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Optical Scatter Microscopy Based on Two-Dimensional Gabor Filters

We demonstrate a microscopic instrument that can measure subcellular texture arising from organelle morphology and organization within unstained living ...

We demonstrate an optical Fourier processing method to quantify object texture arising from subcellular feature orientation within unstained living cells. Using a digital micromirror device as a Fourier spatial filter, we measured cellular responses to two-dimensional optical Gabor-like filters optimized to sense orientation of nonspherical particles, such as mitochondria, with a width around 0.45 microm. Our method showed significantly rounder structures within apoptosis-defective cells lacking the proapoptotic mitochondrial effectors Bax and Bak, when compared with Bax/Bak expressing cells functional for apoptosis, consistent with reported differences in mitochondrial shape in these cells. By decoupling spatial frequency resolution from image resolution, this method enables rapid analysis of nonspherical submicrometer scatterers in an undersampled large field of view and yields spatially localized morphometric parameters that improve the quantitative assessment of biological function.

Measurement of subcellular texture by optical Gabor-like filtering with a digital micromirror device.

Wir zeigen eine optische Fourier-Verarbeitung-Methode zur Quantifizierung der Objekt-Textur aus subzellulare Feature Orientierung im ungef&auml;rbten lebender Zellen. Verwenden ein digital Micromirror Device als Fourier r&auml;umliche Filter, gemessen wir zellul&auml;re Reaktionen auf zweidimensionale optische Gabor-wie Filter, Sinn-Orientierung der nonspherical Teilchen, wie z.B. Mitochondrien, mit einer Breite um 0.45 Microm optimiert. Unsere Methode zeigte deutlich rundere Strukturen innerhalb der Apoptose-defekte Zellen fehlt die Proapoptotischen mitochondriale Effektoren Bax und Bak, verglichen mit Bax/Bak Zellen f&uuml;r Apoptosis, berichteten Unterschiede in der mitochondrialen Form in diesen Zellen entsprechen funktionell zum Ausdruck zu bringen. Durch Entkopplung r&auml;umliche Frequenzaufl&ouml;sung von Bildaufl&ouml;sung, diese Methode erm&ouml;glicht die schnelle Analyse der nonspherical seiner Unordnung in einem undersampled gro&szlig;en Sehfeld und liefert r&auml;umlich lokalisierte morphometrischer Parameter, die die quantitative Bewertung der biologischen Funktion zu verbessern.

Messung der subzellul&auml;ren Textur durch optische Gabor-wie Filtern mit ein digital Micromirror Device.

Parameters important to the self-assembly of 3-(aminopropyl)triethoxysilane (APTES) on chemically grown silicon oxide (SiO 2) to form an aminopropyl silane (APS) film have been investigated using in situ infrared (IR) absorption spectroscopy. Preannealing to approximately 70 degrees C produces significant improvements in the quality of the film: the APS film is denser, and the Si-O-Si bonds between the molecules and the SiO 2 surface are more structured and ordered with only a limited number of remaining unreacted ethoxy groups. In contrast, post-annealing the functionalized SiO 2 samples after room temperature reaction with APTES (i.e., ex situ annealing) does not lead to any spectral change, suggesting that post-annealing has no strong effect on the horizontal polymerization as suggested earlier. Both IR and ellipsometry data show that the higher the solution temperature, the denser and thinner the APS layer is for a given immersion time. Finally, the APS layer obtained by preannealing the solution at 70 degrees C exhibits a better stability in deionized water than the APS layer prepared at room temperature.

Attachment of 3-(Aminopropyl)triethoxysilane on silicon oxide surfaces: dependence on solution temperature.

Parameter, die wichtig f&uuml;r die Mitnahme von 3-(Aminopropyl) Triethoxysilane (APTES) auf chemisch gewachsenen Siliziumoxid (SiO 2) einen Aminopropyl-Silan (APS) Film zu bilden haben untersucht worden mit in-situ Infrarot (IR)-Absorptionsspektroskopie. Preannealing bis ca. 70 Grad C erzeugt erhebliche Verbesserungen in der Qualit&auml;t des Films: der APS-Film ist Dichter, und die Si-O-Si-Bande zwischen den Molek&uuml;len und der SiO 2-Oberfl&auml;che sind mehr strukturiert und bestellt mit nur einigen wenigen verbleibenden Spurenverunreinigungen Ethoxy-Gruppen. Im Gegensatz dazu f&uuml;hrt nealing die funktionalisierten SiO 2 Proben nach Raumtemperatur Reaktion mit APTES (d.h. ex Situ Gl&uuml;hen) nicht zur spektralen &Auml;nderungen, was darauf hindeutet, dass nealing keine starken Effekt auf die horizontale Polymerisation wie fr&uuml;her hat. IR und Ellipsometrie Daten zeigen, dass je h&ouml;her die Temperatur der L&ouml;sung, der Dichter und d&uuml;nner die APS-Ebene f&uuml;r eine gegebene F&auml;rbezeit. Schlie&szlig;lich weist die APS-Schicht, die durch preannealing die L&ouml;sung bei 70 Grad C eine h&ouml;here Stabilit&auml;t in entsalztem Wasser als die APS-Schicht, die bei Raumtemperatur vorbereitet.

Anlage 3-(Aminopropyl) Triethoxysilane auf Silizium-Oxid-Oberfl&auml;chen: Abh&auml;ngigkeit von der Temperatur der L&ouml;sung.

We use optical Gabor-like filtering implemented with a digital micromirror device to achieve nanoscale sensitivity to changes in the size of finite and periodic objects imaged at low resolution. The method consists of applying an optical Fourier filter bank consisting of Gabor-like filters of varying periods and extracting the optimum filter period that maximizes the filtered object signal. Using this optimum filter period as a measure of object size, we show sensitivity to a 7.5 nm change in the period of a chirped phase mask with period around 1 microm. We also show 30 nm sensitivity to change in the size of polystyrene spheres with diameters around 500 nm. Unlike digital post-processing our optical processing method retains its sensitivity when implemented at low magnification in undersampled images. Furthermore, the optimum Gabor filter period found experimentally is linearly related to sphere diameter over the range 0.46 microm-1 microm and does not rely on a predictive scatter model such as Mie theory. The technique may have applications in high throughput optical analysis of subcellular morphology to study organelle function in living cells.

Highly sensitive size discrimination of sub-micron objects using optical Fourier processing based on two-dimensional Gabor filters.

Wir verwenden optische Gabor-wie Filterung implementiert mit ein digital Micromirror Device Nanoscale Sensitivit&auml;t gegen&uuml;ber &Auml;nderungen in der Gr&ouml;&szlig;e des endlichen und periodische Objekte aufgenommen bei niedriger Aufl&ouml;sung zu erreichen. Die Methode besteht aus Anwendung eine optische Fourier-Filterbank bestehend aus Gabor-wie Filter f&uuml;r unterschiedliche Zeitr&auml;ume und Extrahieren der optimale Filter-Periode, die das gefilterte Objekt-Signal maximiert. Anhand dieser Zeit optimale Filter als Ma&szlig; f&uuml;r die Objektgr&ouml;&szlig;e zeigen wir Sensibilit&auml;t f&uuml;r eine 7,5 nm-&Auml;nderung in der Zeit einer chirped Phase-Maske mit Periode um 1 Microm. Wir zeigen auch 30 nm-Empfindlichkeit &auml;ndern Sie die Gr&ouml;&szlig;e der Polystyrol Kugeln mit Durchmesser rund 500 nm. Im Gegensatz zu digital nachbearbeitet beh&auml;lt unsere optischen Verarbeitungsmethode seine Empfindlichkeit bei der Implementierung bei kleiner Vergr&ouml;&szlig;erung in undersampled Bildern. Dar&uuml;ber hinaus die optimale Gabor Filter Zeit experimentell gefunden ist linear mit Bezug zu Durchmesser &uuml;ber den Bereich 0.46 Microm-1 Microm Kugel und verl&auml;sst sich nicht auf eine vorausschauende XY-Modell z.B. Mie-Theorie. Anwendungen m&ouml;glicherweise die Technik im Hochdurchsatz optische Analyse der subzellul&auml;ren Morphologie Organell-Funktion in lebenden Zellen zu studieren.

Hochsensible Gr&ouml;&szlig;e Diskriminierung von Sub-Mikron-Objekten, die mit optischen Fourier Verarbeitung basiert auf zweidimensionales Gabor-Filter.

We had developed Optical Scatter Imaging (OSI) as a method which combines light scattering spectroscopy with microscopic imaging to probe local particle size in situ. Using a variable diameter iris as a Fourier spatial filter, the technique consisted of collecting images that encoded the intensity ratio of wide-to-narrow angle scatter at each pixel in the full field of view. In this paper, we replace the variable diameter Fourier filter with a digital micromirror device (DMD) to extend our assessment of morphology to the characterization of particle shape and orientation. We describe our setup in detail and demonstrate how to eliminate aberrations associated with the placement of the DMD in a conjugate Fourier plane of our microscopic imaging system. Using bacteria and polystyrene spheres, we show how this system can be used to assess particle aspect ratio even when imaged at low resolution. We also show the feasibility of detecting alterations in organelle aspect ratio in situ within living cells. This improved OSI system could be further developed to automate morphological quantification and sorting of non-spherical particles in situ.

Optical Scatter Imaging with a digital micromirror device.

Wir hatten optische Scatter Imaging (OSI) als eine Methode entwickelt, die Lichtstreuung Spektroskopie kombiniert mit mikroskopischen imaging um lokale Partikelgr&ouml;&szlig;e in-situ Sonde. Verwenden eine Variable Durchmesser Iris als Fourier r&auml;umliche Filter, bestand die Technik der Sammelbilder, die das Intensit&auml;t Verh&auml;ltnis von Breite zu schmal Winkel XY jedes Pixel in das volle Sehfeld codiert. In diesem Papier ersetzen wir den Variablen Durchmesser Fourier-Filter mit einem digital Micromirror Device (DMD) erweitern unsere Einsch&auml;tzung der Morphologie auf die Charakterisierung der Partikelform und Orientierung. Wir beschreiben unser Setup im Detail und veranschaulichen, Aberrationen, verbunden mit der Platzierung der DMD in einem Konjugat Fourier-Ebene des unserer mikroskopisch-imaging-System zu beseitigen. Mit Bakterien und Polystyrol Kugeln, zeigen wir, wie dieses System verwendet werden kann, Partikel-Seitenverh&auml;ltnis, auch wenn mit geringer Aufl&ouml;sung abgebildet zu beurteilen. Wir zeigen auch die Durchf&uuml;hrbarkeit erkennen von &Auml;nderungen in Organell Seitenverh&auml;ltnis in-situ in lebenden Zellen. Dieses verbesserte OSI-System konnte weiter ausgebaut werden, um morphologische Quantifizierung und Sortierung von in-situ nicht-kugelf&ouml;rmige Partikel zu automatisieren.

Optische Scatter Imaging mit ein digital Micromirror Device.

We combine optical scatter imaging (OSI) with fluorescence imaging of mitochondria to investigate the spatial relationship between the optical scatter signal and the location and structure of mitochondria within endothelial cells undergoing apoptosis. The OSI data corroborate our previous results showing a decrease in the intensity ratio of wide-to-narrow angle scatter [optical scatter image ratio (OSIR)] during the first 60 min of apoptosis. In addition, we find here that this is followed by an increase in OSIR concurrent with mitochondrial fragmentation. We demonstrate that the dynamic change in light scattering is spatially associated with subcellular regions containing fluorescently labeled mitochondria, and remains absent from adjacent nonfluorescent regions dominated by other organelles. These results lend strong support to the hypothesis that mitochondria act as the source of the optical scatter changes measured at the onset of apoptosis.

Optical scatter changes at the onset of apoptosis are spatially associated with mitochondria.

Wir kombinieren optische XY imaging (OSI) mit Fluoreszenz-Bildgebung der Mitochondrien, die r&auml;umliche Beziehung zwischen der optischen XY-Signal und die Lage und Struktur der Mitochondrien innerhalb der Endothelzellen in Apoptosis zu untersuchen. Die OSI-Daten best&auml;tigen unsere bisherigen Ergebnisse zeigen einen R&uuml;ckgang der Intensit&auml;t Verh&auml;ltnis von Breite zu schmal Winkel XY [optische XY-Proportionen (OSIR)] w&auml;hrend der ersten 60 min. von Apoptosis. Dar&uuml;ber hinaus finden wir hier, dass dies durch eine Erh&ouml;hung der OSIR gleichzeitig mit mitochondrialen Fragmentierung gefolgt wird. Wir zeigen, dass die dynamische Ver&auml;nderung der Lichtstreuung subzellulare Regionen mit Leuchtstoff beschriftetem Mitochondrien und &Uuml;berreste abwesend aus angrenzenden nonfluorescent Regionen, die von anderen Organellen dominiert r&auml;umlich zugeordnet ist. Diese Ergebnisse in gewisser Weise starken Unterst&uuml;tzung der Hypothese, die Mitochondrien als Quelle f&uuml;r die optische XY-&Auml;nderungen, die zu Beginn der Apoptose gemessen fungieren.

Optische XY &Auml;nderungen zu Beginn der Apoptose sind Mitochondrien r&auml;umlich zugeordnet.

We utilize a recently developed optical imaging method based on Fourier processing with Gabor-like filters to detect changes in light scattering resulting from alterations in mitochondrial structure in endothelial cells undergoing apoptosis. Imaging based on Gabor filters shows a significant decrease in the orientation of subcellular organelles at 60 to 100 minutes following apoptosis induction and concomitant with mitochondrial fragmentation observed by fluorescence. The optical scatter changes can be detected at low resolution at the whole cell level. At high resolution, we combine fluorescence imaging of the mitochondria with optical Fourier-based imaging to demonstrate that the dynamic decrease in organelle orientation measured by optical Gabor filtering is spatially associated with fluorescent mitochondria and remains largely absent from nonfluorescent subcellular regions. These results provide strong evidence that the optical Gabor responses track mitochondrial fission during apoptosis and can be used to provide label-free, rapid monitoring of this morphological process within single cells. Â© 2011 International Society for Advancement of Cytometry.

Detection of mitochondrial fission with orientation-dependent optical Fourier filters.

Wir verwenden eine neu entwickelte optische bildgebende Verfahren, die auf der Grundlage von Fourier Verarbeitung mit Gabor-wie Filter Licht Streuung aufgrund von &Auml;nderungen in mitochondrialen Struktur in Endothelzellen in Apoptosis &Auml;nderungen erkennen. Bildgebung auf der Grundlage von Gabor Filter zeigt eine signifikante Abnahme in der Ausrichtung der subzellularen Organellen bei 60 bis 100 Minuten nach Induktion von Apoptose und damit einhergehende mitochondriale Fragmentierung von Fluoreszenz beobachtet. Die optische XY-&Auml;nderungen k&ouml;nnen mit geringer Aufl&ouml;sung auf ganze Zellenebene nachgewiesen werden. Mit hoher Aufl&ouml;sung kombinieren wir Fluoreszenz-Bildgebung der Mitochondrien mit optischen Fourier-basierten imaging, um nachzuweisen, dass die dynamische Verringerung Organell Ausrichtung gemessen von optischen Filtern Gabor fluoreszierende Mitochondrien und bleibt weitgehend abwesend aus nonfluorescent subzellulare Regionen r&auml;umlich zugeordnet ist. Diese Ergebnisse liefern zuverl&auml;ssig nachgewiesen, dass die optischen Gabor Antworten mitochondriale Kernspaltung w&auml;hrend Apoptosis verfolgen und kann verwendet werden, wird eine Beschriftung-frei, schnelle &Uuml;berwachung dieses morphologische Prozesses innerhalb einzelner Zellen. &copy; 2011 Internationale Gesellschaft zur F&ouml;rderung der Cytometry.

Erkennung von mitochondrialen Kernspaltung mit Orientierung-abh&auml;ngigen optischen Fourier filtert.

We demonstrate an optical Fourier filtering method which can be used to characterize subcellular morphology during dynamic cellular function. In this paper, our Fourier filters were based on two-dimensional Gabor elementary functions, which can be tuned to sense directly object size and orientation. We utilize this method to quantify changes in mitochondrial and nuclear structure during the first three hours of apoptosis. We find that the technique is sensitive to a decrease in particle orientation consistent with apoptosis-induced mitochondrial fragmentation. The scattering signal changes were less pronounced in the nucleus and the remainder of the cytoplasm. Particles in these regions were less oriented than mitochondria and did not change orientation significantly.

Quantifying subcellular dynamics in apoptotic cells with two-dimensional Gabor filters.

Wir zeigen eine optische Fourier Filtermethode, die verwendet werden k&ouml;nnen, um subzellulare Morphologie w&auml;hrend dynamische Zellfunktion zu charakterisieren. In diesem Papier waren unsere Fourier-Filter basiert auf zweidimensionales Gabor elementare Funktionen, die optimiert werden k&ouml;nnen, Objektgr&ouml;&szlig;e und Orientierung direkt zu sp&uuml;ren. Wir verwenden diese Methode, um &Auml;nderungen in Mitochondrien und nukleare w&auml;hrend der ersten drei Stunden der Apoptose zu quantifizieren. Wir finden, dass die Technik zu einem R&uuml;ckgang der Partikel Orientierung mit Apoptose-induzierten mitochondrialen Fragmentierung empfindlich ist. Die Streuung Signal &Auml;nderungen waren weniger ausgepr&auml;gt in den Zellkern und die restliche Zytoplasma. Teilchen in diesen Regionen waren weniger orientiert als Mitochondrien und Orientierung nicht wesentlich ge&auml;ndert.

Quantifizierung der subzellul&auml;ren Dynamik in apoptotischen Zellen mit zweidimensionalen Gabor filtern.

We utilize a recently developed optical imaging method based on Fourier processing with Gabor-like filters to detect changes in light scattering resulting from alterations in mitochondrial structure in endothelial cells undergoing apoptosis. Imaging based on Gabor filters shows a significant decrease in the orientation of subcellular organelles at 60 to 100 minutes following apoptosis induction and concomitant with mitochondrial fragmentation observed by fluorescence. The optical scatter changes can be detected at low resolution at the whole cell level. At high resolution, we combine fluorescence imaging of the mitochondria with optical Fourier-based imaging to demonstrate that the dynamic decrease in organelle orientation measured by optical Gabor filtering is spatially associated with fluorescent mitochondria and remains largely absent from nonfluorescent subcellular regions. These results provide strong evidence that the optical Gabor responses track mitochondrial fission during apoptosis and can be used to provide label-free, rapid monitoring of this morphological process within single cells.

Wir verwenden eine neu entwickelte optische bildgebende Verfahren, die auf der Grundlage von Fourier Verarbeitung mit Gabor-wie Filter Licht Streuung aufgrund von &Auml;nderungen in mitochondrialen Struktur in Endothelzellen in Apoptosis &Auml;nderungen erkennen. Bildgebung auf der Grundlage von Gabor Filter zeigt eine signifikante Abnahme in der Ausrichtung der subzellularen Organellen bei 60 bis 100 Minuten nach Induktion von Apoptose und damit einhergehende mitochondriale Fragmentierung von Fluoreszenz beobachtet. Die optische XY-&Auml;nderungen k&ouml;nnen mit geringer Aufl&ouml;sung auf ganze Zellenebene nachgewiesen werden. Mit hoher Aufl&ouml;sung kombinieren wir Fluoreszenz-Bildgebung der Mitochondrien mit optischen Fourier-basierten imaging, um nachzuweisen, dass die dynamische Verringerung Organell Ausrichtung gemessen von optischen Filtern Gabor fluoreszierende Mitochondrien und bleibt weitgehend abwesend aus nonfluorescent subzellulare Regionen r&auml;umlich zugeordnet ist. Diese Ergebnisse liefern zuverl&auml;ssig nachgewiesen, dass die optischen Gabor Antworten mitochondriale Kernspaltung w&auml;hrend Apoptosis verfolgen und kann verwendet werden, wird eine Beschriftung-frei, schnelle &Uuml;berwachung dieses morphologische Prozesses innerhalb einzelner Zellen.

Article	Year
Measurement of subcellular texture by optical Gabor-like filtering with a digital micromirror device. Optics letters\| PubMed ID: 18830354	2008
Attachment of 3-(Aminopropyl)triethoxysilane on silicon oxide surfaces: dependence on solution temperature. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids\| PubMed ID: 18942864	2008
Highly sensitive size discrimination of sub-micron objects using optical Fourier processing based on two-dimensional Gabor filters. Optics express\| PubMed ID: 19582115	2009
Optical Scatter Imaging with a digital micromirror device. Optics express\| PubMed ID: 19997269	2009
Optical scatter changes at the onset of apoptosis are spatially associated with mitochondria. Journal of biomedical optics\| PubMed ID: 20799771	2010
Detection of mitochondrial fission with orientation-dependent optical Fourier filters. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology\| PubMed ID: 21204081	2011
Quantifying subcellular dynamics in apoptotic cells with two-dimensional Gabor filters. Biomedical optics express\| PubMed ID: 21258503	2010
Detection of mitochondrial fission with orientation-dependent optical Fourier filters. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology\| PubMed ID: 21265007	2011

Robert M. Pasternack

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