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Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Examination of embryonic myogenesis of two distinct, but functionally related, skeletal muscle dystrophy mutants (mdx and cav-3(-/-)) establishes for the first time that key elements of the pathology of Duchenne muscular dystrophy (DMD) and limb-girdle muscular dystrophy type 1C (LGMD-1c) originate in the disruption of the embryonic cardiac and skeletal muscle patterning processes. Disruption of myogenesis occurs earlier in mdx mutants, which lack a functional form of dystrophin, than in cav-3(-/-) mutants, which lack the Cav3 gene that encodes the protein caveolin-3; this finding is consistent with the milder phenotype of LGMD-1c, a condition caused by mutations in Cav3, and the earlier [embryonic day (E)9.5] expression of dystrophin. Myogenesis is severely disrupted in mdx embryos, which display developmental delays; myotube morphology and displacement defects; and aberrant stem cell behaviour. In addition, the caveolin-3 protein is elevated in mdx embryos. Both cav-3(-/-) and mdx mutants (from E15.5 and E11.5, respectively) exhibit hyperproliferation and apoptosis of Myf5-positive embryonic myoblasts; attrition of Pax7-positive myoblasts in situ; and depletion of total Pax7 protein in late gestation. Furthermore, both cav-3(-/-) and mdx mutants have cardiac defects. In cav-3(-/-) mutants, there is a more restricted phenotype comprising hypaxial muscle defects, an excess of malformed hypertrophic myotubes, a twofold increase in myonuclei, and reduced fast myosin heavy chain (FMyHC) content. Several mdx mutant embryo pathologies, including myotube hypotrophy, reduced myotube numbers and increased FMyHC, have reciprocity with cav-3(-/-) mutants. In double mutant (mdxcav-3(+/-)) embryos that are deficient in dystrophin (mdx) and heterozygous for caveolin-3 (cav-3(+/-)), whereby caveolin-3 is reduced to 50% of wild-type (WT) levels, these phenotypes are severely exacerbated: intercostal muscle fibre density is reduced by 71%, and Pax7-positive cells are depleted entirely from the lower limbs and severely attenuated elsewhere; these data suggest a compensatory rather than a contributory role for the elevated caveolin-3 levels that are found in mdx embryos. These data establish a key role for dystrophin in early muscle formation and demonstrate that caveolin-3 and dystrophin are essential for correct fibre-type specification and emergent stem cell function. These data plug a significant gap in the natural history of muscular dystrophy and will be invaluable in establishing an earlier diagnosis for DMD/LGMD and in designing earlier treatment protocols, leading to better clinical outcome for these patients.

Muscular dystrophy begins early in embryonic development deriving from stem cell loss and disrupted skeletal muscle formation.

Pr&uuml;fung der embryonalen Myogenese von zwei unterschiedlichen, aber verwandeten, Skelettartiger Muskeldystrophie Mutanten (Mdx und cav-3(-/-)) gr&uuml;ndet das erste Mal, dass die Schl&uuml;sselelemente der Pathologie der Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) und Gliederg&uuml;rtel-Muskeldystrophie Typ 1C (LGMD - 1C) ihren Ursprung in der St&ouml;rung der embryonalen Herz- und Skelettmuskulatur Musterung Prozesse. St&ouml;rung der Myogenese wird oben in Mdx-Mutanten, die eine funktionale Form der Dystrophin, als in cav-3(-/-) Mutanten, die das Cav3-gen fehlt, das das Protein Caveolin-3 kodiert, fehlt; Diese Erkenntnis steht im Einklang mit dem milderen Ph&auml;notyp der LGMD - 1C, eine Bedingung, die durch Mutationen im Cav3 und der fr&uuml;heren [embryonalen Tag (E) 9.5] Ausdruck des Dystrophin verursacht. Myogenese ist stark in Mdx-Embryonen, gest&ouml;rt, die Entwicklungsverz&ouml;gerungen anzeigen; Myotube Morphologie und Vertreibung M&auml;ngel; und aberrante Stammzell-Verhalten. Dar&uuml;ber hinaus ist das Protein Caveolin-3 in Mdx-Embryonen erh&ouml;ht. Sowohl die cav-3(-/-) als auch die Mdx-Mutanten (aus E15.5 und E11.5, beziehungsweise) weisen Zellproliferation und Apoptose der embryonalen Myoblasts Myf5-positiv; Abrieb von in-situ Pax7-positivem Myoblasts; und Ersch&ouml;pfung der Pax7 Gesamtprotein in der sp&auml;ten Schwangerschaft. Dar&uuml;ber hinaus haben sowohl die cav-3(-/-) als auch die Mdx-Mutanten Herzfehler. In cav-3(-/-) Mutanten gibt es einen eingeschr&auml;nkteren Ph&auml;notyp, bestehend aus Hypaxial Muskeln M&auml;ngel, ein &Uuml;berma&szlig; an fehlerhaften Hypertrophe Myotubes, eine Verdoppelung in Myonuclei und reduzierte schnell Myosin heavy Chain (FMyHC) Inhalt. Mehrere Pathologien der Mdx-mutant Embryo, einschlie&szlig;lich Myotube Hypotrophy, verringerte Myotube Zahl und erh&ouml;hte FMyHC, Gegenseitigkeit mit cav-3(-/-) Mutanten. Im Doppelzimmer Mutant (Mdxcav-3 (+/-)) Embryonen, die einen Mangel an Dystrophin (Mdx) und Heterozygote f&uuml;r Caveolin-3 (Cav-3 (+/-)), wobei Caveolin-3 auf 50 % der Wildtyp (WT) Ebenen reduziert wird, diese Ph&auml;notypen sind erheblich versch&auml;rft: Musculus intercostalis Muskel-Faser-Dichte ist um 71 % reduziert, und Pax7-positiven Zellen sind vollst&auml;ndig aus den unteren Extremit&auml;ten ersch&ouml;pft und stark abgeschw&auml;cht anderswo; Diese Daten legen nahe, eine kostendeckende anstatt eine mittelbare Rolle f&uuml;r die erh&ouml;hten Caveolin-3-Ebenen, die in Mdx-Embryonen gefunden werden. Diese Daten stellen eine Schl&uuml;sselrolle f&uuml;r Dystrophin in fr&uuml;hen Muskel-Bildung und demonstrieren, Caveolin-3 und Dystrophin f&uuml;r korrekte Fasertyp Spezifikation und emergent Stammzell-Funktion notwendig sind. Diese Daten ist eine bedeutende L&uuml;cke in der Naturgeschichte des Muskeldystrophie anschlie&szlig;en und von unsch&auml;tzbarem Wert bei der Einrichtung einer fr&uuml;heren Diagnosis f&uuml;r DMD/LGMD und bei der Gestaltung der fr&uuml;heren Behandlungsprotokolle, was zu besseren klinischen Ergebnis f&uuml;r diese Patienten.

Dean Larner

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