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The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

The importance of individual residues in the N-terminal region of cystatin B for proteinase inhibition was elucidated by measurements of the affinity and kinetics of binding of N-terminally truncated, recombinant variants of the bovine inhibitor to cysteine proteinases. Removal of Met-1 caused an 8- to 10-fold lower affinity for papain and cathepsin B, decreased the affinity also for cathepsin L but only minimally affected cathepsin H affinity. Additional truncation of Met-2 further weakened the binding to papain and cathepsin B by 40-70-fold, whereas the affinity for cathepsins L and H was essentially unaffected. Removal of Cys-3 had the most drastic effects on the interactions, resulting in a further affinity decrease of approximately 1500-fold for papain, approximately 700-fold for cathepsin L and approximately 15-fold for cathepsin H; the binding to cathepsin B could not be assessed. The binding kinetics could only be evaluated for papain and cathepsin H and showed that the reduced affinities for these enzymes were predominantly due to increased dissociation rate constants. These results demonstrate that the N-terminal region of cystatin B contributes appreciably to proteinase inhibition, in contrast to previous proposals. It is responsible for 12-40% of the total binding energy of the inhibitor to the proteinases investigated, being of least importance for cathepsin H binding. Cys-3 is the most important residue of the N-terminal region for inhibition of papain, cathepsin L and cathepsin H, the role of the other residues of this region varying with the target proteinase.

Contributions of individual residues in the N-terminal region of cystatin B (stefin B) to inhibition of cysteine proteinases.

Beitr&#xE4;ge der einzelnen Reste in der N-terminalen Region von Cystatin B (Stefin B) zur Hemmung von Cystein-Proteinasen.

The classical method of measuring binding constants with affinity-based biosensors involves testing several analyte concentrations over the same ligand surface and regenerating the surface between binding cycles. Here we describe an alternative approach to collecting kinetic binding data, which we call "kinetic titration." This method involves sequentially injecting an analyte concentration series without any regeneration steps. Through a combination of simulation and experimentation, we show that this method can be as robust as the classical method of analysis. In addition, kinetic titrations can be more efficient than the conventional data collection method and allow us to fully characterize analyte binding to ligand surfaces that are difficult to regenerate.

Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors.

Die klassische Methode des Messens verbindliche Konstanten mit Affinit&auml;t-basierten Biosensoren umfasst testen mehrere Analyt-Konzentrationen &uuml;ber die gleiche Ligand-Oberfl&auml;che und regenerierende Fl&auml;che zwischen Bindung Zyklen. Hier beschreiben wir einen alternativen Ansatz zur Erfassung der kinetischen Binden von Daten, die wir nennen &quot;kinetische Titrierung.&quot; Bei dieser Methode werden sequenziell Injektion eines Analyten-Konzentration-Serie ohne Regenerierung Schritte. Durch eine Kombination von Simulation und Experiment zeigen wir, dass diese Methode so robust wie die klassische Methode der Analyse sein kann. Dar&uuml;ber hinaus k&ouml;nnen kinetische Titrationen effizienter als konventionelle Datensammelmethode und erlauben uns, Analyten binden an Ligand Fl&auml;chen vollst&auml;ndig zu charakterisieren, die schwer zu regenerieren.

Analyse einer kinetischen Titrierung-Reihe mit Affinit&auml;ts-Biosensoren.

Surface plasmon resonance (SPR) detection technology was employed to investigate the kinetic mechanism of deoxyadenosine kinase from Mycoplasma mycoides ssp. mycoides SC. In our experimental approach, the enzyme was attached to the sensor surface, the reactants were injected in the mobile phase, and the product-enzyme complex formation was measured using the fact that the rate of product formation exceeds that of its dissociation. The pre-steady-state analysis of deoxyguanosine phosphorylation showed the presence of a burst phase, which is consistent with product dissociation being a rate-limiting step. High activity of the immobilized enzyme was demonstrated by analyzing the reaction mixture eluted from the chip and by determining the Michaelis-Menten constants for several phosphate acceptors (e.g., deoxyadenosine) and phosphate donors (e.g., ATP) using SPR detection. These values were in good agreement with those reported previously [Wang, L. et al. (2001) Mol. Microbiol. 42, 1065-1073]. The bisubstrate initial rate pattern obtained was characteristic of a sequential kinetic mechanism. Because in the method applied here it is the mass change on the surface that is monitored, a new mathematical approach to interpreting product inhibition experiments was proposed. According to that approach, product inhibition studies, supported by product binding experiments, indicated that the reaction mechanism was of Bi Bi sequential ordered type, involving the formation of a ternary complex, in which ATP and deoxyadenosine bound sequentially, followed by a transfer of the phosphate group, and an ordered release of products with ADP dissociating before dAMP.

Kinetic mechanism of deoxyadenosine kinase from Mycoplasma determined by surface plasmon resonance technology.

Oberfl&auml;chen-Plasmon-Resonanz (SPR)-Detection-Technologie wurde eingesetzt, um den kinetischen Mechanismus der Deoxyadenosine Kinase von Mycoplasma Mycoides SSP Mycoides SC. untersuchen In unserer experimentellen Ansatz das Enzym auf der Sensoroberfl&auml;che befestigt war, die Edukte wurden in der mobilen Phase injiziert und die Produkt-Enzym-Komplex-Bildung wurde gemessen unter der Tatsache, dass die Rate der Produkt-Formation, die von seiner Dissoziation &uuml;berschreitet. Die steady-State-Analyse von Pentanatriumtriphosphat Phosphorylierung zeigte das Vorhandensein einer Burst-Phase, die Produkt-Dissoziation ein geschwindigkeitsbestimmende Schritt entspricht. Hoher Aktivit&auml;t des Enzyms immobilisierte zeigte sich durch die Analyse des Reaktionsgemisch eluiert vom Chip und durch die Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstanten f&uuml;r mehrere Phosphat Acceptors (z.B. Deoxyadenosine) und Phosphat Spender (z. B. ATP) mit SPR-Erkennung. Diese Werte waren in guter &Uuml;bereinstimmung mit den gemeldeten vorher [Wang, L. Et Al. (2001) Mol Microbiol. 42, 1065-1073]. Das Bisubstrate ersten Satz Muster erhalten war charakteristisch f&uuml;r einen sequenziellen kinetische Mechanismus. Weil in die hier angewandte Methode der Massen&auml;nderung an der Oberfl&auml;che es, die &uuml;berwacht wird ist, wurde ein neuer mathematischer Ansatz zur Interpretation Produkt Hemmung Experimente vorgeschlagen. Nach diesem Ansatz, Produkt Hemmung Studien, unterst&uuml;tzt durch Produkt-Bindung-Experimente, darauf hingewiesen, dass der Reaktionsmechanismus der sequentiellen Bi Bi Typ, bei denen eine tern&auml;re komplexe, in denen ATP bestellt wurde und Deoxyadenosine sequenziell gebunden eine &Uuml;bertragung der Phosphatgruppe und folgten eine geordnete Freigabe von Produkten mit ADP man distanziert vor Feuchtigkeit.

Kinetische Mechanismus der Deoxyadenosine Kinase von Mycoplasma durch Oberfl&auml;chen-Plasmon-Resonanz-Technologie bestimmt.

Antibody responses, induced in Cynomolgus monkey by recombinant IgE-derived immunotherapeutic protein against atopic allergies and asthma, were characterized using label-free, real-time protein interaction analysis. The effects of two different immunotherapeutic proteins were compared. Active concentrations of specific anti-IgE antibodies formed were determined in sera sampled at multiple time points, using conditions of total mass transport limitation that were proved to exist on the sensor surface. These concentrations varied from about 0.4 to 35 microg/ml among the monkeys and throughout the immunization period. Based on these concentrations, the rate and affinity constants for the binding of antibody populations to the antigen could be determined. The apparent equilibrium dissociation constant decreased during the immunization period, for all the monkeys, by a factor between 6 and 50, ending at values from approximately 2 x 10(-9) to approximately 2 x 10(-11) M among the animals. This affinity maturation was attributable to the changes in both rate constants, although the magnitude of the contribution of each constant depended partly on specimen, but primarily on the immunotherapeutic used. The immunotherapeutic proteins examined showed excellent immunogenic properties, providing the basis for a new and effective treatment for allergy and asthma.

Biosensor-based characterization of serum antibodies during development of an anti-IgE immunotherapeutic against allergy and asthma.

Antik&ouml;rperantworten, induziert in Cynomolgus Affen durch rekombinante IgE abgeleitete immuntherapeutischen Protein gegen atopischen Allergien und Asthma, zeichneten sich mit Etikett-frei, Echtzeit-Interaktion Proteinanalytik. Die Wirkung von zwei verschiedenen immuntherapeutischen Proteine wurden verglichen. Aktive Konzentrationen von spezifischen Anti-IgE-Antik&ouml;rper gebildet wurden in Seren, die Stichprobe bei mehreren Zeitpunkten, mit Bedingungen insgesamt Massenverkehrsmitteln Verj&auml;hrungsfrist, die sich auf der Sensoroberfl&auml;che vorhanden als wurden ermittelt. Diese Konzentrationen reichten von &uuml;ber 0,4 bis 35 &micro;g/ml unter den Affen und w&auml;hrend der gesamten Immunisierung. Auf der Grundlage dieser Konzentrationen, konnte die Konstanten Rate und Affinit&auml;t f&uuml;r die Bindung der Bev&ouml;lkerung der Antik&ouml;rper an das Antigen ermittelt werden. Die scheinbare Gleichgewicht-Dissoziationskonstante verringerten sich zur Zeit der Impfung f&uuml;r alle die Affen, um einen Faktor zwischen 6 und 50, endet bei Werten von ca. 2 X 10(-9), ca. 2 X 10(-11) M unter den Tieren. Diese Affinit&auml;t Reifung zur&uuml;ckzuf&uuml;hren auf die Ver&auml;nderungen in beiden Geschwindigkeitskonstanten, obwohl das Ausma&szlig; des Beitrags der jede Konstante teilweise auf Probe, sondern in erster Linie auf den immuntherapeutischen verwendet abhing. Die immuntherapeutischen Proteine untersucht zeigte ausgezeichnete immunogene Eigenschaften, die die Grundlage f&uuml;r eine neue und wirksame Behandlung f&uuml;r Allergien und Asthma.

Biosensoren Charakterisierung der Serum-Antik&ouml;rper w&auml;hrend der Entwicklung des Anti-IgE immuntherapeutischen gegen Allergien und Asthma.

To explore the variability in biosensor studies, 150 participants from 20 countries were given the same protein samples and asked to determine kinetic rate constants for the interaction. We chose a protein system that was amenable to analysis using different biosensor platforms as well as by users of different expertise levels. The two proteins (a 50-kDa Fab and a 60-kDa glutathione S-transferase [GST] antigen) form a relatively high-affinity complex, so participants needed to optimize several experimental parameters, including ligand immobilization and regeneration conditions as well as analyte concentrations and injection/dissociation times. Although most participants collected binding responses that could be fit to yield kinetic parameters, the quality of a few data sets could have been improved by optimizing the assay design. Once these outliers were removed, the average reported affinity across the remaining panel of participants was 620 pM with a standard deviation of 980 pM. These results demonstrate that when this biosensor assay was designed and executed appropriately, the reported rate constants were consistent, and independent of which protein was immobilized and which biosensor was used.

A global benchmark study using affinity-based biosensors.

Um die Variabilit&auml;t der Biosensor-Studien untersuchen, 150 Teilnehmer aus 20 L&auml;ndern erhielten die gleichen Proteinproben und gebeten, kinetischen Geschwindigkeitskonstanten f&uuml;r die Interaktion zu bestimmen. Wir w&auml;hlten eine Protein-System, die empf&auml;nglich Analyse mit verschiedenen Biosensor-Plattformen sowie durch unterschiedliche Know-how Erfahrungsstufen war. Die beiden Proteine (eine 50-kDa-Fab und ein 60-kDa-Glutathion-S-Transferase [GST]-Antigen) bilden ein relativ hoher Affinit&auml;t-komplexes, so musste, dass die Teilnehmer verschiedene experimentelle Parameter einschlie&szlig;lich Ligand Immobilisierung und Regeneration Bedingungen und Analyt-Konzentrationen sowie Injektion/Dissoziation Mal zu optimieren. Obwohl die meisten Teilnehmer verbindliche Antworten zusammengestellt, das k&ouml;nnte passen, kinetische Parameter zu erbringen, die Qualit&auml;t der wenigen Datens&auml;tzen verbessert worden durch die Optimierung des Assay-Design. Sobald diese Ausrei&szlig;er entfernt wurden, im Durchschnitt berichtet Affinit&auml;t &uuml;ber die verbleibenden Panel Teilnehmer wurde 620 pM mit einer Standardabweichung von 980 pM. Diese Ergebnisse zeigen, dass bei dieser Biosensor-Assay wurde entworfen und entsprechend ausgef&uuml;hrt, wurden die gemeldeten Geschwindigkeitskonstanten konsistente und unabh&auml;ngig von dem Protein immobilisiert wurde und welche Biosensor verwendet wurde.

Article	Year
Contributions of individual residues in the N-terminal region of cystatin B (stefin B) to inhibition of cysteine proteinases. Biochimica et biophysica acta\| PubMed ID: 12535617	2003
Analyzing a kinetic titration series using affinity biosensors. Analytical biochemistry\| PubMed ID: 16337141	2006
Kinetic mechanism of deoxyadenosine kinase from Mycoplasma determined by surface plasmon resonance technology. Biochemistry\| PubMed ID: 16401080	2006
Biosensor-based characterization of serum antibodies during development of an anti-IgE immunotherapeutic against allergy and asthma. Journal of molecular recognition : JMR\| PubMed ID: 17036306	2007
A global benchmark study using affinity-based biosensors. Analytical biochemistry\| PubMed ID: 19133223	2009

Ewa Pol

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