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Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

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T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Recently we suggested that direct interactions between voltage-gated K(+) channels and proteins of the exocytotic machinery, such as those observed between the Kv1.1/Kvbeta channel, syntaxin 1A, and SNAP-25 may be involved in neurotransmitter release. Furthermore, we demonstrated that the direct interaction with syntaxin 1A enhances the fast inactivation of Kv1.1/Kvbeta1.1 in oocytes. Here we show that G-protein betagamma subunits play a crucial role in the enhancement of inactivation by syntaxin 1A. The effect caused by overexpression of syntaxin 1A is eliminated in the presence of chelators of endogenous betagamma subunits in the whole cell and at the plasma membrane. Conversely, enhancement of inactivation caused by overexpression of beta(1)gamma(2) subunits is eliminated upon knock-down of endogenous syntaxin or its scavenging at the plasma membrane. We further show that the N terminus of Kv1.1 binds brain synaptosomal and recombinant syntaxin 1A and concomitantly binds beta(1)gamma(2); the binding of beta(1)gamma(2) enhances that of syntaxin 1A. Taken together, we suggest a mechanism whereby syntaxin and G protein betagamma subunits interact concomitantly with a Kv channel to regulate its inactivation.

Modulation of a brain voltage-gated K+ channel by syntaxin 1A requires the physical interaction of Gbetagamma with the channel.

Modulation des Gehirns spannungsabh&#xE4;ngigen K +-Kanal durch Syntaxin 1A erfordert die physikalische Wechselwirkung zwischen Gbetagamma mit dem Kanal.

Previously we suggested that interaction between voltage-gated K+ channels and protein components of the exocytotic machinery regulated transmitter release. This study concerns the interaction between the Kv2.1 channel, the prevalent delayed rectifier K+ channel in neuroendocrine and endocrine cells, and syntaxin 1A and SNAP-25. We recently showed in islet beta-cells that the Kv2.1 K+ current is modulated by syntaxin 1A and SNAP-25. Here we demonstrate, using co-immunoprecipitation and immunocytochemistry analyses, the existence of a physical interaction in neuroendocrine cells between Kv2.1 and syntaxin 1A. Furthermore, using concomitant co-immunoprecipitation from plasma membranes and two-electrode voltage clamp analyses in Xenopus oocytes combined with in vitro binding analysis, we characterized the effects of these interactions on the Kv2.1 channel gating pertaining to the assembly/disassembly of the syntaxin 1A/SNAP-25 (target (t)-SNARE) complex. Syntaxin 1A alone binds strongly to Kv2.1 and shifts both activation and inactivation to hyperpolarized potentials. SNAP-25 alone binds weakly to Kv2.1 and probably has no effect by itself. Expression of SNAP-25 together with syntaxin 1A results in the formation of t-SNARE complexes, with consequent elimination of the effects of syntaxin 1A alone on both activation and inactivation. Moreover, inactivation is shifted to the opposite direction, toward depolarized potentials, and its extent and rate are attenuated. Based on these results we suggest that exocytosis in neuroendocrine cells is tuned by the dynamic coupling of the Kv2.1 channel gating to the assembly status of the t-SNARE complex.

Direct interaction of target SNAREs with the Kv2.1 channel. Modal regulation of channel activation and inactivation gating.

Direkte Interaktion von Ziel-SNAREs mit dem Kv2.1-Kanal. Modal Regulierung der Aktivierung und Inaktivierung Kanal Gating.

Kv2.1, the prevalent delayed-rectifier K(+) channel in neuroendocrine and endocrine cells, was suggested previously by our group to be modulated in islet beta-cells by syntaxin 1A (Syx) and soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein-25 (SNAP-25). We also demonstrated physical interactions in neuroendocrine cells between Kv2.1, Syx, and SNAP-25, characterized their effects on Kv2.1 activation and inactivation in Xenopus laevis oocytes, and suggested that they pertain to the assembly/disassembly of the Syx/SNAP-25 (t-SNARE) complex. In the present work, we established the existence of a causal relationship between the physical and the functional interactions of Syx with the Kv2.1 channel using three different peptides that compete with the channel for binding of Syx when injected into oocytes already coexpressing Syx with Kv2.1 in the plasma membrane: one peptide corresponding to the Syx-binding region on the N-type Ca(2+) channel, and two peptides corresponding to Syx-binding regions on the Kv2.1 C terminus. All peptides reversed the effects of Syx on Kv2.1, suggesting that the hyperpolarizing shifts of the steady-state inactivation and activation of Kv2.1 caused by Syx result from cell-surface protein-protein interactions and point to participation of the C terminus in such an interaction. In line with these findings, the effects of Syx were dissipated by partial deletions of the C terminus. Furthermore, the t-SNARE complex was shown to bind to the Kv2.1 C terminus, and its effects on the inactivation of Kv2.1 were dissipated by partial deletions of the C terminus. Taken together, these findings suggest that physical interactions of both Syx and the t-SNARE complex with the C terminus of Kv2.1 are involved in channel regulation.

Kv2.1 channel activation and inactivation is influenced by physical interactions of both syntaxin 1A and the syntaxin 1A/soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-25 (t-SNARE) complex with the C terminus of the channel.

Kv2.1-Kanal-Aktivierung und Inaktivierung durch physikalische Wechselwirkungen sowohl Syntaxin 1A und Syntaxin 1A/soluble N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor-25 (t-SNARE)-Komplex mit dem C-Terminus des Kanals beeinflusst.

We have hypothesized that the plasma membrane protein components of the exocytotic soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein (SNAP) receptor (SNARE) complex, syntaxin 1A and SNAP-25, distinctly regulate different voltage-gated K+ (Kv) channels that are differentially distributed. Neuroendocrine islet cells (alpha, beta, delta) uniformly contain both syntaxin 1A and SNAP-25. However, using immunohistochemistry, we show that the different pancreatic islet cells contain distinct dominant Kv channels, including Kv2.1 in beta cells and Kv2.2 in alpha and delta cells, whose interactions with the SNARE proteins would, respectively regulate insulin, glucagon and somatostatin secretion. We therefore examined the regulation by syntaxin 1A and SNAP-25 of these two channels. We have shown that Kv2.1 interacts with syntaxin 1A and SNAP-25 and, based on studies in oocytes, suggested a model of two distinct modes of interaction of syntaxin 1A and the complex syntaxin 1A/SNAP-25 with the C terminus of the channel. Here, we characterized the interactions of syntaxin 1A and SNAP-25 with Kv2.2 which is highly homologous to Kv2.1, except for the C-terminus. Comparative two-electrode voltage clamp analysis in oocytes between Kv2.2 and Kv2.1 shows that Kv2.2 interacts only with syntaxin 1A and, in contrast to Kv2.1, it does not interact with the syntaxin 1A/SNAP-25 complex and hence is not sensitive to the assembly/disassembly state of the complex. The distinct regulation of these closely related channels by SNAREs may be attributed to differences in their C termini. Together with the differential distribution of these channels among islet cells, their distinct regulation suggests that the documented profound down-regulation of islet SNARE levels in diabetes could distort islet cell ion channels and secretory responses in different ways, ultimately contributing to the abnormal glucose homeostasis.

Target soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors (t-SNAREs) differently regulate activation and inactivation gating of Kv2.2 and Kv2.1: Implications on pancreatic islet cell Kv channels.

Wir haben die Hypothese auf, dass die Plasmamembran Proteinkomponenten der exocytotic l&ouml;slichen N-Ethylmaleimid-Sensitive Anlage Protein (SNAP) (SNARE)-Rezeptor-Komplex, Syntaxin 1A und SNAP-25 Faktor, regulieren deutlich unterschiedliche Spannung-Gating K + (Kv) Kan&auml;le, die differentiell verteilt werden. Neuroendokrine Inselzellen (Alpha, Beta, Delta) enthalten einheitlich Syntaxin 1A und SNAP-25. Jedoch zeigen verwenden Immunohistochemistry, wir, dass die verschiedenen pankreatischen Inselzellen unterschiedliche dominante Kv-Kan&auml;le enthalten, darunter Kv2.1 in Beta-Zellen und Kv2.2 Alpha und Delta-Zellen, deren Interaktionen mit der SNARE-Proteine w&uuml;rde, bzw. Sekretion von Insulin, Glukagon und Somatostatin regulieren. Wir untersucht daher die Verordnung von Syntaxin-1A und SNAP-25 dieser zwei Kan&auml;le. Wir haben gezeigt, dass Kv2.1 mit Syntaxin interagiert 1A und SNAP-25 und, basierend auf Studien in Eizellen, schlugen ein Modell von zwei verschiedenen Betriebsmodi der Interaktion von Syntaxin-1A und der komplexen Syntaxin 1A/SNAP-25 mit der Carboxyl-Terminus des Kanals. Hier charakterisiert wir die Wechselwirkungen zwischen Syntaxin 1A und SNAP-25 mit Kv2.2, die hochgradig homologe zu Kv2.1, mit Ausnahme der C-Terminus ist. Vergleichende zwei-Elektroden-Spannung Klemme Analyse in Oozyten zwischen Kv2.2 und Kv2.1 zeigt, dass Kv2.2 nur mit Syntaxin 1A interagiert und, im Gegensatz zu Kv2.1, es interagiert nicht mit der Syntaxin 1A/SNAP-25 komplex und daher nicht f&uuml;r die Montage/Demontage-Zustand der Anlage empfindlich ist. Unterschiedliche Verordnung dieser verwandten eng Kan&auml;le von Ozon auf Unterschiede in ihren C-Termini zur&uuml;ckzuf&uuml;hren ist. Zusammen mit der unterschiedlichen Verteilung dieser Kan&auml;le unter Inselzellen zufolge ihre unterschiedlichen Verordnung die dokumentierte Tiefe Herunterregulation Inselchen SNARE Levels in Diabetes unterschiedlich, letztlich einen Beitrag zu den anormalen Glukose-Hom&ouml;ostase Inselchen Zelle Ionenkan&auml;le und sekretorischen Antworten verf&auml;lschen k&ouml;nnten.

Ziel l&ouml;sliche N-Ethylmaleimid-Sensitive Faktor Anlage Protein Rezeptoren (t-SNAREs) neu zu Regeln, Aktivierung und Inaktivierung Anspritzung von Kv2.2 und Kv2.1: Auswirkungen auf Pankreas Inselchen Zelle Kv-Kan&auml;le.

Cleavage fragments of de novo synthesized vimentin were recently reported to interact with phosphorylated Erk1 and Erk2 MAP kinases (pErk) in injured sciatic nerve, thus linking pErk to a signaling complex retrogradely transported on importins and dynein. Here we clarify the structural basis for this interaction, which explains how pErk is protected from dephosphorylation while bound to vimentin. Pull-down and ELISA experiments revealed robust calcium-dependent binding of pErk to the second coiled-coil domain of vimentin, with observed affinities of binding increasing from 180 nM at 0.1 microM calcium to 15 nM at 10 microM calcium. In contrast there was little or no binding of non-phosphorylated Erk to vimentin under these conditions. Geometric and electrostatic complementarity docking generated a number of solutions wherein vimentin binding to pErk occludes the lip containing the phosphorylated residues in the kinase. Binding competition experiments with Erk peptides confirmed a solution in which vimentin covers the phosphorylation lip in pErk, interacting with residues above and below the lip. The same peptides inhibited pErk binding to the dynein complex in sciatic nerve axoplasm, and interfered with protection from phosphatases by vimentin. Thus, a soluble intermediate filament fragment interacts with a signaling kinase and protects it from dephosphorylation by calcium-dependent steric hindrance.

Vimentin binding to phosphorylated Erk sterically hinders enzymatic dephosphorylation of the kinase.

Spaltbarkeit Fragmente von de Novo synthetisiert Vimentin wurden k&uuml;rzlich berichtet, Interaktion mit phosphorylierten Erk1 und Erk2 MAP Kinasen (munter) in verletzten Ischiasnerv, wobei die Verg&uuml;nstigung zu einer Signalisierung komplexe retrogradely auf Importins und Dynein transportiert in Verbindung. Hier kl&auml;ren wir die strukturelle Grundlage f&uuml;r diese Interaktion, die erkl&auml;rt, wie munter vor Dephosphorylierung w&auml;hrend gebundene Vimentin gesch&uuml;tzt ist. Pulldownmen&uuml; und ELISA Experimente aufgedeckt robuste Kalzium-abh&auml;ngige Bindung der Verg&uuml;nstigung der zweiten aufgerollte Spule-Dom&auml;ne von Vimentin, mit beobachteten Affinit&auml;ten der Bindung von 180 nM bei 0,1 MicroM Kalzium bis 15 nM bei 10 MicroM Kalzium. Im Gegensatz dazu gab es wenig oder gar keine Bindung von Erk, Vimentin unter diesen Bedingungen nicht phosphoryliert. Geometrische und elektrostatische Komplementarit&auml;t Andocken generiert eine Reihe von L&ouml;sungen, worin Vimentin Bindung an munter die Lippe, die den phosphoryliertes R&uuml;ckst&auml;nde in der Kinase Zahnbildung. Wettbewerb Experimente mit Erk Peptide binden hat eine L&ouml;sung, in welche, die, die Vimentin deckt die Phosphorylierung lip in Interaktion mit R&uuml;ckst&auml;nden oben und unten die Lippe munter, best&auml;tigt. Die gleichen Peptide gehemmt pErk Bindung an den Komplex in Ischiasnerv Axoplasm Dynein und Schutz vor Phosphatasen durch Vimentin beeintr&auml;chtigt. So eine l&ouml;sliches Heizfadens Fragment interagiert mit einer Signalisierung Kinase und sch&uuml;tzt es vor Dephosphorylierung durch Kalzium-abh&auml;ngige sterische Hinderung.

Vimentin Bindung an Phosphorylierte Erk behindert sterisch enzymatische Dephosphorylierung von der Kinase.

Voltage-gated K(+) channels are crucial for intrinsic neuronal plasticity and present a target for modulations by protein-protein interactions, notably, by exocytotic proteins demonstrated by us in several systems. Here, we investigated the interaction of a single Kv1.1 channel with syntaxin 1A. Syntaxin decreased the unitary conductance of all conductance states (two subconductances and a full conductance) and decreased their open probabilities by prolongation of mean closed dwell-times at depolarized potentials. However, at subthreshold potentials syntaxin 1A increased the probabilities of the subconductance states. Consequently, the macroscopic conductance is decreased at potentials above threshold and increased at threshold potentials. Numerical modeling based on steady-state and kinetic analyses suggests: (1) a mechanism whereby syntaxin controls activation gating by forcing the conductance pathway only via a sequence of discrete steps through the subconductance states, possibly via a breakdown of cooperative movements of voltage sensors that exist in Kv1.1; (2) a physiological effect, apparently paradoxical for an agent that reduces K(+) current, of attenuating neuronal firing frequency via an increase in K(+) shunting conductance. Such modulation of the gain of neuronal output in response to different levels of syntaxin is in accord with the suggested role for Kv1.1 in axonal excitability and synaptic efficacy.

Interaction of syntaxin with a single Kv1.1 channel: a possible mechanism for modulating neuronal excitability.

Spannung-Gating K(+) Kan&auml;le sind entscheidend f&uuml;r die systeminterne neuronale Plastizit&auml;t und pr&auml;sentieren ein Ziel f&uuml;r Modulationen von Protein-Protein-Wechselwirkungen, insbesondere durch exocytotic Proteine, die von uns in mehreren Systemen nachgewiesen. Hier untersuchten wir das Zusammenspiel von einem Kv1.1 Kanal mit Syntaxin-1A. Syntaxin verringert den unit&auml;ren Leitwert aller Leitwert-Staaten (zwei Subconductances und eine vollst&auml;ndige Leitwert) und ihre offenen Wahrscheinlichkeiten durch Verl&auml;ngerung der mittlere geschlossenen Verweilzeiten auf ersch&uuml;ttertes Potenziale. Jedoch bei subthreshold Potenziale Syntaxin erh&ouml;ht 1A die Wahrscheinlichkeiten der Subconductance Staaten. Folglich ist die makroskopische Leitf&auml;higkeit sank Potenziale &uuml;ber Schwellenwert und stieg am Schwellenwert Potenziale. Numerische Modellierung basierend auf station&auml;ren und kinetische Analysen vorschl&auml;gt: (1) einen Mechanismus, wobei Syntaxin Aktivierung Anspritzung steuert zwingen den Leitwert-Weg nur &uuml;ber eine Abfolge von diskreten Schritten durch den Subconductance Staaten, m&ouml;glicherweise &uuml;ber eine Aufschl&uuml;sselung der kooperativen Bewegungen der Spannungssensoren, die vorhanden in Kv1.1; (2) eine physiologische Wirkung, scheinbar paradoxe f&uuml;r einen Agenten, der Strom, der neuronale feuern Frequenz &uuml;ber einen Anstieg der K(+) Rangier-Leitwert abgeschw&auml;cht K(+) reduziert. Solche Modulation des Gewinns der neuronalen Ausgabe als Reaktion auf verschiedenen Ebenen von Syntaxin ist in &Uuml;bereinstimmung mit der vorgeschlagenen Rolle f&uuml;r Kv1.1 in axonale Erregbarkeit und synaptische Wirksamkeit.

Wechselwirkung von Syntaxin mit einem Kv1.1 Kanal: einen m&ouml;glichen Mechanismus zur Modulation der neuronalen Erregbarkeit.

Recently, we demonstrated that the Kv2.1 channel plays a role in regulated exocytosis of dense-core vesicles (DCVs) through direct interaction of its C terminus with syntaxin 1A, a plasma membrane soluble NSF attachment receptor (SNARE) component. We report here that Kv2.1 interacts with VAMP2, the vesicular SNARE partner that is also present at high concentration in neuronal plasma membrane. This is the first report of VAMP2 interaction with an ion channel. The interaction was demonstrated in brain membranes and characterized using electrophysiological and biochemical analyses in Xenopus oocytes combined with an in vitro binding analysis and protein modeling. Comparative study performed with wild-type and mutant Kv2.1, wild-type Kv1.5, and chimeric Kv1.5N/Kv2.1 channels revealed that VAMP2 enhanced the inactivation of Kv2.1, but not of Kv1.5, via direct interaction with the T1 domain of the N terminus of Kv2.1. Given the proposed role for surface VAMP2 in the regulation of the vesicle cycle and the important role for the sustained Kv2.1 current in the regulation of dendritic calcium entry during high-frequency stimulation, the interaction of VAMP2 with Kv2.1 N terminus may contribute, alongside with the interaction of syntaxin with Kv2.1 C terminus, to the activity dependence of DCV release.

VAMP2 interacts directly with the N terminus of Kv2.1 to enhance channel inactivation.

Vor kurzem wir gezeigt, dass der Kv2.1-Kanal in regulierten Exozytose von dichten Kern Bl&auml;schen (DCVs) durch direkte Interaktion &uuml;ber seine C-Terminus mit Syntaxin 1A, einer Plasmamembran L&ouml;sliches NSF Anlage Rezeptor (SNARE) Komponente eine Rolle spielt. Wir berichten hier, dass Kv2.1 mit VAMP2, den vesikul&auml;ren SNARE-Partner interagiert, die auch in neuronalen Plasmamembran in hoher Konzentration vorhanden ist. Dies ist der erste Bericht der VAMP2 Interaktion mit einem Ionenkanal. Die Interaktion zeigte sich im Gehirn Membranen und gekennzeichnet mit elektrophysiologischen und biochemische Analysen im Xenopus Oocytes in Kombination mit einer in-vitro-Bindung Analyse und Modellierung von Protein. Vergleichsstudie mit Wildtyp und Mutant Kv2.1, Wild-Typ Kv1.5 und Chim&auml;ren Kv1.5N/Kv2.1 Kan&auml;le ergab, dass VAMP2 die Inaktivierung von Kv2.1, nicht aber der Kv1.5, durch direkte Interaktion mit der T1-Dom&auml;ne &uuml;ber den N-Terminus der Kv2.1 verbessert. Angesichts der vorgeschlagene Rolle f&uuml;r Oberfl&auml;che, die VAMP2 in der Verordnung die Vesikel-Zyklus und die wichtige Rolle f&uuml;r die nachhaltige Kv2.1 aktuelle bei der Regulierung der dendritischen Kalzium Eintrag w&auml;hrend der hochfrequenten Stimulation, die Wechselwirkung von VAMP2 mit Kv2.1 N-Terminus kann dazu beitragen, neben die Wechselwirkung verschiedener Syntaxin mit Kv2.1 Carboxyl-Terminus, um die Aktivit&auml;t-Abh&auml;ngigkeit der DCV freigeben.

VAMP2 interagiert direkt mit der Amino-Terminus der Kv2.1 zur Verbesserung der Kanal-Inaktivierung.

Previously, we have demonstrated physical and functional interactions of the voltage-gated potassium channel Kv2.1 with the plasma membrane protein components of the exocytotic SNARE complex, syntaxin 1A, and the t-SNARE, syntaxin 1A/SNAP-25, complex. Importantly, the physical interaction of Kv2.1 with syntaxin was shown to be involved in the facilitation of secretion from PC12 cells, which was independent of potassium currents. Recently, we showed that also VAMP2, the vesicular SNARE, interacts physically and functionally with Kv2.1. Here, we first set out to test the interaction of the full SNARE, syntaxin/SNAP-25/VAMP2, complex with the channel. Using the interaction of VAMP2 with Kv2.1 in Xenopus oocytes as a probe, we showed that coexpression of the t-SNARE complex with VAMP2 abolished the VAMP2 effect on channel inactivation and reduced the amount of VAMP2 that coprecipitated with Kv2.1. Further, in vitro pull down assays showed that the full SNARE complex failed to interact with Kv2.1 N- and C-termini in tandem, in contrast to the individual SNARE components. This suggests that the interactions of the SNARE components with Kv2.1 are abolished upon their recruitment into a full SNARE complex, which does not interact with the channel. Other important findings arising from the in vitro study are that the t-SNARE complex, in addition to syntaxin, interacts with a specific C-terminal channel domain, C1a, shown to mediate the facilitation of release by Kv2.1 and that the presence of Kv2.1 N-terminus has crucial contribution to these interactions. These findings provide important insights into the understanding of the complex molecular events involved in the novel phenomenon of secretion facilitation in neuroendocrine cells by Kv2.1.

Formation of the full SNARE complex eliminates interactions of its individual protein components with the Kv2.1 channel.

Zuvor haben wir physische und funktionale Wechselwirkungen der Spannung-Gating Kaliumkanals Kv2.1 mit der Plasmamembran Proteinkomponenten der exocytotic SNARE-komplexe, Syntaxin 1A, und t-SNARE, Syntaxin 1A/SNAP-25, Komplex gezeigt. Wichtig ist, zeigte die physikalische Wechselwirkung von Kv2.1 mit Syntaxin Erleichterungen bei der Sekretion von PC12 Zellen beteiligt sein, die war unabh&auml;ngig von Kalium Str&ouml;me. Vor kurzem haben wir gezeigt, dass auch VAMP2, die vesikul&auml;re SNARE, interagiert physisch und funktionell mit Kv2.1. Hier zuerst vorhatten um zu testen, das Zusammenspiel von der vollen SNARE, Syntaxin/SNAP-25/VAMP2, komplexe mit dem Kanal. Verwenden das Zusammenspiel von VAMP2 mit Kv2.1 in Xenopus Oocytes als Sonde, wir haben gezeigt, dass Coexpression von t-SNARE Komplex mit VAMP2 die VAMP2 Wirkung auf Kanal Inaktivierung abgeschafft und reduziert die Menge an VAMP2, die coprecipitated mit Kv2.1. Weitere, in-vitro-Pull-down-Tests zeigten, dass der volle SNARE-Komplex mit Kv2.1 N - und C-Termini im Tandem, im Gegensatz zu der einzelnen SNARE-Komponenten interagieren konnte. Dies deutet darauf hin, dass die Interaktionen der SNARE-Komponenten mit Kv2.1 auf ihre Einstellung in eine volle SNARE-Komplex, abgeschafft werden, die keine Interaktion mit dem Kanal bietet. Andere wichtige Erkenntnisse aus der in-vitro-Studie sind, dass eine bestimmte C-terminalen Kanal Dom&auml;ne, C1a, gezeigt, die Erleichterung der Freigabe zu vermitteln durch Kv2.1 der t-SNARE-Komplex, neben Syntaxin, interagiert und dass die Anwesenheit von Kv2.1 N-Terminus entscheidend zur diese Interaktionen hat. Diese Erkenntnisse Einblicke wichtige in das Verst&auml;ndnis der komplexen molekularen Ereignisse das neue Ph&auml;nomen der Sekretion Erleichterung in neuroendokrinen Zellen von Kv2.1 beteiligt.

Bildung von der vollen SNARE-Komplex beseitigt Interaktionen seiner einzelnen Protein-Komponenten mit dem Kv2.1-Kanal.

The Kv1.1 channel that is expressed throughout the central and peripheral nervous system is known to interact with syntaxin 1A, a member of the exocytosis machinery protein complex. This interaction was previously shown to increase the macroscopic currents of the presynaptic Kv1.1 channel when coexpressed in Xenopus oocytes, while it decreased the unitary channel conductance and open probability. This apparent discrepancy has been resolved in this work, using electrophysiological, biochemical, and immunohistochemical analyses in oocytes by overexpression and antisense knockdown of syntaxin. Here, we demonstrate that syntaxin plays a dual role in the modulation of Kv1.1 function: enhancement of the channel's surface expression along with attenuation of single channel ion flux. These findings broaden the scope of channels and transporters that are dually modulated by syntaxin. Although the dual functioning of syntaxin in modulation of Kv1.1 channel activity may seem antagonistic, the combination of the two mechanisms may provide a useful means for fine-tuning axonal excitability and synaptic efficacy.

Syntaxin modulates Kv1.1 through dual action on channel surface expression and conductance.

Der Kv1.1-Kanal, der w&auml;hrend des zentralen und peripheren Nervensystems ausgedr&uuml;ckt wird ist bekannt, dass die Interaktion mit Syntaxin 1A, Mitglied der Exozytose Maschinen Proteinkomplex. Diese Interaktion war zuvor gezeigt, erh&ouml;hen die makroskopische Str&ouml;me von der pr&auml;synaptischen Kv1.1-Kanal, wenn im Xenopus Oocytes, coexpressed, w&auml;hrend es den einheitlichen Kanal Leitwert sank und Wahrscheinlichkeit zu &ouml;ffnen. Diese offensichtliche Diskrepanz wurde in dieser Arbeit, mittels elektrophysiologische, biochemische und immunhistochemische Analysen in Eizellen durch eine &Uuml;berexpression und antisense Niederschlag von Syntaxin behoben. Hier zeigen wir, dass Syntaxin spielt eine Doppelrolle in der Modulation der Kv1.1-Funktion: Verbesserung der Oberfl&auml;che des Senders Ausdruck zusammen mit D&auml;mpfung von einkanaligen Ion Flussmittel. Diese Erkenntnisse erweitern den Anwendungsbereich der Kan&auml;le und Transporter, die sowohl vom Syntaxin moduliert werden. Obwohl das duale Funktionieren des Syntaxin Modulation des Kv1.1 Channel-Aktivit&auml;ten antagonistischen erscheinen mag, kann die Kombination der zwei Mechanismen f&uuml;r die Feineinstellung axonale Erregbarkeit und synaptische Wirksamkeit ein n&uuml;tzliches Mittel vorsehen.

Syntaxine moduliert Kv1.1 durch dual Aktion auf Kanal Oberfl&auml;che Ausdruck und Leitwert.

Interdomain interactions between intracellular N and C termini have been described for various K(+) channels, including the voltage-gated Kv2.1, and suggested to affect channel gating. However, no channel regulatory protein directly affecting N/C interactions has been demonstrated. Most Kv2.1 channel interactions with regulatory factors occur at its C terminus. The vesicular SNARE that is also present at a high concentration in the neuronal plasma membrane, VAMP2, is the only protein documented to affect Kv2.1 gating by binding to its N terminus. As its binding target has been mapped near a site implicated in Kv2.1 N/C interactions, we hypothesized that VAMP2 binding to the N terminus requires concomitant conformational changes in the C terminus, which wraps around the N terminus from the outside, to give VAMP2 access. Here, we first determined that the Kv2.1 N terminus, although crucial, is not sufficient to convey functional interaction with VAMP2, and that, concomitant to its binding to the "docking loop" at the Kv2.1 N terminus, VAMP2 binds to the proximal part of the Kv2.1 C terminus, C1a. Next, using computational biology approaches (ab initio modeling, docking, and molecular dynamics simulations) supported by molecular biology, biochemical, electrophysiological, and fluorescence resonance energy transfer analyses, we mapped the interaction sites on both VAMP2 and Kv2.1 and found that this interaction is accompanied by rearrangements in the relative orientation of Kv2.1 cytoplasmic domains. We propose that VAMP2 modulates Kv2.1 inactivation by interfering with the interaction between the docking loop and C1a, a mechanism for gating regulation that may pertain also to other Kv channels.

Rearrangements in the relative orientation of cytoplasmic domains induced by a membrane-anchored protein mediate modulations in Kv channel gating.

Dom&auml;nen&uuml;bergreifende Interaktionen zwischen intrazellul&auml;re N und C-Termini wurden f&uuml;r verschiedene K(+) Kan&auml;le, einschlie&szlig;lich der Spannung-Gating Kv2.1 und riet dazu, Kanal Anspritzung beeinflussen beschrieben. Jedoch ist kein Kanal regelndes Protein unmittelbar betrifft N/C Wechselwirkungen nachgewiesen. Die meisten Kv2.1 Kanal Interaktionen mit regulatorischen Faktoren auftreten, seine C-Terminus. Die vesikul&auml;re SNARE, die auch bei einer hohen Konzentration in den neuronalen Plasmamembran, VAMP2, ist das einzige Protein dokumentiert um Kv2.1 Anspritzung von Bindung zu seinen N-Terminus zu beeinflussen. Wie seine Bindungsziel nahe einer Website in Kv2.1 N/C Interaktionen verwickelt zugeordnet wurde, vermutete, dass wir, dass VAMP2 Bindung an das N-Terminus gleichzeitige Konformationsver&auml;nderungen in der C-Terminus, die umflie&szlig;t das N-Terminus von au&szlig;en erfordert, VAMP2 Zugang zu verschaffen. Hier haben wir zun&auml;chst festgestellt, dass das Kv2.1 N-Terminus, obwohl entscheidend, nicht ausreicht, funktionelle Interaktion mit VAMP2 und die damit einhergehende seine Bindung an die &quot;docking-Schleife&quot; im Kv2.1-N-Terminus, VAMP2 Bindung an den proximalen Teil von den Kv2.1 C-Terminus, C1a zu vermitteln. Mit Bioinformatik Ans&auml;tzen (ab initio Modellierung, docking und Molekulare Dynamik-Simulationen) von Molekularbiologie, biochemische, elektrophysiologische, und Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer Analysen unterst&uuml;tzt, wir die Interaktion-Seiten auf VAMP2 und Kv2.1 zugeordnet und festgestellt, dass diese Interaktion von Umlagerungen in der relativen Orientierung des Kv2.1 zytoplasmatische Dom&auml;nen begleitet wird. Wir schlagen VAMP2 moduliert Kv2.1 Inaktivierung durch Eingriffe in die Interaktion zwischen den docking-Schleife und C1a, einen Mechanismus f&uuml;r die Anspritzung Verordnung, die auch auf andere Kv-Kan&auml;le beziehen kann.

Umlagerungen in der relativen Orientierung zytoplasmatische Dom&auml;nen durch eine Membran verankerte Proteine vermitteln Modulationen im Kv Kanal Anspritzung induziert.

Localized changes in the composition of axonal cytoplasm (axoplasm) are critical for many biological processes, including axon guidance, responses to injury, neurite outgrowth, and axon-glia interactions. Biochemical and molecular studies of these mechanisms have been heavily focused on in vitro systems because of the difficulty of obtaining subcellular extracts from mammalian tissues in vivo. As in vitro systems might not replicate the in vivo situation, reliable methods of axoplasm extraction from whole nerve would be helpful for mechanistic studies on axons. Here we develop and evaluate a new procedure for preparation of axoplasm from rat peripheral nerve, based on incubation of separated short segements of nerve fascicles in hypotonic medium to separate myelin and lyse nonaxonal structures, followed by extraction of the remaining axon-enriched material. We show that this new procedure reduces serum and glial cell contamination and facilitates proteomic analyses of axonal contents.

Axoplasm isolation from peripheral nerve.

Lokalisierte &Auml;nderungen in der Zusammensetzung der axonalen Zytoplasma (Axoplasm) sind entscheidend f&uuml;r viele biologische Prozesse, einschlie&szlig;lich Axon Anleitung, Antworten zu Verletzungen, Neurit Auswuchs und Axon-Glia Interaktionen. Biochemische und Molekulare Studien dieser Mechanismen haben stark konzentriert auf in-vitro-Systemen wegen der Schwierigkeit, subzellulare Ausz&uuml;ge aus in-vivo S&auml;ugetier-Gewebe zu erhalten. Wie in Vitro Systeme m&ouml;glicherweise nicht repliziert die in-vivo Situation, zuverl&auml;ssige Methoden der Axoplasm Extraktion von ganzen Nerv w&auml;re hilfreich f&uuml;r mechanistische Studien &uuml;ber Axone. Hier wir Entwicklung und Bewertung ein neues Verfahrens zur Vorbereitung der Axoplasm aus Ratte peripherer Nerven, basierend auf einer Bebr&uuml;tungszeit von getrennten kurze Segmente der Nerv Faszikeln hypotones Medium zu trennen Myelin und Nonaxonal Strukturen, gefolgt durch Extraktion des verbleibenden Axon angereicherten Materials aufzul&ouml;sen. Wir zeigen, dass dieses neue Verfahren Serum und Gliazelle Kontamination reduziert und Proteomic Analysen axonale Inhaltsverzeichnis erleichtert.

Axoplasm Isolation von peripheren Nerven.

Investigations of the molecular mechanisms underlying responses to nerve injury have highlighted the importance of axonal transport systems. To obtain a comprehensive view of the protein ensembles associated with axonal transport in injured axons, we analyzed the protein compositions of axoplasm concentrated at ligatures following crush injury of rat sciatic nerve. LC-MS/MS analyses of iTRAQ-labeled peptides from axoplasm distal and proximal to the ligation sites revealed protein ensembles transported in both anterograde and retrograde directions. Variability of replicates did not allow straightforward assignment of proteins to functional transport categories; hence, we performed principal component analysis and factor analysis with subsequent clustering to determine the most prominent injury-related transported proteins. This strategy circumvented experimental variability and allowed the extraction of biologically meaningful information from the quantitative neuroproteomics experiments. 299 proteins were highlighted by principal component analysis and factor analysis, 145 of which correlate with retrograde and 154 of which correlate with anterograde transport after injury. The analyses reveal extensive changes in both anterograde and retrograde transport proteomes in injured peripheral axons and emphasize the importance of RNA binding and translational machineries in the axonal response to injury.

Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.

Untersuchungen &uuml;ber die molekularen Mechanismen Antworten zu Nervenverletzung haben die Bedeutung der axonale Transportsysteme hervorgehoben. Erhalten Sie einen umfassenden &Uuml;berblick &uuml;ber die Protein-Ensembles zugeordnete axonale Transport im verletzten Axone, analysierten wir die Protein-Kompositionen von Axoplasm an Ligaturen nach Crush-Verletzung der Ratte Ischiasnerv konzentriert. LC-MS/MS-Analysen von iTRAQ beschriftete Peptide aus Axoplasm distale und proximale auf die Verbindung, die Websites offenbart Protein-Ensembles in Anterograde und retrograde Richtungen transportiert. Variabilit&auml;t der Wiederholungen erlaubte nicht die einfache Zuordnung von Proteinen zu funktionalen Transport Kategorien; Daher f&uuml;hrten wir Hauptkomponentenanalyse und Faktorenanalyse mit nachfolgenden clustering, um die bekanntesten im Zusammenhang mit Verletzungen transportierten Proteine zu bestimmen. Diese Strategie experimentelle Variabilit&auml;t umgangen und erlaubt die Extraktion von biologisch sinnvolle Informationen aus den quantitativen Neuroproteomics-Experimenten. 299 Proteine wurden durch Hauptkomponentenanalyse und Faktorenanalyse, 145 der welche korrelieren mit retrograde und 154 der welche korrelieren mit Anterograde Transport nach Verletzung hervorgehoben. Die Analysen zeigen umfangreiche Ver&auml;nderungen sowohl Anterograde und retrograde Transport Proteome in verletzten peripheren Axone und betonen die Bedeutung der RNA binden und translational Maschinen die axonale Reaktion auf Verletzungen.

Axonale Transport Proteomics enth&uuml;llt Mobilisierung &Uuml;bersetzung Maschinen zur L&auml;sion Site in verletzten Ischiasnerv.

Retrograde signaling from axon to soma activates intrinsic regeneration mechanisms in lesioned peripheral sensory neurons; however, the links between axonal injury signaling and the cell body response are not well understood. Here, we used phosphoproteomics and microarrays to implicate approximately 900 phosphoproteins in retrograde injury signaling in rat sciatic nerve axons in vivo and approximately 4500 transcripts in the in vivo response to injury in the dorsal root ganglia. Computational analyses of these data sets identified approximately 400 redundant axonal signaling networks connected to 39 transcription factors implicated in the sensory neuron response to axonal injury. Experimental perturbation of individual overrepresented signaling hub proteins, including Abl, AKT, p38, and protein kinase C, affected neurite outgrowth in sensory neurons. Paradoxically, however, combined perturbation of Abl together with other hub proteins had a reduced effect relative to perturbation of individual proteins. Our data indicate that nerve injury responses are controlled by multiple regulatory components, and suggest that network redundancies provide robustness to the injury response.

Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response.

Retrograde Signalisierung von Axon Soma aktiviert systeminterne Regenerierung Mechanismen in lesioned periphere sensorische Neuronen; Allerdings sind die Verbindungen zwischen axonale Sch&auml;digung zu signalisieren und die Zellk&ouml;rper Antwort nicht gut verstanden. Hier haben wir Phosphoproteomics und Microarrays rund 900 Phosphoproteine retrograde Verletzungen signalisieren in Ratte Ischiasnerv Axone in-vivo und etwa 4500 Abschriften der in-vivo als Reaktion auf Verletzung in den Spinalganglien hineinzuziehen. Computational Analysen diese Datens&auml;tze identifiziert rund 400 redundante axonale Signalling verbundenen Netzwerke zu 39 Transkriptionsfaktoren, die die sensorischen Neuron-Reaktion auf axonale Sch&auml;digung in Verbindung gebracht. Experimentelle St&ouml;rung individueller &uuml;berrepr&auml;sentiert Signalling Hub-Proteine, einschlie&szlig;lich Abl, AKT, p38 und Proteinkinase C, betroffen Neurit Auswuchs in sensorischen Neuronen. Paradoxerweise hatte jedoch kombinierte St&ouml;rung von Abl zusammen mit anderen Proteinen Nabe eine geringere Wirkung im Verh&auml;ltnis zu einer St&ouml;rung der einzelnen Proteine. Unsere Daten zeigen, dass Nerven Verletzung Antworten von mehreren regulatorische Komponenten kontrolliert werden und schlagen vor, da&szlig; Netzwerk Entlassungen Robustheit der Verletzung Antwort bieten.

Signalisierung Transkription Netzwerke in der neuronalen retrograde Verletzungen-Antwort.

Ion-mobility mass spectrometry is emerging as a powerful tool for studying the structures of less established protein assemblies. The method provides simultaneous measurement of the mass and size of intact protein assemblies, providing information not only on the subunit composition and network of interactions but also on the overall topology and shape of protein complexes. However, how the experimental parameters affect the measured collision cross-sections remains elusive. Here, we present an extensive systematic study on a range of proteins and protein complexes with differing sizes, structures, and oligomerization states. Our results indicate that the experimental parameters, T-wave height and velocity, influence the determined collision cross-section independently and in opposite directions. Increasing the T-wave height leads to compaction of the protein structures, while higher T-wave velocities lead to their expansion. These different effects are attributed to differences in energy transmission and dissipation rates. Moreover, by analyzing proteins in their native and denatured states, we could identify the lower and upper boundaries of the collision cross-section, which reflect the "maximally packed" and "ultimately unfolded" states. Together, our results provide grounds for selecting optimal experimental parameters that will enable preservation of the nativelike conformation, providing structural information on uncharacterized protein assemblies.

Gas-phase compaction and unfolding of protein structures.

Ion-Mobilit&auml;t-Massenspektrometrie zeichnet sich als ein leistungsf&auml;higes Werkzeug f&uuml;r die Strukturen der weniger etablierten Protein-Assemblys zu studieren. Die Methode erm&ouml;glicht gleichzeitige Messung der Masse und Gr&ouml;&szlig;e des intakten Protein Assemblys, Bereitstellung von Informationen, nicht nur auf die Untereinheit Zusammensetzung und Netzwerk von Interaktionen, sondern auch auf die allgemeine Topologie und Form von Proteinkomplexen. Wie die experimentelle Parameter beeinflussen die gemessenen Kollision Querschnitte bleibt jedoch tr&uuml;gerisch. Hier pr&auml;sentieren wir eine umfassende systematische Studie zu einer Reihe von Proteinen und Proteinkomplexen mit unterschiedlichen Gr&ouml;&szlig;en, Strukturen und Oligomerisierung Staaten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass experimentelle Parameter, T-Wellenh&ouml;he und -Geschwindigkeit, beeinflussen den Querschnitt zielstrebig Kollision unabh&auml;ngig und in entgegengesetzte Richtungen. Erh&ouml;hung der T-Welle-H&ouml;he f&uuml;hrt zur Verdichtung des Protein-Strukturen, w&auml;hrend h&ouml;here T-Welle Geschwindigkeiten ihrer Expansion zur Folge. Unterschiede in der Energie-&Uuml;bertragung und Abbau-Preise werden diese unterschiedlichen Effekte zugeschrieben. Dar&uuml;ber hinaus konnte wir durch Proteine in ihren systemeigenen und denaturiertes analysieren, die unteren und oberen Grenzen der Kollision-Querschnitt, identifizieren, die die &quot;maximal&quot; und zahlreiche &quot;letztlich entfaltet&quot; Staaten widerspiegeln. Unsere Ergebnisse bilden zusammen die Gr&uuml;nde f&uuml;r die Auswahl der optimalen experimentellen Parameter, die Erhaltung der nativelike Konformation, die strukturelle Informationen &uuml;ber uncharakterisiertes Protein Assemblys erm&ouml;glichen.

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Modulation of a brain voltage-gated K+ channel by syntaxin 1A requires the physical interaction of Gbetagamma with the channel. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 12114518	2002
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Kv2.1 channel activation and inactivation is influenced by physical interactions of both syntaxin 1A and the syntaxin 1A/soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor-25 (t-SNARE) complex with t... Molecular pharmacology\| PubMed ID: 15525758	2005
Target soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors (t-SNAREs) differently regulate activation and inactivation gating of Kv2.2 and Kv2.1: Implications on pancreati... Molecular pharmacology\| PubMed ID: 16754785	2006
Vimentin binding to phosphorylated Erk sterically hinders enzymatic dephosphorylation of the kinase. Journal of molecular biology\| PubMed ID: 17046786	2006
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VAMP2 interacts directly with the N terminus of Kv2.1 to enhance channel inactivation. PflÃ¼gers Archiv : European journal of physiology\| PubMed ID: 18542995	2008
Formation of the full SNARE complex eliminates interactions of its individual protein components with the Kv2.1 channel. Biochemistry\| PubMed ID: 18636750	2008
Syntaxin modulates Kv1.1 through dual action on channel surface expression and conductance. Biochemistry\| PubMed ID: 19331362	2009
Rearrangements in the relative orientation of cytoplasmic domains induced by a membrane-anchored protein mediate modulations in Kv channel gating. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 19690160	2009
Axoplasm isolation from peripheral nerve. Developmental neurobiology\| PubMed ID: 19885832	2010
Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve. Molecular & cellular proteomics : MCP\| PubMed ID: 19955087	2010
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Izhak Michaelevski

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