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Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

We report that the properties of the isotropic to nematic liquid crystalline phase transition of F-actin depend critically on the average filament length. For average filament lengths longer than 2 microm, we confirm previous findings that the phase transition is continuous in both alignment and concentration. For average filament lengths shorter than 2 microm, we show for the first time a first order transition with a clear discontinuity in both alignment and concentration. Tactoidal droplets of coexisting isotropic and nematic phases, differing in concentration by approximately 30%, form over the course of hours and appear to settle into near equilibrium metastable states.

Isotropic to nematic liquid crystalline phase transition of F-actin varies from continuous to first order.

Wir berichten, dass die Eigenschaften der isotropen Nematic liquid kristalline Phase &Uuml;bergang von F-Actin kritisch die durchschnittliche Filament-L&auml;nge abh&auml;ngen. F&uuml;r durchschnittliche Filament L&auml;ngen l&auml;nger als 2 Microm best&auml;tigen wir fr&uuml;here Ergebnisse, dass der Phasen&uuml;bergang kontinuierliche Ausrichtung und Konzentration ist. F&uuml;r durchschnittliche Filament L&auml;ngen k&uuml;rzer als 2 Microm zeigen wir zum ersten Mal einen ersten Auftrag-&Uuml;bergang mit einer klaren Diskontinuit&auml;t in Ausrichtung und Konzentration. Tactoidal-Tr&ouml;pfchen der Koexistenz mit isotropen und nematischen Phasen unterschiedlicher Konzentration um ca. 30 %, bilden im Laufe der Stunden und erscheinen in nahe Gleichgewicht metastabile Staaten Regeln.

Isotrope Nematic Fl&uuml;ssigkeit unterschiedlich kristalline Phasen&uuml;bergang von F-Actin kontinuierlich auf die erste Bestellung.

We report on the observed characteristics of the first-order phase transition of F-actin from the isotropic state to the nematic liquid-crystalline state. Solutions of short average filament length F-actin at appropriate concentrations phase separate to form tactoidal droplets. These tactoids are the result of the minimization of their free energy and show a bipolar director field connecting two opposite poles. The tactoids are shown to form through two distinct mechanisms: nucleation and growth and spinodal decomposition. Both mechanisms produce tactoids with final domain sizes that are of the same order of magnitude. Additionally, analysis of the system shows several features of metastability. The solution can exist in a variety of steady states near equilibrium and can be easily perturbed, settling in one prescribed by the path followed in phase space.

Growth of tactoidal droplets during the first-order isotropic to nematic phase transition of F-actin.

Wir berichten &uuml;ber die beobachteten Merkmale der Phasen&uuml;bergang erster Ordnung des F-Actin vom isotropen Zustand in den Nematic fl&uuml;ssig-kristalline Zustand. L&ouml;sungen der kurze durchschnittliche Filament L&auml;nge F-Actin in geeigneten Konzentrationen Phase trennen, Form Tactoidal Tr&ouml;pfchen. Diese Tactoids entstehen durch die Minimierung der freien Energie und zeigen eine bipolare Direktor Feld verbinden zwei entgegengesetzte Pole. Die Tactoids werden gezeigt, um Form durch zwei verschiedene Mechanismen: Keimbildung, Wachstum und Spinodal Aufspaltung. Beide Mechanismen erzeugen Tactoids mit final Dom&auml;ne-Gr&ouml;&szlig;en, die von der gleichen Gr&ouml;&szlig;enordnung sind. Dar&uuml;ber hinaus zeigt die Analyse des Systems verschiedene Funktionen der Metastabilit&auml;t. Die L&ouml;sung kann in einer Vielzahl von Steady States nahe Gleichgewicht vorhanden sein und kann leicht gest&ouml;rt, Abrechnung in einem vorgeschriebenen Pfad im Phasenraum gefolgt.

Wachstum der Tactoidal Tr&ouml;pfchen in der Pr&auml;dikatenlogik isotrope nematischen Phase &Uuml;bergang von F-Actin.

Precise spatial and temporal regulation of cell adhesion and de-adhesion is critical for dynamic lymphocyte migration. Although a great deal of information has been learned about integrin lymphocyte function-associated antigen (LFA)-1 adhesion, the mechanism that regulates efficient LFA-1 de-adhesion from intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 during T lymphocyte migration is unknown. Here, we show that nonmuscle myosin heavy chain IIA (MyH9) is recruited to LFA-1 at the uropod of migrating T lymphocytes, and inhibition of the association of MyH9 with LFA-1 results in extreme uropod elongation, defective tail detachment, and decreased lymphocyte migration on ICAM-1, without affecting LFA-1 activation by chemokine CXCL-12. This defect was reversed by a small molecule antagonist that inhibits both LFA-1 affinity and avidity regulation, but not by an antagonist that inhibits only affinity regulation. Total internal reflection fluorescence microscopy of the contact zone between migrating T lymphocytes and ICAM-1 substrate revealed that inactive LFA-1 is selectively localized to the posterior of polarized T lymphocytes, whereas active LFA-1 is localized to their anterior. Thus, during T lymphocyte migration, uropodal adhesion depends on LFA-1 avidity, where MyH9 serves as a key mechanical link between LFA-1 and the cytoskeleton that is critical for LFA-1 de-adhesion.

Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration.

Pr&auml;zise r&auml;umliche und zeitliche Regelung der Zelle Adh&auml;sion und de-adhesion ist entscheidend f&uuml;r die dynamische Lymphozyte-Migration. Obwohl viel Informationen &uuml;ber Integrin Lymphozyte Funktion-assoziierte Antigen (LFA)-1 gelernt hat Adh&auml;sion, der Mechanismus, der effiziente LFA-1 regelt de-adhesion aus der Adh&auml;sion Molek&uuml;l (ICAM)-1 bei der T-Lymphozyten-Migration ist unbekannt. Hier zeigen wir, dass ACTB Myosin heavy Chain IIA (MyH9) bei der Uropod von Migration von T-Lymphozyten und Hemmung des Verbandes der MyH9 mit LFA-1 Ergebnissen in extremen Uropod Dehnung, defekte Schwanz Distanziertheit, LFA-1 rekrutiert ist und Lymphozyten Migration auf die ICAM-1, verringerte ohne Beeintr&auml;chtigung der LFA-1 Aktivierung durch Chemokin CXCL-12. Dieser Fehler wurde umgekehrt, durch ein kleines Molek&uuml;l-Antagonisten, der beiden LFA-1-Affinit&auml;t und Gier-Verordnung hemmt, aber nicht durch ein Antagonist hemmt, die nur Affinit&auml;t Verordnung. Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie von der Kontaktzone zwischen Migration von T-Lymphozyten und ICAM-1-Substrat ergab, dass inaktive LFA-1 an der hinteren von polarisierten T-Lymphozyten, selektiv lokalisiert ist, w&auml;hrend aktive LFA-1 an ihren vorderen lokalisiert ist. Daher h&auml;ngt die uropodal Adh&auml;sion w&auml;hrend der T-Lymphozyten Migration von LFA-1 Avidit&auml;t, wo MyH9 dient als eine wichtige mechanische Verbindung zwischen LFA-1 und das Zytoskelett, das kritisch f&uuml;r LFA-1 ist de-adhesion.

ACTB Myosin heavy Chain IIA vermittelt Integrin LFA-1 de-adhesion w&auml;hrend der Migration von T-Lymphozyten.

To reach sites of inflammation, neutrophils execute a series of adhesion and migration events that include transmigration through the vascular endothelium and chemotaxis through the vicinal extracellular matrix until contact is made with the point of injury or infection. These in vivo microenvironments differ in their mechanical properties. Using polyacrylamide gels of physiologically relevant elasticity in the range of 5 to 100 kPa and coated with fibronectin, we tested how neutrophil adhesion, spreading, and migration were affected by substrate stiffness. Neutrophils on the softest gels showed only small changes in spread area, whereas on the stiffest gels they showed a 3-fold increase. During adhesion and migration, the magnitudes of the distortions induced in the gel substrate were independent of substrate stiffness, corresponding to the generation of significantly larger traction stresses on the stiffer gels. Cells migrated more slowly but more persistently on stiffer substrates, which resulted in neutrophils moving greater distances over time despite their slower speeds. The largest tractions were localized to the posterior of migrating neutrophils and were independent of substrate stiffness. Finally, the phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002 obviated the ability to sense substrate stiffness, suggesting that phosphatidylinositol 3-kinase plays a mechanistic role in neutrophil mechanosensing.

Neutrophil morphology and migration are affected by substrate elasticity.

Um Seiten von Entz&uuml;ndung zu erreichen, f&uuml;hren Neutrophilen eine Veranstaltungsreihe Adh&auml;sion und Migration, die Seelenwanderung durch das vaskul&auml;re Endothel und Chemotaxis durch die vicinal extrazellul&auml;re Matrix enthalten, bis die Kontakt mit dem Punkt der Verletzung oder Infektion erfolgt ist. Diese in-vivo Mikroumgebungen unterscheiden sich in ihren mechanischen Eigenschaften. Polyacrylamidgele physiologisch relevanten Elastizit&auml;t im Bereich von 5 bis 100 kPa und beschichtet mit Fibronektin, wir testeten wie neutrophil Adh&auml;sion, ausladend, Migration von Substrat Steifigkeit betroffen waren. Neutrophilen auf die weichsten Gele zeigte nur kleine &Auml;nderungen im Bereich der Verbreitung, w&auml;hrend auf die steifste Gele sie einen 3-Band Anstieg zeigten. W&auml;hrend der Adh&auml;sion und Migration waren die Gr&ouml;&szlig;enordnungen der Verzerrungen induziert in der Gel-Substrat Substrat Steifigkeit, entspricht die Generation der erheblich gr&ouml;&szlig;ere Zugkraft Spannungen auf die steifer Gele unabh&auml;ngig. Zellen migriert langsam aber mehr anhaltend auf steifer Substraten, die Neutrophilen, die gr&ouml;&szlig;ere Entfernungen im Laufe der Zeit trotz ihrer niedrigeren Geschwindigkeiten bewegen gef&uuml;hrt. Die gr&ouml;&szlig;ten Doppeltraktionen waren lokalisiert an den Posterior der Migration von Neutrophilen und waren unabh&auml;ngig vom Substrat Steifigkeit. Schlie&szlig;lich Abschaltzeiten der Phosphatidylinositol-3-Kinase-Hemmer LY294002 die F&auml;higkeit, Sinn Substrat Steifigkeit, was darauf hindeutet, dass diese Phosphatidylinositol-3-Kinase in neutrophile Mechanosensing eine mechanistische Rolle spielt.

Neutrophil Morphologie und Migration sind Substrat Elastizit&auml;t betroffen.

The regulation of cellular traction forces on the extracellular matrix is critical to cell adhesion, migration, proliferation, and differentiation. Diverse lamellar actin organizations ranging from contractile lamellar networks to stress fibers are observed in adherent cells. Although lamellar organization is thought to reflect the extent of cellular force generation, understanding of the physical behaviors of the lamellar actin cytoskeleton is lacking. To elucidate these properties, we visualized the actomyosin dynamics and organization in U2OS cells over a broad range of forces. At low forces, contractile lamellar networks predominate and force generation is strongly correlated to actomyosin retrograde flow dynamics with nominal change in organization. Lamellar networks build âˆ¼60% of cellular tension over rapid time scales. At high forces, reorganization of the lamellar network into stress fibers results in moderate changes in cellular tension over slower time scales. As stress fibers build and tension increases, myosin band spacing decreases and Î±-actinin bands form. On soft matrices, force generation by lamellar networks is unaffected, whereas tension-dependent stress fiber assembly is abrogated. These data elucidate the dynamic and structural signatures of the actomyosin cytoskeleton at different levels of tension and set a foundation for quantitative models of cell and tissue mechanics.

Dynamic and structural signatures of lamellar actomyosin force generation.

Die Verordnung der zellul&auml;ren Traktion Kr&auml;fte an der extrazellul&auml;ren Matrix ist entscheidend f&uuml;r die Zelladh&auml;sion, Migration, Proliferation und Differenzierung. Diverse lamell&auml;re Aktin-Organisationen von kontraktilen lamell&auml;re Netzwerke Fasern zu betonen sind in adh&auml;rente Zellen beobachtet. Obwohl lamell&auml;re Organisation gedacht ist, um das Ausma&szlig; der zellul&auml;ren Streitkr&auml;fteaufwuchs Rechnung zu tragen, fehlt Verst&auml;ndnis der physikalischen Verhalten des lamell&auml;ren Aktin-Zytoskeletts. Um diese Eigenschaften zu erhellen, visualisiert wir die Actomyosin Dynamik und Organisation in U2OS Zellen &uuml;ber einen weiten Kr&auml;fte. Geringe Kr&auml;fte kontraktilen lamell&auml;re Netzwerke vorherrschen und Streitkr&auml;fteaufwuchs ist Actomyosin retrograde Str&ouml;mung Dynamik stark korreliert, mit nominale Ver&auml;nderung der Organisation. Lamellare Netzwerke aufzubauen &sim;60 % der zellul&auml;ren Spannung &uuml;ber rapid Zeitskalen. Bei hohen Kr&auml;fte f&uuml;hrt Reorganisation des lamell&auml;ren Netzes in Spannung Fasern moderate &Auml;nderungen in der zellularen Spannung &uuml;ber langsamere Zeitskalen. Wie Stress Fasern bauen und Spannung erh&ouml;ht, Myosin band Abstand verringert und &alpha;-Actinin B&auml;nder bilden. Auf weichen-Matrizen ist Kraft-Generierung durch lamell&auml;ren Netzwerke unber&uuml;hrt, w&auml;hrend Spannung-abh&auml;ngigen Spannung Faser Versammlung aufgehoben ist. Diese Daten verdeutlichen die dynamischen und strukturellen Signaturen des Zytoskeletts Actomyosin auf verschiedenen Ebenen der Spannung und legen eine Grundlage f&uuml;r die quantitative Modelle der Zellen und Gewebe-Mechanik.

Dynamische und strukturelle Unterschriften der lamell&auml;ren Actomyosin Streitkr&auml;fteaufwuchs.

Focal adhesions (FAs) are the predominant mechanism by which cells mechanically couple to and exert traction forces on their extracellular matrix (ECM). It is widely presumed that FA size is modulated by force to mediate changes in adhesion strength at different levels of cellular tension. However, previous studies seeking correlations between force and FA morphology have yielded variable and often conflicting results. Here we show that a strong correlation between adhesion size and traction force exists only during the initial stages of myosin-mediated adhesion maturation and growth. For mature adhesions, no correlation between traction stress and size is observed. Rather, the tension that is sustained at mature adhesions is more strongly influenced by proximity to the cell edge, with peripheral adhesions transmitting higher tension than adhesions near the cell center. Finally, we show that mature adhesions can withstand sixfold increases in tension without changes in size. Thus, although a strong correlation between adhesion size and mechanical tension is observed during the initial stages of myosin-mediated adhesion maturation, no correlation is observed in mature, elongated adhesions. This work places spatiotemporal constraints on the force-dependent growth of adhesions and provides insight into the mechanical regulation of cell-ECM adhesion.

Spatiotemporal constraints on the force-dependent growth of focal adhesions.

Fokale Adh&auml;sionen (FAs) sind der vorherrschende Mechanismus, durch den Zellen mechanisch zu koppeln und Traktion Kr&auml;fte auf ihrer extrazellul&auml;ren Matrix (ECM) aus&uuml;ben. Es wird allgemein vermutet, dass FA-Gr&ouml;&szlig;e durch Kraft Ver&auml;nderungen Adh&auml;sion St&auml;rke auf verschiedenen Ebenen der zellul&auml;ren Spannung vermitteln moduliert wird. Jedoch haben fr&uuml;here Studien, die Suche nach Korrelationen zwischen Kraft und FA Morphologie Variable und oft widerspr&uuml;chlichen Ergebnissen gef&uuml;hrt. Hier zeigen wir, dass eine starke Korrelation zwischen Adh&auml;sion Gr&ouml;&szlig;e und Traktion Kraft nur w&auml;hrend der Anfangsphase der Myosin-vermittelte Adh&auml;sion Reifung und Wachstum vorhanden ist. F&uuml;r Reife Adh&auml;sionen wird keine Korrelation zwischen Traktion Stress und Gr&ouml;&szlig;e beobachtet. Vielmehr wird die Spannung, die bei Reife Adh&auml;sionen aufrechterhalten wird st&auml;rker durch die N&auml;he an den Rand der Zelle, mit peripheren Adh&auml;sionen, die &Uuml;bertragung von h&ouml;heren Spannungen als Adh&auml;sionen in der N&auml;he der Zelle beeinflusst. Schlie&szlig;lich zeigen wir, dass Reife Adh&auml;sionen Sechsfache Anstieg der Spannung ohne &Auml;nderungen in der Gr&ouml;&szlig;e gewachsen sind. Zwar eine starke Korrelation zwischen Haftung und mechanische Spannungen in der Anfangsphase der Myosin-vermittelte Adh&auml;sion Reifung beobachtet wird, ist somit keine Korrelation in Reife, langgestreckte Adh&auml;sionen beobachtet. Diese Arbeit raumzeitliche Einschr&auml;nkungen auf das Kraft-abh&auml;ngiges Wachstum von Adh&auml;sionen und bietet Einblick in die mechanische Regelung der Zelle-ECM-Adh&auml;sion.

Raumzeitliche Einschr&auml;nkungen f&uuml;r die Kraft-abh&auml;ngiges Wachstum von fokalen Adh&auml;sionen.

Focal adhesion composition and size are modulated in a myosin II-dependent maturation process that controls adhesion, migration, and matrix remodeling. As myosin II activity drives stress fiber assembly and enhanced tension at adhesions simultaneously, the extent to which adhesion maturation is driven by tension or altered actin architecture is unknown. We show that perturbations to formin and Î±-actinin 1 activity selectively inhibited stress fiber assembly at adhesions but retained a contractile lamella that generated large tension on adhesions. Despite relatively unperturbed adhesion dynamics and force transmission, impaired stress fiber assembly impeded focal adhesion compositional maturation and fibronectin remodeling. Finally, we show that compositional maturation of focal adhesions could occur even when myosin II-dependent cellular tension was reduced by 80%. We propose that stress fiber assembly at the adhesion site serves as a structural template that facilitates adhesion maturation over a wide range of tensions. This work identifies the essential role of lamellar actin architecture in adhesion maturation.

Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template.

Fokale Adh&auml;sion Zusammensetzung und Gr&ouml;&szlig;e werden in ein Myosin-II-abh&auml;ngige Reifungsprozess moduliert, die Adh&auml;sion, Migration und Umbau Matrix steuert. Als Aktivit&auml;t der Myosin-II Laufwerke betonen Glasfaser Montage und erh&ouml;hte Spannung bei Adh&auml;sionen gleichzeitig, soweit die Haftung Reifung wird angetrieben durch Spannung oder ver&auml;ndert Aktin-Architektur ist unbekannt. Wir zeigen, dass Perturbationen in Pau und &alpha;-Actinin 1 Aktivit&auml;t selektiv gehemmt Spannung Faser Versammlung bei Adh&auml;sionen aber ein KONTRAKTILER Lamelle beibehalten, die gro&szlig;e Spannung auf Adh&auml;sionen generiert. Trotz relativ unbeirrt Adh&auml;sion-Dynamik und Kraft-&Uuml;bertragung behindert beeintr&auml;chtigt Stress Faser Versammlung fokale Adh&auml;sion kompositorischen Reifung und Fibronektin Umbau. Schlie&szlig;lich zeigen wir, dass kompositorischen Reifung der fokalen Adh&auml;sionen auftreten konnten, selbst wenn Myosin II-abh&auml;ngigen zellul&auml;ren Spannung um 80 % gesenkt wurde. Wir schlagen Stress Glasfaser Montage am Standort Adh&auml;sion als strukturelle Vorlage dient die Adh&auml;sion Reifung &uuml;ber einer breiten Strecke der Spannungen erleichtert. Diese Arbeit identifiziert die wesentliche Rolle der lamell&auml;ren Aktin-Architektur in der Adh&auml;sion Reifung.

Article	Year
Isotropic to nematic liquid crystalline phase transition of F-actin varies from continuous to first order. Physical review letters\| PubMed ID: 17025933	2006
Growth of tactoidal droplets during the first-order isotropic to nematic phase transition of F-actin. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics\| PubMed ID: 17677295	2007
Nonmuscle myosin heavy chain IIA mediates integrin LFA-1 de-adhesion during T lymphocyte migration. The Journal of experimental medicine\| PubMed ID: 18195072	2008
Neutrophil morphology and migration are affected by substrate elasticity. Blood\| PubMed ID: 19491394	2009
Dynamic and structural signatures of lamellar actomyosin force generation. Molecular biology of the cell\| PubMed ID: 21307339	2011
Spatiotemporal constraints on the force-dependent growth of focal adhesions. Biophysical journal\| PubMed ID: 21689521	2011
Tension is required but not sufficient for focal adhesion maturation without a stress fiber template. The Journal of cell biology\| PubMed ID: 22291038	2012

Patrick W. Oakes

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