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V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

While protein-polypeptide and nucleic acid-polypeptide interactions are of significant experimental interest, quantitative methods for the characterization of such interactions are often cumbersome. Here we described a relatively simple means of optically monitoring such interactions using excimer-based peptide beacons (PBs). The design of PBs is based on the observation that, whereas short peptides are almost invariably unfolded and highly dynamic, they become rigid when complexed with macromolecular targets. Using this binding-induced folding to segregate two pyrene moieties and therefore inhibit excimer formation, we have produced PBs directed against both anti-HIV antibodies and the retroviral transactive response (TAR) RNA hairpin. For both polypeptides, target recognition is accompanied by a roughly 2-fold decrease in excimer emission, thus allowing the detection of their respective targets at concentrations of a few nanomolar. Because excimer emission requires the formation of a tight, precisely oriented pyrene dimer, even relatively trivial binding-induced segregation reduces fluorescence significantly. This suggests that the PB approach will be suitable for monitoring a wide range of peptide-macromolecule recognition events. Moreover, the synthesis of excimer-based PBs utilizes commercially available modified pyrenes in a simple and well-established protocol, making the approach well suited for routine laboratory applications.

Excimer-based peptide beacons: a convenient experimental approach for monitoring polypeptide-protein and polypeptide-oligonucleotide interactions.

W&auml;hrend der Protein-Polypeptid und Nukleins&auml;ure-Polypeptid Interaktionen erhebliche experimentelle interessant sind, sind quantitative Methoden zur Charakterisierung von solchen Interaktionen oft umst&auml;ndlich. Hier beschrieben wir relativ einfache Weise optisch &Uuml;berwachung solcher Aktivit&auml;ten, die mit Excimer-basierte Peptid-Leuchtfeuer (PBs). Das Design der PBs basiert auf der Beobachtung, dass kurze Peptide sind nahezu ausnahmslos entfaltet und hochdynamische, sie starren, wenn komplexiert mit Makromolekulare Zielen geworden. Mit dieser Bindung-induzierte Falten trennen zwei pyren Adsorptionseigenschaften und daher Excimer-Bildung zu hemmen, haben wir gegen Anti-HIV-Antik&ouml;rper und der Retroviren Transaktions-Antwort (TAR) RNA-Haarnadel PBs produziert. F&uuml;r beide Polypeptiden ist ein etwa 2-fold R&uuml;ckgang der Excimer-Emission, so dass die Erkennung von ihre jeweiligen Ziele bei Konzentrationen von wenigen Nanomolar Zielerfassung begleitet. Da Excimer-Emission die Bildung eines engen, genau ausgerichtete pyren-Dimer erfordert, wird auch relativ trivialen Bindung induziert Rassentrennung Fluoreszenz erheblich reduziert. Dies deuten an, dass der PB-Ansatz f&uuml;r die &Uuml;berwachung einer Vielzahl von Peptid-Makromolek&uuml;l Anerkennung Veranstaltungen geeignet. Dar&uuml;ber hinaus nutzt die Synthese von Excimer-basierte PBs kommerziell erh&auml;ltliche modifizierte Pyrenes in einem einfachen und bew&auml;hrten Protokoll, gut geeignet f&uuml;r Routine Laboranwendungen-Ansatz.

Excimer-basierte Peptid Leuchtt&uuml;rme: ein passender experimentellen Ansatz zur &Uuml;berwachung der Polypeptid-Protein und Polypeptid-Oligonukleotid-Interaktionen.

Both epitope mapping and other in vitro selection techniques produce short polypeptides that tightly and specifically bind to any of a wide range of macromolecular targets. Here, we demonstrate a potentially general means of converting such polypeptides into optical biosensors. The sensing architecture we have developed, termed peptide beacons, is based on the observation that, whereas short peptides are almost invariably unfolded and highly dynamic, they become rigid when complexed to a macromolecular target. Using this effect to segregate a long-lived fluorophore from an electron transfer based, contact quencher (both covalently attached to the peptide), we have produced a robust optical sensor for anti-HIV antibodies. The binding-induced segregation of the fluorophore-quencher pair produces a 6-fold increase in sensor emission, thus allowing us to readily detect as low as approximately 250 pM of the target antibody. Because the sensor is based on binding-induced folding and a visible-light fluorophore, it is sufficiently selective to work directly in complex, contaminant-ridden samples such as saliva and blood.

Peptide beacons: a new design for polypeptide-based optical biosensors.

Epitop Mapping und andere Techniken der in-vitro-Auswahl erzeugen kurze Polypeptide, die eng und speziell an eine Vielzahl von makromolekularen Ziele zu binden. Hier zeigen wir ein potenziell allgemeine Mittel des Umwandelns von solchen Polypeptide in optische Biosensoren. Die Fernerkundung-Architektur, die wir entwickelt haben, Peptid Beacons, genannt, die basiert auf der Beobachtung, dass kurze Peptide nahezu ausnahmslos entfaltet und hochdynamische sind, sie starren, wenn zu einem Makromolekulare Ziel komplexiert werden. Mit dieser Effekt zu einem langlebigen Fluorophor aus einem Elektron trennen basiert, Kontakt Quencher (beide angeschlossen kovalent an das Peptid) zu &uuml;bertragen, haben wir einen robusten optischen Sensor f&uuml;r Anti-HIV-Antik&ouml;rper produziert. Die Segregation induziert durch Bindung des Paares Fluorophor-Quencher produziert eine 6-fold Zunahme der Sensor-Emission, wodurch es uns zu leicht zu ermitteln, so niedrig wie etwa 250 pM des Antik&ouml;rpers vorbei. Da der Sensor auf Bindung induziert Falt- und ein sichtbares Licht-Fluorophor basiert, ist es ausreichend selektiv direkt in komplexen, Kontaminanten heimgesuchten Proben wie Speichel und Blut zu arbeiten.

Peptid-Leuchtt&uuml;rme: ein neues Design f&uuml;r optische Biosensoren Polypeptid-basierte.

We have developed a new biosensor architecture, which is comprised of a polypeptide-peptide nucleic acid tri-block copolymer and which we have termed chimeric peptide beacons (CPB), that generates an optical output via a mechanism analogous to that employed in DNA-based molecular beacons.

Chimeric peptide beacons: a direct polypeptide analog of DNA molecular beacons.

Wir haben eine neue Biosensor-Architektur, die besteht aus einem Polypeptid-Peptid-Nukleins&auml;ure-Tri-Block-Copolymeren und das wir haben bezeichnet entwickelt Chim&auml;ren Peptid Leuchtfeuer (CPB), die einen optischen Ausgang &uuml;ber einen Mechanismus analog zu generiert, die in der DNA-basierte Molekulare Beacons eingesetzt.

Chim&auml;ren Peptid Leuchtt&uuml;rme: eine direkte Polypeptid-Entsprechung von DNA molecular Beacons.

Many polypeptides and small proteins can be readily engineered such that they only fold upon binding a specific target ligand. This approach couples target recognition with a considerable change in polymer structure and dynamics. Recent years have seen the development of a number of biosensors that couple these large changes to readily measurable optical (fluorescent) outputs. These sensors afford the detection of a wide variety of macromolecular targets including proteins, polypeptides, and nucleic acids. Here we describe the design of such biosensors, from the first iterations as protein engineering experiments, to the development of biosensors targeting a range of protein and nucleic acid targets.

Beyond molecular beacons: optical sensors based on the binding-induced folding of proteins and polypeptides.

Viele Polypeptide und kleine Proteine k&ouml;nnen leicht verpflanzt werden, so dass sie nur auf ein bestimmtes Ziel-Ligand verbindliche Falten. Dieser Ansatz Paare Zielerfassung mit einer erheblichen &Auml;nderung in Polymer-Struktur und Dynamik. Den letzten Jahren haben die Entwicklung einer Reihe von Biosensoren gesehen, die diese gro&szlig;en Ver&auml;nderungen auf leicht messbare optische Ausg&auml;nge (fluoreszierende) zu kombinieren. Diese Sensoren erlauben die Erkennung einer Vielzahl von makromolekularen Ziele einschlie&szlig;lich Nukleins&auml;uren, Proteine und Polypeptide. Hier beschreiben wir die Gestaltung solcher Biosensoren, aus der ersten Iterationen als Protein engineering Experimente, zur Entwicklung von Biosensoren, die gezielt einer Reihe von Protein und Nukleins&auml;ure-Ziele.

Article	Year
Excimer-based peptide beacons: a convenient experimental approach for monitoring polypeptide-protein and polypeptide-oligonucleotide interactions. Journal of the American Chemical Society\| PubMed ID: 17061871	2006
Peptide beacons: a new design for polypeptide-based optical biosensors. Bioconjugate chemistry\| PubMed ID: 17461545	2007
Chimeric peptide beacons: a direct polypeptide analog of DNA molecular beacons. Chemical communications (Cambridge, England)\| PubMed ID: 18361352	2007
Beyond molecular beacons: optical sensors based on the binding-induced folding of proteins and polypeptides. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany)\| PubMed ID: 19191230	2009

Kenneth Oh

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