالها بواسطة (أي الغشاء المقلوب) بنية ما قبل أو بعد المشبكي. يجب أن يحدث هذا الدليل المرئي على غزو العمود الفقري في صور ≥2 ، ويجب أن يكون العمود الفقري المغلف بالكامل المرتبط بالغشاء موجودا داخل بنية ما قبل أو بعد المشبكي في صورة ≥1. قد تكون المغزيات الصغيرة مغلفة بالكلاثرين. للتمييز بين أحداث غزو العمود الفقري من الالتقام الخلوي المطلي بالكلاثرين إلى العصبة قبل أو بعد المشبكي ، تأكد من أن التحديد الإيجابي للسبيكات المغلفة بالكلاثرين يتطلب تأكيدا بصريا لغشاء الإيفادينغ المتزامن من الكائن الأصلي للشوكة التي تسقط في الغشاء المقلوب لبنية ما قبل أو بعد المشبكي داخل نفس الصورة.
2. تقدم من خلال حجم الصورة لتحديد موقع إسقاط / أصل العمود الفقري من العصبية / الخلايا الدبقية الأصلية ؛ راجع الشكل 1 والشكل 2 للمساعدة في تحديد هذه الهياكل الأصلية.
3. ابدأ تتبع العمود الفقري في موقع نتوء الغشاء في بنية الاستقبال (على سبيل المثال ، العروة قبل المشبكي) واستمر في رسم العمود الفقري طالما أنه يظهر كهيكل مرتبط بالغشاء داخل العصبية المغلفة قبل أو بعد المشبكي.
4. استمر في الضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر (أو استمر في الرسم على طول غشاء العمود الفقري باستخدام قلم إذا كنت تستخدم جهاز كمبيوتر بشاشة تعمل باللمس) أثناء تتبع غشاء العمود الفقري باستخدام مؤشر الماوس.
5. عند الوصول إلى النقطة التي بدأ فيها التتبع ، اترك زر الماوس الأيسر.
  ملاحظة: سيؤدي ترك زر الماوس الأيسر في وقت مبكر جدا إلى إكمال التتبع تلقائيا ، غالبا بنتائج غير مرغوب فيها. إذا حدث هذا ، فما عليك سوى الضغط على حذف أثناء تمييز هذا التتبع في قائمة التتبع.
6. كرر الخطوات 4.5.2-4.5.5 لكل قسم يظهر فيه العمود الفقري.
  ملاحظة: تذكر تتبع العمود الفقري كهيكل مغلف مرتبط بالغشاء داخل العروة عند الاقتضاء. نظرا لأن إعادة البناء لا تسمح بالطرح الآلي للهياكل تحت الخلوية المغلفة (على سبيل المثال ، العمود الفقري ، والعضيات تحت الخلوية) من حجم هيكل التغليف ، يمكن إجراء ذلك بعد التخصيص (على سبيل المثال ، ببساطة عن طريق طرح حجم العمود الفقري من الحجم الكلي للعروة قبل المشبكي).
إعادة بناء الكائنات في 3D في إعادة البناء
1. الانتقال إلى السلسلة | الخيارات | علامة التبويب ثلاثية الأبعاد، وتأكد من النقر فوق زر الاختيار Traces .
2. افتح قائمة الكائنات بالنقر فوق كائنات | قائمة الكائنات.
3. بمجرد تحميل أسماء الكائنات التي تم تتبعها في النافذة ، انقر نقرا مزدوجا فوق اسم الكائن(الكائنات) في قائمة الكائنات لعرضها في 3D. انتظر حتى تظهر نافذة المشهد ثلاثي الأبعاد .
4. تأكد من صحة بداية التتبعات ونهايتها وعددها في قائمة الكائنات لكل كائن، بحيث يكون Count = End - Start. إذا كان Count ≠ End - Start لكائن ما ، فربما تم حذف أثر واحد أو أكثر من هذا الكائن عن طريق الخطأ.
5. قم بتدوير الآثار ثلاثية الأبعاد للكائن(الكائنات) عن طريق الضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر وتحريك الماوس و / أو الضغط باستمرار على زر الماوس الأيمن وتحريك الماوس للأمام والخلف للتكبير والتصغير. تأكد من محاذاة آثار الكائن بشكل مناسب وأنه يبدو أن هناك انتقالا سلسا بين كل تتبع متتالي.
6. إذا لزم الأمر، قم بتتبع التتبعات الفردية لإزالة الأخطاء التي تؤدي إلى حواف حادة و/أو انتقالات بين التبعات.
7. ضع جلدا شبكيا رباعي السطوح على الكائن بالانتقال إلى السلسلة | كائن | علامة التبويب ثلاثية الأبعاد والنقر على زر الاختيار السطحي Boissonnat .
8. في نافذة المشهد ثلاثي الأبعاد ، انقر فوق مشهد | امسح ، ثم انقر نقرا مزدوجا فوق اسم الكائن المطلوب في قائمة الكائنات.
9. قم بتدوير الكائن(الكائنات) لضمان انتقالات سلسة بين التتبعات وإعادة رسم التتبعات إذا لزم الأمر.
10. لتغيير ألوان الكائن والشفافية ، انقر فوق اسم الكائن في قائمة الكائنات ، ثم انقر فوق مشهد | اللون / الشفافية ... في قائمة قائمة الكائنات . انقر نقرا مزدوجا فوق اسم الكائن في قائمة الكائنات لعرض هذا التغيير في نافذة المشهد ثلاثي الأبعاد .
  ملاحظة: يمكن تغيير لون الكائن والشفافية والتنعيم بدرجة أكبر من التحكم والخصوصية باستخدام Blender (انظر 5.4-5.6).
التحليل الكمي للكائنات ثلاثية الأبعاد
1. الانتقال إلى السلسلة | الخيارات | علامة التبويب القوائم وانقر فوق جميع القياسات المطلوبة في قسمي قائمة الكائنات وقائمة التتبع في هذه النافذة.
2. تصدير قياسات الكائنات عن طريق فتح قائمة الكائنات (كائن | قائمة الكائنات ...) ثم النقر فوق قائمة | حفظ.
3. احفظ قياسات الكائن كما هو موضح في قائمة الكائنات كملف محدد بفواصل (.csv).
4. قم باستيراد ملف .csv إلى برنامج تحليل البيانات المفضل. للاستيراد إلى جدول بيانات (على سبيل المثال ، Microsoft Excel) ، ما عليك سوى النقر نقرا مزدوجا فوق الملف ، أو فتح مصنف فارغ جديد ، والنقر فوق ملف | استيراد | خيار ملف CSV ، واتبع التعليمات.
5. لقياس المسافات بين الكائنات في 3D (على سبيل المثال ، لقياس مسافة الإسقاط لعمود عصاري متشابك داخل عروة ما قبل المشبكي) ، استخدم وظيفة Z-trace في إعادة البناء.
6. أولا، قم بإعطاء التتبع اسما جديدا بالانتقال إلى السلسلة | الخيارات | علامة التبويب Names/Colors وكتابة اسم لتتبع Z.
7. بعد ذلك ، انقر فوق أداة Z-trace في شريط الأدوات.
8. لرسم Z-trace لمسافة الإسقاط لعمود الدوران المشبكي ، انقر فوق بداية العمود الفقري المشبكي بالنقر فوق زر الماوس الأيسر ، ثم اضغط على أزرار Page Up أو Page Down للتقدم عبر حجم الصورة أثناء النقر فوق النقاط المتتالية على طول غشاء العمود الفقري المشبكي داخل كل قسم.
9. أكمل تتبع Z هذا بالنقر فوق زر الماوس الأيمن.
10. تصدير قياسات Z-trace بالنقر فوق تتبع | قائمة الآثار ... لإظهار قائمة التتبع ثم النقر فوق قائمة | حفظ لحفظ قياسات قائمة التتبع كملف .csv.
إضافة مكعب مقياس
1. انتقل إلى إحدى الصور الأولى أو الأخيرة في المكدس
2. انتقل إلى المسلسل | الخيارات | علامة التبويب Names/Colors واكتب اسما لمكعب المقياس.
3. في شريط الأدوات، اختر أداة رسم المستطيل وارسم مربعا صغيرا (حجم غير مهم) مجاورا للكائنات ولكن دون حجبها. انتقل إلى المسلسل | الخيارات | علامة التبويب ثلاثية الأبعاد ، انقر فوق خيار زر الاختيار Box في منطقة الإنشاء ، وحدد حجم مكعب المقياس (بالميكرومتر) عن طريق كتابة أبعاده في مربعات A: ، B: ، C: في منطقة الحجم (على سبيل المثال ، اكتب 0.5 ل A و B و C لإنشاء مكعب مقياس 0.5 ميكرومتر / جانبي).
  ملاحظة: قبل محاولة إعادة بناء مكعب المقياس في 3D ، تأكد من إعادة بناء الكائنات ثلاثية الأبعاد المطلوبة بالفعل في المشهد ثلاثي الأبعاد باستخدام خيار سطح Traces أو Boissonnat . تذكر تغيير خيار الإنشاء مرة أخرى إلى سطح Boissonnat وأحجام A و B و C مرة أخرى إلى -1 بعد إعادة بناء مكعب المقياس (أي بعد الخطوة 4.8.5).
4. افتح قائمة الكائنات وانقر نقرا مزدوجا فوق اسم مكعب المقياس ؛ انتظر حتى يظهر مكعب المقياس في نافذة المشهد ثلاثي الأبعاد .
5. لتحريك مكعب المقياس بالنسبة إلى الكائنات الأخرى، انتقل إلى السلسلة | الخيارات | علامة التبويب ثلاثية الأبعاد واكتب عدد الميكرومتر المطلوب لنقل مكعب المقياس إلى مربعات X و / أو Y و / أو Z . انقر فوق موافق لإغلاق النافذة ، ثم انقر نقرا مزدوجا فوق اسم مكعب المقياس في قائمة الكائنات.
  ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن القيام بذلك باستخدام Blender (انظر أدناه).

5. استيراد وإعادة تلوين وتنعيم وإضافة الشفافية إلى عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد في الخلاط

ملاحظة: للحصول على مساعدة مفصلة في استخدام Blender ، يرجى الرجوع إلى دليل Blender و / أو مقاطع الفيديو التي لا تعد ولا تحصى حول استخدام كل وظيفة Blender (ما عليك سوى إجراء بحث على الويب عن Blender AND Desired Function). ما يلي هو كتاب تمهيدي قصير حول كيفية إعادة تلوين وتنعيم وإضافة الشفافية إلى عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد.

قم بتنزيل وتثبيت أحدث إصدار من Blender ، مجموعة البرامج ثلاثية الأبعاد المجانية مفتوحة المصدر (www.blender.org).
في إعادة البناء، احفظ عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد عن طريق إحضار الكائن(الكائنات) المطلوب في نافذة المشهد ثلاثي الأبعاد ثم النقر فوق المشهد | تصدير باسم | VRML 2.0.
في Blender، انتقل إلى ملف | استيراد | X3D قابلة للتوسيع ثلاثية الأبعاد (.x3d / .wrl). انقر فوق ملف VRML 2.0 الذي تم حفظه من إعادة إنشاء ثم انقر فوق الزر Import X3D / VRML2 .
أعد تلوين عمليات إعادة البناء.
1. في نافذة Scene Collection ، في الزاوية اليمنى العليا ، انقر لإلغاء تحديد / إلغاء تحديد رمز العين لكائن المكعب الافتراضي ، وانقر فوق أسماء الكائنات الفردية لتمييز كل كائن في المشهد. أعد تسمية هذه الكائنات حسب الاقتضاء.
2. انقر فوق اسم الكائن الأول لإعادة تلوينه في نافذة مجموعة المشهد .
3. انقر فوق السياق الدائري. الرمز Material في الجزء السفلي من شريط الأيمن من الأيقونات، ثم انقر فوق إضافة مادة. يجب أن تظهر قائمة بالخيارات أدناه. بعد ذلك ، انقر فوق الشريط الموجود بجوار خيار Base Color واختر الإضاءة وتدرج اللون المطلوبين للكائن.
4. لتغيير المظهر المعدني واللمعان والصفات العاكسة للكائن ، اضبط خيارات المعدن ، والمنظار ، والخشونة ، واللمعان لإنتاج التأثير المطلوب.
  ملاحظة: لكي تظهر بعض الخيارات في المشهد (على سبيل المثال، الشفافية واللمعان)، قد يكون من الضروري أن تكون في إعداد Viewport Shading: Look Dev أو Viewport Shading: Rendered viewport. للتغيير إلى أي من إعدادات إطار العرض ، مرر مؤشر الماوس فوق أيقونات الكرة الأرضية في الجزء العلوي الأيمن وانقر فوق إعداد إطار العرض المطلوب.
5. لتغيير زاوية الإضاءة ، انقر فوق كائن الضوء في نافذة مجموعة المشاهد ، وانقر فوق إظهار Gizmo في أعلى اليمين ، ثم اسحب الضوء حول المشهد لتحقيق تأثير الإضاءة المطلوب. قم بتغيير شدة الضوء في نافذة بيانات الكائن التي تظهر أسفل نافذة مجموعة المشاهد عند تحديد الكائن الخفيف .
6. لتدوير الكائنات في محاور محددة بشكل منفصل ، انقر فوق أسماء الكائنات في نافذة Scene Collection ، واضغط على مفتاح R ، ثم انقر فوق حرف محور الدوران (مفتاح x أو y أو z ) ، وحرك الماوس لإنتاج الدوران المطلوب. للاستيلاء على الكائنات ونقلها، حددها في نافذة مجموعة المشاهد ، واضغط على المفتاح G ، ثم استخدم الماوس لتحريك الكائنات حول المشهد.
إعادة تشكيل (أي ناعم) عمليات إعادة البناء.
1. انقر فوق اسم الكائن محل الاهتمام من نافذة Scene Collection ثم استخدم gimball وعجلة الماوس لتوسيط الكائن وتكبيره.
2. انقر فوق رمز مفتاح ربط Context.Modifiers على شريط الأيمن من الأيقونات ، وانقر فوق إضافة معدل ، ثم Remesh (ضمن عنوان إنشاء ). استخدم القائمة المنسدلة لتحديد Smooth ، وانقر فوق Smooth Shading زر ، وقم بتغيير Octree Depth and Scale لتحقيق النعومة المطلوبة.
  ملاحظة: من المفيد أن تكون في نافذة Viewport Shading: Wireframe (خيار رمز الكرة الأرضية في الجزء العلوي الأيمن) أثناء إعادة الربط لعرض النتائج مباشرة. سيؤدي إعادة الربط إلى إنشاء شبكات رباعية السطوح مختلفة الأحجام على الكائن. أثناء تنعيم الكائن لإزالة القطع الأثرية المقطوعة أو التتبع، احرص على الاحتفاظ بشكله الأصلي وخطوطه. ابدأ بعمق Octree = 7 ومقياس = 0.95 ، ثم قلل هذه الأرقام ببطء إذا لزم الأمر. انتبه بشكل خاص للأجسام الصغيرة والرقيقة ، مثل المغزلات وكثافات ما بعد المشبك ، حيث يقلل الحجم الصغير لهذه الكائنات من نطاق التنعيم الذي يمكن القيام به دون تغيير شكلها الأصلي.
إضافة شفافية إلى الكائنات.
ملاحظة: يعد جعل الكائنات شفافة أمرا مهما عندما يكون من المستحسن إظهار العلاقة ثلاثية الأبعاد لكائن واحد (على سبيل المثال ، العمود الفقري ، الحويصلات قبل المشبكية ، الميتوكوندريا ، الجسيمات الداخلية) الموجودة داخل كائن آخر (على سبيل المثال ، عروة ما قبل المشبكي).
1. انقر فوق اسم الكائن المطلوب في نافذة مجموعة المشهد . قم بالتمرير إلى أسفل السياق . نافذة Material (أيقونة أسفل اليمين في القائمة اليمنى) ، افتح قسم الإعدادات ، واستخدم القائمة المنسدلة لتغيير وضع المزج إلى Alpha Blend. بعد ذلك، افتح قسم Surface ، وقم بالتمرير لأعلى إلى Alpha، وقم بتغيير الرقم إلى قيمة أقل من واحد (1 = معتم بالكامل، 0 = شفاف بالكامل).
تصدير لقطات من عمليات إعادة البناء ثلاثية الأبعاد.
1. بمجرد الحصول على التلوين والتنعيم والإضاءة المثلى لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد ، احفظ الصورة داخل المشهد بالنقر فوق القائمة بعنوان النافذة ، وتحديد حفظ لقطة الشاشة.
2. في حفظ لقطة الشاشة خيارات في أسفل اليسار ، اختر نوع الملف وتنسيق اللون والضغط المطلوب.
3. اكتب اسم لقطة الشاشة الجديدة في مربع نص اسم الملف أعلاه ، ثم احفظ لقطة الشاشة في الموقع المطلوب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحديد النسبة المئوية للسبينول المشبكي داخل مجموعة العروة قبل المشبكية المثيرة في القشرة البصرية الأولية للنمس
على الرغم من أن النتوءات الشبيهة بالعمود الفقري من الخلايا العصبية إلى العروات قبل المشبكية المثيرة قد لوحظت لعقود¹⁹^،²⁶ ، إلا أن أهميتها المحتملة للوظيفة المشبكية ظلت غامضة. تم تصميم هذه التجارب لتحديد نسبة العروات المثيرة قبل المشبكي التي تحتوي على شوط أثناء تطور ما بعد الولادة في القشرة البصرية الأولية للنمس (V1) للتأكد من الأهمية ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن ينتج خط أنابيب تحليل حجم الصورة FIB-SEM عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد موثوقة وقياسات كمية للهياكل الخلوية الفرعية الرقيقة. في حين أن التقنيات شبه الآلية الحالية التي تستخدم الشبكة العصبية العميقة وخوارزميات التجزئة يمكن أن تزيد من السرعة والكفاءة في إعادة بناء الهياكل الخلوية التي تمتلك تباينا غشائيا عاليا نسبيا داخل أحجام كبيرة للصور³³ ، فإن العديد من الهياكل الخلوية الفرعية (على سبيل المثال ، العمود الفقري ، الشبكة الإندوبلازمية الملساء ، الجسيمات الد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل صندوق جسر جامعة واشنطن وصندوق RRF التجريبي بجامعة واشنطن تاكوما. شكرا جزيلا للدكتورة كلوديا لوبيز والدكتورة جيسيكا ريسترر من MMC في جامعة أوريغون للصحة والعلوم على الدعم الفني FIB-SEM ، والدكتور جراهام نوت لاستخدام حجم صورة CA1 FIB-SEM ، وطلاب UW Tacoma في دورة إعادة بناء الخلايا العصبية (TBIOMD 495) لصبرهم وتميزهم في العمل مع هذا البروتوكول.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Catalog Number	Comments
فيجي (ImageJ)		https://imagej.net/software/fiji/downloads
إعادة بناء		https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
مؤسسة	خلاط الخلاط	https:/www.blender.org

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Holler, S., Kostinger, G., Martin, K. A. C., Schuhknecht, G. F. P., Stratford, K. J. Structure and function of a neocortical synapse. Nature. 591 (7848), 111-116 (2021).
Xu, C. S., Pang, S., Hayworth, K. J., Hess, H. F. Transforming FIB-SEM. Volume microscopy: Multiscale imaging with photons, electrons, and ions. Wacker, I., Hummel, E., Burgold, S., Schroder, R. , Springer. US. 221-243 (2020).
Merchan-Perez, A., Rodriguez, J. R., Alonso-Nanclares, L., Schertel, A., Defelipe, J. Counting synapses using FIB/SEM microscopy: a true revolution for ultrastructural volume reconstruction. Frontiers in Neuroanatomy. 3, 18(2009).
Wu, Y., et al. Contacts between the endoplasmic reticulum and other membranes in neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4859-4867 (2017).
Weigel, A. V., et al. ER-to-Golgi protein delivery through an interwoven, tubular network extending from ER. Cell. 184 (9), 2412-2429 (2021).
Rodriguez-Moreno, J., et al. Quantitative 3D ultrastructure of thalamocortical synapses from the "lemniscal" ventral posteromedial nucleus in mouse barrel cortex. Cerebral Cortex. 28 (9), 3159-3175 (2018).
Khanmohammadi, M., Waagepetersen, R. P., Sporring, J. Analysis of shape and spatial interaction of synaptic vesicles using data from focused ion beam scanning electron microscopy (FIB-SEM). Frontiers in Neuroanatomy. 9, 116(2015).
Cali, C., et al. The effects of aging on neuropil structure in mouse somatosensory cortex-A 3D electron microscopy analysis of layer 1. PLoS One. 13 (7), 0198131(2018).
Vogelstein, J. T., et al. A community-developed open-source computational ecosystem for big neuro data. Nature Methods. 15 (11), 846-847 (2018).
Morales, J., et al. Espina: A tool for the automated segmentation and counting of synapses in large stacks of electron microscopy images. Frontiers in Neuroanatomy. 5, 18(2011).
Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
Jorstad, A., Blanc, J., Knott, G. NeuroMorph: a software toolset for 3D analysis of neurite morphology and connectivity. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 59(2018).
Fiala, J. C. Reconstruct: a free editor for serial section microscopy. Journal of Microscopy. 218, Pt 1 52-61 (2005).
Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011(2012).
Petralia, R. S., Wang, Y. X., Mattson, M. P., Yao, P. J. Invaginating structures in mammalian synapses. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 4(2018).
Petralia, R. S., Wang, Y. X., Mattson, M. P., Yao, P. J. Structure, distribution, and function of neuronal/synaptic spinules and related invaginating projections. Neuromolecular Medicine. 17 (3), 211-240 (2015).
Pappas, G., Purpura, D. Fine structure of dendrites in the superficial neocortical neuropil. Experimental Neurology. 4, 507-530 (1961).
Case, N. M., Gray, E. G., Young, J. Z. Ultrastructure and synaptic relations in the optic lobe of the brain of Eledone and Octopus. Journal of Ultrastructure Research. 39 (1), 115-123 (1972).
Bailey, C. H., Thompson, E. B., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. Ultrastructure of the synapses of sensory neurons that mediate the gill-withdrawal reflex in Aplysia. Journal of Neurocytology. 8 (4), 415-444 (1979).
Wagner, H., Djamgoz, M. B. A. Spinules: a case for retinal synaptic plasticity. Trends in Neuroscience. 16 (6), 201-206 (1993).
Campbell, C., Lindhartsen, S., Knyaz, A., Erisir, A., Nahmani, M. Cortical presynaptic boutons progressively engulf spinules as they mature. eNeuro. 7 (5), (2020).
Spacek, J., Harris, K. M. Trans-endocytosis via spinules in adult rat hippocampus. Journal of Neuroscience. 24 (17), 4233-4241 (2004).
Knott, G., Rosset, S., Cantoni, M. Focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (53), e2588(2011).
Steyer, A. M., Schertel, A., Nardis, C., Möbius, W. FIB-SEM of mouse nervous tissue: Fast and slow sample preparation. Methods in Cellular Biology. 152, 1-21 (2019).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Westfall, J. A. Ultrastructure of synapses in a primitive coelenterate. Journal of ultrastructure research. 32 (3), 237-246 (1970).
Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendrritic synapses of the cerebral cortex: An electron microscope study. Journal of Anatomy. 93 (4), 420-433 (1959).
Jones, D. G., Calverley, R. K. Perforated and non-perforated synapses in rat neocortex: three-dimensional reconstructions. Brain Research. 556, 247-258 (1991).
Geinisman, Y., et al. Structural synaptic correlate of long-term potentiation: Formation of axospinous synapses with multiple, completely partitioned transmission zones. Hippocampus. 3 (4), 435-445 (1993).
Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A. -G., Buchner, A. G*Power 3: A flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods. 39, 175-191 (2007).
Chen, J., Kanai, Y., Cowan, N. J., Hirokawa, N. Projection domains of MAP2 and tau determine spacings between microtublules in dendrites and axons. Nature. 360, 674-677 (1992).
Benavides-Piccione, R., et al. Differential structure of hippocampal CA1 pyramidal neurons in the human and mouse. Cerebral Cortex. 30 (2), 730-752 (2020).
Kornfeld, J., Denk, W. Progress and remaining challenges in high-throughput volume electron microscopy. Current Opinion Neurobiology. 50, 261-267 (2018).
Liu, J., et al. Automatic reconstruction of mitochondria and endoplasmic reticulum in electron microscopy volumes by deep learning. Frontiers in Neuroscience. 14, 599(2020).
Lucchi, A., Smith, K., Achanta, R., Knott, G., Fua, P. Supervoxel-based segmentation of mitochondria in EM image stacks with learned shape features. IEEE Transactions on Medical Imaging. 31 (2), 474-486 (2012).
Chklovskii, D. B., Vitaladevuni, S., Scheffer, L. K. Semi-automated reconstruction of neural circuits using electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 20 (5), 667-675 (2010).
Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
Takahashi-Nakazato, A., Parajuli, L. K., Iwasaki, H., Tanaka, S., Okabe, S. Ultrastructural observation of glutamergic synapses by focused ion beam scanning electron microscopy (FIB-SEM). Glutamate Receptors: Methods and Protocols. Burger, C., Velardo, M. J. , Humana Press. 17-27 (2019).
Korogod, N., Petersen, C. C., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. Elife. 4, 05793(2015).
Soares Medeiros, L. C., De Souza, W., Jiao, C., Barrabin, H., Miranda, K. Visualizing the 3D architecture of multiple erythrocytes infected with Plasmodium at nanoscale by focused ion beam-scanning electron microscopy. PLoS One. 7 (3), 33445(2012).
Cretoiu, D., Hummel, E., Zimmermann, H., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M. Human cardiac telocytes: 3D imaging by FIB-SEM tomography. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2157-2164 (2014).
Hasegawa, T., et al. Three-dimensional ultrastructure of osteocytes assessed by focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM). Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 423-432 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

إعادة بناء وتحليل ثلاثي الأبعاد للهياكل العصبية الرقيقة تحت الخلوية باستخدام بيانات الفحص المجهري الإلكتروني لشعاع الأيونات المركز

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles