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A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

We have analyzed a systematic flaw in the current system of gene identification: the oligo(dT) primer widely used for cDNA synthesis generates a high frequency of truncated cDNAs through internal poly(A) priming. Such truncated cDNAs may contribute to 12% of the expressed sequence tags in the current dbEST database. By using a synthetic transcript and real mRNA templates as models, we characterized the patterns of internal poly(A) priming by oligo(dT) primer. We further demonstrated that the internal poly(A) priming can be effectively diminished by replacing the oligo(dT) primer with a set of anchored oligo(dT) primers for reverse transcription. Our study indicates that cDNAs designed for genomewide gene identification should be synthesized by use of the anchored oligo(dT) primers, rather than the oligo(dT) primers, to diminish the generation of truncated cDNAs caused by internal poly(A) priming.

Oligo(dT) primer generates a high frequency of truncated cDNAs through internal poly(A) priming during reverse transcription.

Oligo (dT)-Primer erzeugt eine hohe Frequenz abgeschnitten cDNAs durch interne Poly (A)-Priming w&#xE4;hrend der reversen Transkription.

Carbon monoxide (CO), an endogenous cytoprotective product of heme oxygenase type-1 regulates target thrombotic and inflammatory genes in ischemic stress. Regulation of the gene encoding early growth response 1 (Egr-1), a potent transcriptional activator of deleterious thrombotic and inflammatory cascades, may govern CO-mediated ischemic lung protection. The exact signaling mechanisms underlying CO-mediated cytoprotection are not well understood. In this study we tested the hypothesis that inhibition of mitogen-activated protein kinase-dependent Egr-1 expression may be pivotal in CO-mediated ischemic protection. In an in vivo isogeneic rat lung ischemic injury model, inhaled CO not only diminished fibrin accumulation and leukostasis and improved gas exchange and survival but also suppressed extracellular signal-regulated kinase (ERK) activation, Egr-1 expression, and Erg DNA-binding activity in lung tissue. Additionally, CO-mediated inhibition of Egr-1 reduced expression of target genes, such as tissue factor, serpine-1, interleukin-1, and TNF-alpha. However, CO failed to inhibit serpine-1 expression after unilateral lung ischemia in mice null for the Egr-1 gene. In RAW macrophages in vitro, hypoxia-induced Egr-1 mRNA expression was ERK-dependent, and CO-mediated suppression of ERK activation resulted in Egr-1 inhibition. Furthermore, CO suppression of ERK phosphorylation was reversed by the guanylate cyclase inhibitor 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-one but was insensitive to cAMP-dependent protein kinase A inhibition with H89 and NO synthase inhibition with l-nitroarginine methyl ester. This finding indicates that CO suppresses ERK in a cGMP-dependent but cAMP/protein kinase A- and NO-independent manner. Together, these data identify a unifying molecular mechanism by which CO interrupts proinflammatory and prothrombotic mediators of ischemic injury.

Carbon monoxide rescues ischemic lungs by interrupting MAPK-driven expression of early growth response 1 gene and its downstream target genes.

Kohlenmonoxid (CO), regelt eine endogene Cytoprotective Produkt von H&auml;m-Oxygenase-Typ-1 thrombotische und entz&uuml;ndlichen Zielgene im isch&auml;mischen Stress. Regulierung der gen, das fr&uuml;he Wachstum Antwort 1 (Egr-1), ein potenter transkriptionelle Aktivator von sch&auml;dlichen thrombotische und inflammatorische Kaskaden, kann CO-mediated isch&auml;mischen Lunge Schutz Regeln. Die genauen Signalisierungsmechanismen zugrunde liegenden CO-mediated Cytoprotection sind nicht gut verstanden. In dieser Studie testeten wir die Hypothese, dass die Hemmung der Mitogen-aktivierte Protein-Kinase-abh&auml;ngige-Egr-1-Expression CO-mediated isch&auml;mischen Schutz entscheidend sein kann. In einer in-vivo Isogeneic Lung isch&auml;mischen Sch&auml;digung Rattenmodell inhalativen CO nicht nur vermindert Fibrin Anh&auml;ufung und Leukostasis und verbesserten Gasaustausch und &Uuml;berleben aber auch unterdr&uuml;ckt extrazellul&auml;re Signal-regulierte Kinase (ERK) Aktivierung, Egr-1 Ausdruck und Erg DNA-bindenen Aktivit&auml;t im Lungengewebe. Dar&uuml;ber hinaus verringert die CO-mediated Hemmung der Egr-1 Ausdruck Zielgene, wie Gewebe-Faktor, Serpine-1, Interleukin-1 und TNF-Alpha. Allerdings gelang es CO Serpine-1 Ausdruck nach einseitigen Lunge Isch&auml;mie bei M&auml;usen f&uuml;r das Egr-1-gen null zu hemmen. In in-vitro-RAW Makrophagen Hypoxie-induzierten Egr-1 mRNA Ausdruck war ERK-abh&auml;ngige und CO-mediated Unterdr&uuml;ckung der ERK Aktivierung f&uuml;hrten Egr-1-Hemmung. Au&szlig;erdem CO-Unterdr&uuml;ckung von ERK Phosphorylierung kehrte sich von der Guanylatcyclase Inhibitor 1 H-[1,2,4] Oxadiazolo [4,3-a] chinoxalin-1-One aber war unempfindlich gegen Lager-abh&auml;ngige Protein Kinase A Hemmung mit H89 und keine Synthase-Hemmung mit l-Nitroarginine-Methylester. Dieses Ergebnis zeigt, dass CO ERK cGMP-abh&auml;ngige aber Lager/Protein Kinase - und NO-unabh&auml;ngigen Weise unterdr&uuml;ckt. Gemeinsam kennzeichnen diese Daten eine vereinheitlichende Molekulare Mechanismen, durch die CO Proinflammatory und Prothrombotic Mediatoren der isch&auml;mischen Verletzung unterbricht.

Kohlenmonoxid rettet isch&auml;mische Lungen von MAPK-gesteuerte Ausdruck der fr&uuml;hen Wachstum Antwort 1 Gen und seine nachgeordneten Zielgene zu unterbrechen.

Cell therapy has tremendous potential for the damaged heart, which has limited self-renewing capability. Bone marrow (BM) cells are attractive for cell therapy, as they contain diverse stem and progenitor cell populations that can give rise to various cell types, including cardiomyocytes, endothelial cells, and smooth muscle cells. Studies have shown BM cells to be safe and efficacious in the treatment of myocardial infarction. Possible therapeutic mechanisms mediated by both host and transplanted cells include cardiomyogenesis, neovascularization, and attenuation of adverse remodeling. In this review, different stem and progenitor cells in the bone marrow and their application in cell therapy are reviewed, and evidence for their therapeutic mechanisms is discussed.

Cell therapy with bone marrow cells for myocardial regeneration.

Zelltherapie hat enormes Potenzial f&uuml;r das besch&auml;digte Herz, das erneuernde F&auml;higkeit begrenzt hat. Knochenmarkzellen (BM) sind f&uuml;r Zelltherapie, attraktiv, da sie verschiedene Bev&ouml;lkerungsgruppen f&uuml;r Stamm- und Vorl&auml;uferzellen Zelle enthalten, die zu verschiedenen Zelltypen, einschlie&szlig;lich Cardiomyocytes, Endothelzellen und glatten Muskelzellen f&uuml;hren k&ouml;nnen. Studien zeigten BM Zellen sicher und wirksam bei der Behandlung eines Herzinfarktes. M&ouml;gliche therapeutische Verfahren von sowohl Host vermittelt und transplantierte Zellen geh&ouml;ren Cardiomyogenesis, Neovaskularisation und D&auml;mpfung von nachteiligen Umbau. In diesem Bericht verschiedenen Stamm- und Vorl&auml;uferzellen im Knochenmark und deren Anwendung in Zelltherapie werden &uuml;berpr&uuml;ft, und Beweise f&uuml;r ihre therapeutischen Mechanismen wird diskutiert.

Zelltherapie mit Knochenmarkzellen myokardialen Regeneration.

Atherosclerosis is closely associated with disturbed flow characterized by low and oscillatory shear stress, but studies directly linking disturbed flow to atherogenesis is lacking. The major reason for this has been a lack of an animal model in which disturbed flow can be acutely induced and cause atherosclerosis. Here, we characterize partial carotid ligation as a model of disturbed flow with characteristics of low and oscillatory wall shear stress. We also describe a method of isolating intimal RNA in sufficient quantity from mouse carotid arteries. Using this model and method, we found that partial ligation causes upregulation of proatherogenic genes, downregulation of antiatherogenic genes, endothelial dysfunction, and rapid atherosclerosis in 2 wk in a p47(phox)-dependent manner and advanced lesions by 4 wk. We found that partial ligation results in endothelial dysfunction, rapid atherosclerosis, and advanced lesion development in a physiologically relevant model of disturbed flow. It also allows for easy and rapid intimal RNA isolation. This novel model and method could be used for genome-wide studies to determine molecular mechanisms underlying flow-dependent regulation of vascular biology and diseases.

Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis.

Atherosklerose ist eng verbunden mit gest&ouml;rtem Flow zeichnet sich durch niedrige und oszillierende Schubspannung, aber Studien direkt verbindet gest&ouml;rten Str&ouml;mung zu Atherogenesis fehlt. Der wesentliche Grund hierf&uuml;r wurde ein Mangel an einem Tiermodell gest&ouml;rt hereinstr&ouml;men k&ouml;nnen akut induzierte werden und verursachen Arteriosklerose. Hier pr&auml;gen wir teilweise Carotis Ligaturen als Modell einer gest&ouml;rten Str&ouml;mung mit Merkmalen der niedrigen und oszillierende Wand Schubspannung. Wir beschreiben auch eine Methode zur Isolierung von Hypertrophien RNS in ausreichender Menge von Maus Halsarterien. Mit diesem Modell und Methode, wir fanden, dass partielle Verbindung verursacht Hochregulation von Genen, Proatherogenic, Medikament antiatherogenic Gene, endothelialer Dysfunktion und schnelle Atherosklerose in 2 wk in eine p47 (Phox)-abh&auml;ngigen Weise und erweiterte L&auml;sionen von 4 wk. Wir fanden, dass die partielle Ligaturen endothelialen Dysfunktion, schnelle Atherosklerose und erweiterte L&auml;sion Entwicklung in einem physiologisch relevanten Modell des gest&ouml;rten Fluss f&uuml;hrt. Dar&uuml;ber hinaus k&ouml;nnen f&uuml;r die einfache und schnelle Hypertrophien RNA-Isolierung. Dieses neue Modell und Methode k&ouml;nnte f&uuml;r genomweiten Studien verwendet werden, molekulare Mechanismen flie&szlig;en-abh&auml;ngige Verordnung f&uuml;r vaskul&auml;re Biologie und Krankheiten zu bestimmen.

Partielle Carotis Ligaturen ist ein Modell von akut induzierte gest&ouml;rten Str&ouml;mung, f&uuml;hrt zu raschen endothelialen Dysfunktion und Atherosklerose.

Recently, we showed that disturbed flow caused by a partial ligation of mouse carotid artery rapidly induces atherosclerosis. Here, we identified mechanosensitive genes in vivo through a genome-wide microarray study using mouse endothelial RNAs isolated from the flow-disturbed left and the undisturbed right common carotid artery. We found 62 and 523 genes that changed significantly by 12 hours and 48 hours after ligation, respectively. The results were validated by quantitative polymerase chain reaction for 44 of 46 tested genes. This array study discovered numerous novel mechanosensitive genes, including Lmo4, klk10, and dhh, while confirming well-known ones, such as Klf2, eNOS, and BMP4. Four genes were further validated for protein, including LMO4, which showed higher expression in mouse aortic arch and in human coronary endothelium in an asymmetric pattern. Comparison of in vivo, ex vivo, and in vitro endothelial gene expression profiles indicates that numerous in vivo mechanosensitive genes appear to be lost or dysregulated during culture. Gene ontology analyses show that disturbed flow regulates genes involved in cell proliferation and morphology by 12 hours, followed by inflammatory and immune responses by 48 hours. Determining the functional importance of these novel mechanosensitive genes may provide important insights into understanding vascular biology and atherosclerosis.

Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow.

Vor kurzem haben wir gezeigt, dass gest&ouml;rte Fluss verursacht durch eine partielle Verbindung der Halsschlagader Maus schnell Atherosklerose induziert. Hier haben wir festgestellt, Mechanosensitive Gene in-vivo einer genomweiten Microarray-Untersuchung mit Maus, die endotheliale RNAs von Fluss-gest&ouml;rte Links und ungest&ouml;rt rechts gemeinsame Halsschlagader isoliert. Wir fanden 62 und 523-gen, die sich deutlich von 12 Stunden und 48 Stunden nach Verbindung, bzw. ge&auml;ndert. Die Ergebnisse wurden durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion f&uuml;r 44 46 getestete Gene validiert. Dieses Array-Studie entdeckte zahlreiche neuartige Mechanosensitive Gene, einschlie&szlig;lich Lmo4, klk10 und Dhh, zwar bekannt sind, wie Klf2, eNOS und BMP4 best&auml;tigt. Vier Gene wurden weiter validiert f&uuml;r Protein, einschlie&szlig;lich LMO4, die h&ouml;heren Ausdruck in Maus-Aortenbogen und menschlichen koronaren Endothel in einem asymmetrischen Muster zeigte. Vergleich von in-vivo, ex Vivo und in vitro endothelial Gen-Ausdruck-Profilen zeigt, dass zahlreiche in-vivo Mechanosensitive scheinen Gene verloren oder defekten w&auml;hrend der Kultur. Gen Ontologie Analysen zeigen, dass die Str&ouml;mung gest&ouml;rt regelt Genen, die Zellproliferation und Morphologie von 12 Stunden, gefolgt von entz&uuml;ndlichen und immun-Reaktionen von 48 Stunden. Die funktionelle Bedeutung dieser neuartigen Mechanosensitive-Gene bestimmen kann wichtige Einblicke in das Verst&auml;ndnis der vaskul&auml;ren Biologie und Atherosklerose vorsehen.

Article	Year
Oligo(dT) primer generates a high frequency of truncated cDNAs through internal poly(A) priming during reverse transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 11972056	2002
Carbon monoxide rescues ischemic lungs by interrupting MAPK-driven expression of early growth response 1 gene and its downstream target genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 16551742	2006
Cell therapy with bone marrow cells for myocardial regeneration. Antioxidants & redox signaling\| PubMed ID: 19203213	2009
Partial carotid ligation is a model of acutely induced disturbed flow, leading to rapid endothelial dysfunction and atherosclerosis. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology\| PubMed ID: 19684185	2009
Discovery of novel mechanosensitive genes in vivo using mouse carotid artery endothelium exposed to disturbed flow. Blood\| PubMed ID: 20551377	2010
The use of contrast echo to clear the left atrial appendage. Acute cardiac care\| PubMed ID: 21526916	2011

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