أساليب معدلة لتحميل عالية الإنتاجية ألواح استخراج الحمض النووي يقلل من احتمال التلوث
June 3rd, 2020
يمكن أن تكون الطرق الحالية لتحميل 96-صحون البئر لاستخراج الحمض النووي عرضة للتلوث. نحن تفاصيل طريقة جديدة لتحميل 96-آبار لوحات أن يقلل من خطر التلوث المتبادل بين الآبار. ستساعد طريقتنا الباحثين الآخرين على الاستفادة من كفاءة تقنيات استخراج الحمض النووي عالية الإنتاجية وتقليل خطر التلوث.
يوفر هذا البروتوكول تقنية لزيادة كفاءة 96-جيدا تحميل لوحة استخراج الحمض النووي dna بينما في الوقت نفسه خفض خطر التلوث عبر العينة. هذه التقنية يقلل من فرص التلوث خلال الخطوة الأولى الحرجة من استخراج الحمض النووي من خلال إضافة عينات فردية إلى كل بئر في لوحة 96 جيدا. ويمكن تطبيق هذه المنهجية على أي من المجالات المتنوعة للبحوث الميكروبيوم.
قبل البدء في تجربة، ضباب أعلى مقاعد البدلاء مع 70٪الإيثانول. بعد المسح، والسماح لمقاعد البدلاء الهواء الجافة قبل رش مقاعد البدلاء مع 10٪التبييض. بعد المسح وتجفيف الهواء، تراجع المقص الجراحي المجهري، بصق، ومنحني في 95٪ الإيثانول وفضح الأدوات لهب.
ثم تراجع كل أداة في 10٪ التبييض والسماح للأدوات لتجف الهواء. قبل أخذ العينات الفرعية، يعقم الإيثانول القفازات ويتجانس تمامًا عينات التربة. قم بعد ذلك بتعيين معرف عينة مع موقع جيد لكل أنبوب.
ملء 95 وصفت اثنين من أنابيب أجهزة الطرد المركزي ملليلتر مع عينة واحدة لكل أنبوب، حتى كل أنبوب هو نصف كامل تقريبا. ينبغي استخدام الأنبوب 96 كفراغ الاستخراج. ضع أنابيب العينة الفرعية على الجليد، وتسمية 96 معقم 200 ميكرولتر أنابيب PCR مسطحة مسطحة وفقا لتسميات جيدا لطبقة 96-جيدا، ثم ضع التسمية 200 أنابيب ميكرولتر في النظام في رف 96 جيدا.
لإعداد لوحة 96-well للتجربة، وإزالة الغطاء من لوحة ووضع الغطاء في كيس من البلاستيك العقيمة. ختم كيس لمنع التلوث وتغطية لوحة مع قطعة قبل قطع من ختم فيلم. ثم استخدام الأسطوانة المطاطية لتمسك بحزم الختم إلى لوحة وتخزين لوحة في أربع درجات مئوية.
لنقل العينات الفرعية إلى اللوحة، ضع 24 من أنابيب العينة الفرعية المليلتر في كتلة ثلج للتخزين البارد، واستخدم اسم العينة وورقة موقع البئر لتحديد الأنابيب المناسبة المناسبة البالغة 200 ميكرولتر مسطحة. دوامة العينات الفرعية واحدة في كل مرة، لمدة خمس ثوان لكل عينة لضمان التجانس وتحميل ما يقرب من 200 ميكرولترات من كل عينة في أنبوب PCR المناسب. عندما تم تحميل جميع العينات 24، استخدم مسح الورق المنقوع المبيض لتنظيف خارج أنبوب PCR واحد، وعكس والاستفادة من أنبوب على مقاعد البدلاء لنقل العينة إلى أعلى الأنبوب.
باستخدام الشعلة معقم ومبيض مقص مقطع الجزء السفلي من أنبوب PCR لإنشاء فتحة للعينة، وتمرير أنبوب على لوحة مع نهاية قطع التي تواجه حتى تم التوصل إلى البئر المناسبة. إمالة لوحة قليلا، لتسهيل ثقب فيلم ختم قبل قطع، ومع أنبوب مباشرة فوق البئر الصحيح، بسرعة ولكن عكس بعناية لوحة بحيث تلميح قطع يناسب في البئر. استخدام أداة تعقيم للاستفادة من الجزء العلوي من الأنبوب حتى كل من التربة قد سقطت من أنبوب في البئر.
وترك الأنبوب في البئر مع الرصاص مغلقة. عندما تم تحميل جميع العينات بنفس الطريقة، وإزالة واحدة 200 ميكرولتر مسطحة توج أنبوب PCR وإضافة 750 ميكرولترات من محلول حبة للعينة جيدا. وضع 200 ميكرولتر مسطحة توج PCR أنبوب مرة أخرى إلى البئر دفع كل الطريق إلى أسفل إلى البئر.
واستخدم شاربي لوضع علامة على الجزء العلوي من الأنبوب للإشارة إلى أنه تم تحميل البئر. عندما تم تحميل جميع الآبار مع الخرز إعادة الأنابيب عينة 24 إلى تخزين 20 درجة مئوية وإضافة 24 أنابيب جديدة دون عينة إلى كتلة الجليد، للسماح المجموعة التالية من العينات ليتم تحميلها في لوحة 96 جيدا كما أظهرت للتو. عندما تم تحميل جميع 95 من الآبار مع عينة والخرزة الحل، إضافة حل حبة فقط إلى البئر 96.
إزالة جميع الأنابيب، وتمرير لهم أكثر من الآبار المغطاة فقط وإزالة بعناية الفيلم قابلة للثقب من لوحة. ثم نقل بعناية غطاء لوحة من كيس من البلاستيك إلى لوحة ووضع لوحة في 20 درجة مئوية حتى استخراج المخطط لها. وتبين مقارنة طرق تحميل الألواح أن الطريقة المُثبتة تؤدي إلى أدنى تركيز للحمض النووي داخل الآبار الفارغة.
وباستخدام هذه الطريقة، كان تركيز الحمض النووي أقل بكثير عند استخدام الطريقة المقترحة من قبل ماكفرسون وآخرون. على الرغم من تركيز الحمض النووي بهذه الطريقة لم تكن مختلفة إحصائيا عن الطريقة الافتراضية qiagen. جميع الأساليب الثلاث، تنتج تركيزات الحمض النووي يعني تحت اثنين من نانوغرام لكل ميكرولتر.
على الرغم من أن هذه الطريقة الجديدة فقط تنتج الآبار مع عدم وجود تركيز الحمض النووي قابل للقياس. لتقليل احتمال تسرب، والحفاظ على أنبوب 200 ميكرولتر تستقيم عند تحريكه على لوحة، إمالة لوحة وإدراج أنبوب في البئر الصحيح.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة طريقة مبتكرة لتحميل ألواح 96-بئر لتعزيز الكفاءة وتقليل خطر التلوث المتقاطع أثناء استخراج الحمض النووي. تنطبق التقنية على مختلف مجالات أبحاث الميكروبيوم وتهدف إلى تحسين عمليات استخراج الحمض النووي عالية الإنتاجية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال البحث
- أبحاث الميكروبيوم
- استخراج الحمض النووي عالي الإنتاجية
- طرق منع التلوث
الخلفية
- التحديات التي تواجه التلوث المتقاطع للعينات في عمليات استخراج الحمض النووي
- أهمية الحفاظ على سلامة العينة
- الحاجة إلى بروتوكولات مخبرية فعالة
الطرق المستخدمة
- بروتوكول لتحميل العينات في لوحة 96-بئر
- الأدوات وتقنيات التعقيم المستخدمة لتقليل التلوث
- تحليل مقارن مع الطرق الموجودة
النتائج الرئيسية
- تؤدي الطريقة الجديدة إلى تقليل كبير في تركيز الحمض النووي في البئر الفارغة مقارنة بالبروتوكولات التقليدية
- لا تنتج أي تركيز محدد للـ DNA في البئر الفارغة
- تشير الملاحظات إلى تحكم أفضل في التلوث دون المساس بمحصول الحمض النووي
الاستنتاجات
- تظهر هذه الدراسة نهجًا فعالًا لتقليل خطر التلوث في عمليات استخراج الحمض النووي
- تقدم رؤى قيمة للباحثين الذين يرغبون في تعزيز موثوقية نتائج تجاربهم
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
In high-throughput DNA extraction workflows, cross-contamination between samples in 96-well plates compromises data integrity and increases false-positive rates in downstream applications such as microbiome profiling and biomarker discovery. This method addresses a critical pre-analytical vulnerability by reducing well-to-well drift and double-loading, thereby enhancing the reliability of high-throughput nucleic acid preparation. For biopharma R&D, minimizing contamination at the extraction stage improves predictive confidence in target validation assays and supports reproducible screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Reduces false signals from contaminant DNA, improving target specificity in hypothesis-driven screening.
- Operational Value: Enables consistent sample preparation across replicates, reducing variability in early-stage target engagement data.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces extraction blanks with no measurable DNA concentration, establishing a true negative control for assay background.
- Operational Value: Standardizes sample loading into 96-well formats, improving reproducibility across automated and manual pipetting platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant sample processing by maintaining microbiome sample integrity from collection to extraction.
- Operational Value: Facilitates scalable processing of environmental or biological cohorts without increasing false discovery rates.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, specifically enhancing sample preparation for high-throughput extraction prior to library construction and sequencing in microbiome-based target identification workflows.
- Discovery Biology: Ensures that observed microbial signals originate from true biological variation rather than technical artifacts.
- Screening: Generates contamination-controlled DNA inputs suitable for quantitative PCR, sequencing, or functional screening assays.
- Analytics: Delivers low-background DNA extracts that improve signal-to-noise ratios in metagenomic and metatranscriptomic analyses.
- Translational Research: Maintains continuity from environmental or clinical sample collection through unbiased microbial profiling.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, contamination-minimized loading procedure applicable across multiple projects and laboratory sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced mechanistic ambiguity from contaminant-derived signals.
- Operational Value: Reproducibility and standardization of high-throughput plate loading across users and batches.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions in target validation by lowering false-positive risk in screening data.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of leads based on cleaner, more reliable molecular phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic technique and tool sterilization protocols including ethanol and bleach treatment.
- Depends on access to pierceable PCR sealing films, sterile flat-capped PCR tubes, and flame-sterilizable dissection tools.
- Necessitates standardized sample tracking via well-location sheets to prevent misloading during serial processing.
- Involves cold storage steps (ice blocks and 4°C plate storage) to maintain sample integrity during loading.
- Limited to manual or semi-automated workflows; not compatible with fully robotic liquid handlers without adaptation.
