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Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

The synthesis of 60S ribosomal subunits in Saccharomyces cerevisiae requires Tif6p, the yeast homologue of mammalian eukaryotic translation initiation factor 6 (eIF6). In the present work, we have isolated a protein kinase from rabbit reticulocyte lysates on the basis of its ability to phosphorylate recombinant human eIF6. Mass spectrometric analysis as well as antigenic properties of the purified kinase identified it as casein kinase I. The site of in vitro phosphorylation, which is highly conserved from yeast to mammals, was identified as the serine residues at positions 174 (major site) and 175 (minor site). The homologous yeast protein Tif6p was also phosphorylated in vivo in yeast cells. Mutation of Tif6p at serine-174 to alanine reduced phosphorylation drastically and caused loss of cell growth and viability. When both Ser-174 and Ser-175 were mutated to alanine, phosphorylation of Tif6p was completely abolished. Furthermore, while wild-type Tif6p was distributed both in nuclei and the cytoplasm of yeast cells, the mutant Tif6p (with Ser174Ala and Ser175Ala) became a constitutively nuclear protein. These results suggest that phosphorylatable Ser-174 and Ser-175 play a critical role in the nuclear export of Tif6p.

Phosphorylation of mammalian eukaryotic translation initiation factor 6 and its Saccharomyces cerevisiae homologue Tif6p: evidence that phosphorylation of Tif6p regulates its nucleocytoplasmic distribution and is required for yeast cell growth.

Die Phosphorylierung von S&#xE4;ugetieren eukaryotischen Translations-Initiations-Faktor 6 und die Saccharomyces cerevisiae Homolog Tif6p: Beweise, dass die Phosphorylierung von Tif6p seine nukleozytoplasmatischen Verteilung reguliert und ist f&#xFC;r die Hefe das Zellwachstum ben&#xF6;tigt.

Antibodies, which are produced by B-lineage cells, consist of immunoglobulin heavy (IgH) and light (IgL) chains that have amino-terminal variable regions and carboxy-terminal constant regions. In response to antigens, B cells undergo two types of genomic alterations to increase antibody diversity. Affinity for antigen can be increased by introduction of point mutations into IgH and IgL variable regions by somatic hypermutation. In addition, antibody effector functions can be altered by changing the expressed IgH constant region exons through IgH class switch recombination (CSR). Somatic hypermutation and CSR both require the B-cell-specific activation-induced cytidine deaminase protein (AID), which initiates these reactions through its single-stranded (ss)DNA-specific cytidine deaminase activity. In biochemical assays, replication protein A (RPA), a ssDNA-binding protein, associates with phosphorylated AID from activated B cells and enhances AID activity on transcribed double-stranded (ds)DNA containing somatic hypermutation or CSR target sequences. This AID-RPA association, which requires phosphorylation, may provide a mechanism for allowing AID to access dsDNA targets in activated B cells. Here we show that AID from B cells is phosphorylated on a consensus protein kinase A (PKA) site and that PKA is the physiological AID kinase. Thus, AID from non-lymphoid cells can be functionally phosphorylated by recombinant PKA to allow interaction with RPA and promote deamination of transcribed dsDNA substrates. Moreover, mutation of the major PKA phosphorylation site of AID preserves ssDNA deamination activity, but markedly reduces RPA-dependent dsDNA deamination activity and severely impairs the ability of AID to effect CSR in vivo. We conclude that PKA has a critical role in post-translational regulation of AID activity in B cells.

The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation.

Antik&ouml;rper, die von B-Linie Zellen produziert werden, bestehen aus Immunglobulin schwere (IgH) und leichte (IgL) Ketten, die amino-Terminal Variablen und Konstanten Regionen Carboxy-Terminal haben. In Reaktion auf Antigene werden B-Zellen zwei Arten von genomischen Ver&auml;nderungen, Antik&ouml;rper-Vielfalt zu erh&ouml;hen. Affinit&auml;t f&uuml;r Antigen kann durch Einf&uuml;hrung von Punktmutationen in Nabenschaltungen und IgL Variable Regionen durch somatische Hypermutation erh&ouml;ht werden. Dar&uuml;ber hinaus k&ouml;nnen Antik&ouml;rper-Effektor-Funktionen ge&auml;ndert werden, durch &Auml;ndern der exprimierten IgH constant Region Exons durch IgH Klasse Switch Rekombination (CSR). Somatische Hypermutation und die CSR erfordern das B-Zelle-spezifische Aktivierung induziert Cytidin Desaminase Protein (Hilfe), die diese Reaktionen durch seine einzelstr&auml;ngige (ss) DNA-spezifischen startet Cytidin-Desaminase-Aktivit&auml;t. Bei biochemischen Assays Replikation Protein A (RPA), eine SsDNA-verbindliches Protein, ordnet phosphorylierten Beihilfen von aktivierten B-Zellen und verbessert die Hilfe Aktivit&auml;t auf transkribierte doppelstr&auml;ngige (ds), die DNA, die somatische Hypermutation oder CSR deiner Sequenzen. Diese Hilfe-RPA-Verband, der Phosphorylierung erfordert, kann einen Mechanismus zum Zugang DsDNA Ziele in aktivierten B-Zellen Hilfe d&uuml;rfend vorsehen. Hier zeigen wir, dass Hilfe von B-Zellen auf einem Konsens Protein Kinase A (PKA) Standort phosphoryliert wird und PKA der physiologischen Hilfe-Kinase ist. Hilfe von nicht-lymphoide Zellen kann so funktionell phosphoryliert werden, durch rekombinante PKA Interaktion mit RPA zu erm&ouml;glichen und f&ouml;rdern Deamination transkribierte DsDNA-Substrate. Dar&uuml;ber hinaus Mutation der gro&szlig;en PKA Phosphorylierung Website Hilfe beh&auml;lt SsDNA Deamination Aktivit&auml;t, aber deutlich reduziert RPA-abh&auml;ngige DsDNA Deamination Aktivit&auml;t und stark beeintr&auml;chtigt die F&auml;higkeit der Beihilfen, CSR in-vivo-Effekt. Wir schlie&szlig;en, dass die PKA hat eine entscheidende Rolle in POSTTRANSLATIONELLE Verordnung Beihilfen Aktivit&auml;t in B-Zellen.

Das Beihilfen Antik&ouml;rper Diversifizierung Enzym wird durch Protein Kinase A Phosphorylierung reguliert.

Somatic hypermutation and class-switch-recombination are initiated by the deamination of deoxycytosine in DNA by activation-induced-deaminase, AID. Recently, there has been much research into how AID targets double-stranded DNA in sub-regions of Ig genes, the involvement of co-factors and posttranslational modifications in this process, the co-option of DNA 'repair' mechanisms and AID evolution.

AID in somatic hypermutation and class switch recombination.

Somatische Hypermutation und Klasse-Switch-Rekombination werden von der Deamination des Deoxycytosine in der DNA durch Aktivierung-induzierte-Desaminase, Beihilfen eingeleitet. Vor kurzem gab es viel Forschung in wie Beihilfen Ziele DNA in Teilregionen der Ig-Gene, die Beteiligung von Co-Faktoren und posttranslationale Modifikationen in diesem Prozess doppelstr&auml;ngige, die Kooptation von DNA &#39;Reparieren&#39; Mechanismen und Beihilfen Evolution.

Hilfe bei der somatische Hypermutation und Klasse Switch Rekombination.

Immunoglobulin gene diversification by somatic hypermutation (SHM), class switch recombination (CSR), and gene conversion is dependent upon activation-induced cytidine deaminase (AID). AID is a single-stranded DNA specific cytidine deaminase that is expressed primarily in activated mature B lymphocytes. AID appears to catalyze DNA cytidine deamination of immunoglobulin heavy (IgH) and light chain (IgL) variable region (V) exons and IgH switch (S) region sequences to initiate, respectively, IgH and IgL somatic hypermutation (SHM) and IgH class switch recombination (CSR). Here, we will discuss the implications of recent studies that demonstrate the role of AID phosphorylation in augmenting AID activity with respect to these two processes.

Regulation of activation induced deaminase via phosphorylation.

Immunglobulin-gen-Diversifizierung durch somatische Hypermutation (SHM), Class Switch Rekombination (CSR) und gen Konvertierung ist abh&auml;ngig von Aktivierung induziert Cytidin-Deaminase (AID). Sie ist daher eine einzelstr&auml;ngige DNA-spezifische Cytidin-Desaminase, der vor allem in aktivierten Reifen B-Lymphozyten ausgedr&uuml;ckt wird. Hilfe scheint DNA Cytidin Deamination Immunglobulin-Heavy (IgH) zu katalysieren und leichte Kette (IgL) Variable Region (V) Exons und Nabenschaltungen wechseln (S) Region Sequenzen bzw. IgH und IgL somatische Hypermutation (SHM) und Nabenschaltungen Klasse Switch Rekombination (CSR) zu initiieren. Hier besprechen wir die Auswirkungen der j&uuml;ngsten Studien, die die Rolle der Beihilfe Phosphorylierung in eine Verst&auml;rkung der Hilfen Aktivit&auml;t in Bezug auf diese beiden Prozesse zu veranschaulichen.

Verordnung der Aktivierung induzierten Desaminase &uuml;ber Phosphorylierung.

To mount an optimum immune response, mature B lymphocytes can change the class of expressed antibody from IgM to IgG, IgA, or IgE through a recombination/deletion process termed immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR). CSR requires the activation-induced cytidine deaminase (AID), which has been shown to employ single-stranded DNA as a substrate in vitro. IgH CSR occurs within and requires large, repetitive sequences, termed S regions, which are parts of germ line transcription units (termed "C(H) genes") that are composed of promoters, S regions, and individual IgH constant region exons. CSR requires and is directed by germ line transcription of participating C(H) genes prior to CSR. AID deamination of cytidines in S regions appears to lead to S region double-stranded breaks (DSBs) required to initiate CSR. Joining of two broken S regions to complete CSR exploits the activities of general DNA DSB repair mechanisms. In this chapter, we discuss our current knowledge of the function of S regions, germ line transcription, AID, and DNA repair in CSR. We present a model for CSR in which transcription through S regions provides DNA substrates on which AID can generate DSB-inducing lesions. We also discuss how phosphorylation of AID may mediate interactions with cofactors that facilitate access to transcribed S regions during CSR and transcribed variable regions during the related process of somatic hypermutation (SHM). Finally, in the context of this CSR model, we further discuss current findings that suggest synapsis and joining of S region DSBs during CSR have evolved to exploit general mechanisms that function to join widely separated chromosomal DSBs.

Evolution of the immunoglobulin heavy chain class switch recombination mechanism.

Um eine optimale Immunantwort zu mounten, k&ouml;nnen Reife B-Lymphozyten Klasse exprimierten Antik&ouml;rper vom IgM, IgG, IgA, oder IgE durch einen Prozess der Rekombination/L&ouml;schung genannt Immunglobulin schwere Kette (IgH) Klasse Switch Rekombination (CSR). CSR erfordert Aktivierung induziert Cytidin-Deaminase (AID), nachweislich, einzeln-angeschwemmte DNA als in-vitro-Substrat zu besch&auml;ftigen. IgH CSR erfolgt innerhalb und erfordert gro&szlig;e, repetitive Sequenzen, genannt S-Regionen, die Teile der Keim Transkription Linieneinheiten (genannt &quot;C(H) Gene&quot;) sind, die Promotoren, S Regionen und einzelne Nabenschaltungen constant Region Exons bestehen. CSR erfordert und unter der Regie von Keim Linie Transkription von teilnehmenden C(H)-Genen vor der CSR. Hilfe Deamination von Cytidines in S Regionen scheint zu S/Pausen-Doppelstrang (DSBs) erforderlich, um CSR initiieren f&uuml;hren. Zwei gebrochene S Regionen CSR abgeschlossen beitreten, nutzt die Aktivit&auml;ten der allgemeine DSB DNA-Reparaturmechanismen. In diesem Kapitel besprochen, dass unser aktuellen Wissen &uuml;ber die Funktion des S-Regionen, Keim Linie Transkription, Beihilfen und DNA-Reparatur in CSR. Wir stellen ein Modell f&uuml;r CSR in der Transkription durch S Regionen DNA Substrate bietet auf die Beihilfe DSB-induzierende L&auml;sionen generieren kann. Wir diskutieren auch, wie die Phosphorylierung der Hilfe Interaktionen mit Cofaktoren vermitteln kann, die Erleichterung des Zugangs zu transkribierte S Regionen w&auml;hrend der CSR und transkribierte Variable Regionen w&auml;hrend des zugeh&ouml;rigen Prozesses der somatische Hypermutation (SHM). Schlie&szlig;lich diskutieren wir weiter im Rahmen dieses CSR-Modells, aktuelle Befunde, die darauf, dass die Synapsis und Beitritt S Region DSBs w&auml;hrend CSR entwickelt haben hindeuten, um allgemeine Mechanismen zu nutzen, dass Funktion weithin beitreten chromosomalen DSBs getrennt.

Entwicklung der Immunglobulin-schwere Kette-Klasse wechseln Rekombination Mechanismus.

The biosynthesis of 60 S ribosomal subunits in Saccharomyces cerevisiae requires Tif6p, the yeast homologue of mammalian eIF6. This protein is necessary for the formation of 60 S ribosomal subunits because it is essential for the processing of 35 S pre-rRNA to the mature 25 S and 5.8 S rRNAs. In the present work, using molecular genetic and biochemical analyses, we show that Hrr25p, an isoform of yeast casein kinase I, phosphorylates Tif6p both in vitro and in vivo. Tryptic phosphopeptide mapping of in vitro phosphorylated Tif6p by Hrr25p and (32)P-labeled Tif6p isolated from yeast cells followed by mass spectrometric analysis revealed that phosphorylation occurred on a single tryptic peptide at Ser-174. Sucrose gradient fractionation and coimmunoprecipitation experiments demonstrate that a small but significant fraction of Hrr25p is bound to 66 S preribosomal particles that also contain bound Tif6p. Depletion of Hrr25p from a conditional yeast mutant that fails to phosphorylate Tif6p was unable to process pre-rRNAs efficiently, resulting in significant reduction in the formation of 25 S rRNA. These results along with our previous observations that phosphorylatable Ser-174 is required for yeast cell growth and viability, suggest that Hrr25p-mediated phosphorylation of Tif6p plays a critical role in the biogenesis of 60 S ribosomal subunits in yeast cells.

The Saccharomyces cerevisiae 60 S ribosome biogenesis factor Tif6p is regulated by Hrr25p-mediated phosphorylation.

Die Biosynthese von 60 S ribosomal Untereinheiten in Saccharomyces Cerevisiae erfordert Tif6p, die Hefe-Homolog von S&auml;ugetier-eIF6. Dieses Protein ist notwendig f&uuml;r die Bildung von 60 S ribosomal Untereinheiten, weil es f&uuml;r die Verarbeitung von 35 S Pre-rRNA zum Reifen 25 S und 5,8 S rRNAs notwendig ist. In der vorliegenden Arbeit mit Molekulare genetische und biochemische Analysen, wir zeigen, dass Hrr25p, eine Isoform der Hefe-Kasein-Kinase phosphorylates ich, Tif6p in vitro und in vivo. Tryptic Phosphopeptide Zuordnung von in-vitro-phosphoryliert Tif6p von Hrr25p und (32) P-markierten Tif6p isoliert von Hefezellen, gefolgt von massenspektrometrischen Analyse ergab, dass die Phosphorylierung auf ein einzelnes tryptic Peptid in Ser-174 aufgetreten ist. Saccharose gradient Fraktionierung und Coimmunoprecipitation Experimente zeigen, dass ein kleiner, aber bedeutender Teil der Hrr25p 66 S preribosomal Partikel gebunden ist, die gebundenen Tif6p ebenfalls enthalten. Ersch&ouml;pfung der Hrr25p aus eine bedingte Hefe-Mutante, die nicht Tif6p phosphoryliert konnte Pre-rRNAs effizient verarbeiten was zu erheblichen Verringerung der Bildung von 25 S rRNA. Diese Ergebnisse zusammen mit unserer fr&uuml;heren Beobachtungen phosphorylatable Ser-174 f&uuml;r Hefe-Zellen-Wachstum und Rentabilit&auml;t ben&ouml;tigt wird vorschlagen, dass Hrr25p-vermittelte Phosphorylierung von Tif6p spielt eine wichtige Rolle in der Biogenese von 60 S ribosomale Untereinheiten in Hefezellen.

Der Saccharomyces Cerevisiae 60 S Ribosom Biogenese Faktor Tif6p wird durch Hrr25p-vermittelte Phosphorylierung reguliert.

Interaction of activation-induced cytidine deaminase (AID) with replication protein A (RPA) has been proposed to promote AID access to transcribed double-stranded (ds) DNA during immunoglobulin light chain and heavy chain class switch recombination (CSR). Mouse AID (mAID) interaction with RPA and transcription-dependent dsDNA deamination in vitro requires protein kinase A (PKA) phosphorylation at serine 38 (S38), and normal mAID CSR activity depends on S38. However, zebrafish AID (zAID) catalyzes robust CSR in mouse cells despite lacking an S38-equivalent PKA site. Here, we show that aspartate 44 (D44) in zAID provides similar in vitro and in vivo functionality as mAID S38 phosphorylation. Moreover, introduction of a PKA site into a zAID D44 mutant made it PKA dependent for in vitro activities and restored normal CSR activity. Based on these findings, we generated mAID mutants that similarly function independently of S38 phosphorylation. Comparison of bony fish versus amphibian and mammalian AIDs suggests evolutionary divergence from constitutive to PKA-regulated RPA/AID interaction.

Evolution of phosphorylation-dependent regulation of activation-induced cytidine deaminase.

Zusammenspiel der Aktivierung induziert Cytidin-Deaminase (AID) mit Replikation Protein A (RPA) ist vorgeschlagen worden, um Hilfe Zugang zu transkribierte Doppelstrang-DNA (ds), Immunglobulin-Leichtketten und schwere Kette Klasse Switch Rekombination (CSR) zu f&ouml;rdern. Maus-Hilfe (Magd) Interaktion mit RPA und in-vitro-Transkription-abh&auml;ngige DsDNA Deamination erfordert Protein Kinase A (PKA) Phosphorylierung an Serin 38 (S38), und normale Magd CSR-Aktivit&auml;ten h&auml;ngt S38. Zebrab&auml;rbling Beihilfen (zAID) katalysiert jedoch robuste CSR in Maus-Zellen trotz fehlender eine S38-&Auml;quivalent PKA-Website. Hier zeigen wir bietet das Aspartat 44 (D44) in zAID &auml;hnliche Funktionalit&auml;t f&uuml;r in-vitro und in vivo als Magd S38 Phosphorylierung. Dar&uuml;ber hinaus Einschleppung einer PKA-Website eine zAID D44 Mutante machte es PKA von f&uuml;r die in-vitro-Aktivit&auml;ten und restauriert normale CSR-Aktivit&auml;ten. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse erzielten wir Magd-Mutanten, die unabh&auml;ngig von S38 Phosphorylierung &auml;hnlich funktionieren. Vergleich von Knochenfischen und Amphibien und S&auml;ugetieren AIDs deutet auf evolution&auml;re Abweichung vom konstitutive PKA-regulierten RPA/Hilfe-Interaktion.

Entwicklung der Phosphorylierung-abh&auml;ngige Regelung der Aktivierung induziert Cytidin-Deaminase.

The assembled immunoglobulin genes in the B cells of mice and humans are altered by distinct processes known as class switch recombination (CSR) and somatic hypermutation, leading to diversification of the antibody repertoire. These two DNA modification processes are initiated by the B cell-specific protein factor activation-induced cytidine deaminase (AID). AID is post-translationally modified by phosphorylation at multiple sites, although functional significance during CSR has been implicated only for phosphorylation at serine-38 (S38). Although multiple laboratories have demonstrated that AID function is regulated via phosphorylation at S38, the precise biological role of S38 phosphorylation has been a topic of debate. Here, we discuss our interpretation of the significance of AID regulation via phosphorylation and also discuss how this form of AID regulation may have evolved in higher organisms.

Post-translational regulation of activation-induced cytidine deaminase.

Die montierten Immunglobulin-Gene in die B-Zellen von M&auml;usen und Menschen werden durch unterschiedliche Prozesse bekannt als Klasse Switch Rekombination (CSR) und somatische Hypermutation, zur Diversifizierung der Antik&ouml;rper-Repertoire ver&auml;ndert. Diese beiden DNA-Modifikation-Prozesse werden von B-Zell-spezifische Protein Faktor induziert durch Aktivierung Cytidin Deaminase (AID) initiiert. Hilfe wird post-translationally durch Phosphorylierung an mehreren Standorten ge&auml;ndert, obwohl funktionelle Bedeutung w&auml;hrend der CSR war, nur f&uuml;r die Phosphorylierung an Serin-38 (S38 verwickelt hat). Obwohl mehrere Labors gezeigt haben, dass die Hilfe-Funktion &uuml;ber Phosphorylierung an S38 geregelt ist, ist die genaue biologische Rolle der S38 Phosphorylierung ein Thema der Debatte gewesen. Hier diskutieren wir unsere Interpretation der Bedeutung der Beihilferegelung &uuml;ber Phosphorylierung und auch zu diskutieren, wie diese Form der Beihilferegelung in h&ouml;heren Organismen entwickelt haben.

POSTTRANSLATIONELLE Regulierung der Aktivierung induziert Cytidin-Deaminase.

Activation-induced cytidine deaminase (AID) is a single-stranded (ss) DNA-specific cytidine deaminase that initiates Ig heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) and Ig somatic hypermutation (SHM) by deaminating cytidines within, respectively, IgH switch (S) regions and Ig variable region (V) exons. AID that is phosphorylated on serine residue 38 interacts with replication protein A (RPA), a ssDNA binding protein, to promote deamination of transcribed double-stranded DNA in vitro, which, along with other evidence, suggests that AID may similarly gain access to transcribed S regions and V exons in vivo. However, the physiological role of AID phosphorylation at serine residue 38 (S38), and even the requirement for the S38 residue, with respect to CSR or SHM has been debated. To address this issue, we used gene targeting to generate an endogenous mouse AID locus that produces AID in which S38 is substituted with alanine (AID(S38A)), a mutant form of AID that retains similar catalytic activity on ssDNA as WT AID (AID(WT)). B cells homozygous for the AID(S38A) mutation show substantially impaired CSR and SHM, correlating with inability of AID(S38A) to interact with endogenous RPA. Moreover, mice haploinsufficient for AID(S38A) have even more severely impaired CSR when compared with mice haploinsufficient for AID(WT), with CSR levels reduced to nearly background levels. These results unequivocally demonstrate that integrity of the AID S38 phosphorylation site is required for normal CSR and SHM in mice and strongly support a role for AID phosphorylation at S38 and RPA interaction in regulating CSR and SHM.

Integrity of the AID serine-38 phosphorylation site is critical for class switch recombination and somatic hypermutation in mice.

Aktivierung induziert Cytidin-Deaminase (AID) ist eine einzelstr&auml;ngige (ss) DNA-spezifischen Cytidin-Deaminase, die Ig schwere Kette (IgH) Klasse Switch Rekombination (CSR) und Ig somatische Hypermutation (SHM) von deaminating Cytidines in, bzw. initiiert, IgH-Schalter (S) Regionen und Ig Variable Region (V) Exon. Beihilfen, die auf Serin R&uuml;ckstand 38 phosphoryliert wird, interagiert mit Replikation Protein A (RPA), eine SsDNA verbindliches Protein, Deamination transkribierte doppelstr&auml;ngige DNA in vitro zu f&ouml;rdern, die zusammen mit anderen Beweis vorschl&auml;gt, dass Hilfe ebenso transkribierten Regionen in S und V Exons in-vivo zugreifen kann. Jedoch hat die physiologische Rolle von Beihilfen Phosphorylierung an Serin-R&uuml;ckstand 38 (S38) und sogar die Forderung nach der S38-R&uuml;ckstand in Bezug auf CSR oder SHM diskutiert worden. Um dieses Problem zu beheben, haben wir Gene targeting um eine endogene Maus Hilfe Locus zu generieren, die Beihilfen produziert in dem S38 durch Alanin (AID(S38A)), eine mutierte Form der Hilfe, die &auml;hnliche katalytische Aktivit&auml;t auf SsDNA als WT-Hilfe (AID(WT)). beh&auml;lt ersetzt B-Zellen, die homozygot f&uuml;r die Mutation AID(S38A) zeigen erheblich beeintr&auml;chtigt CSR und SHM, Korrelation mit Unf&auml;higkeit der AID(S38A) Interaktion mit endogenen RPA. Dar&uuml;ber hinaus haben M&auml;use-Haploinsufficient f&uuml;r AID(S38A) noch stark beeintr&auml;chtigte CSR CSR-Ebenen, die auf fast Hintergrundwerte reduziert mit M&auml;use-Haploinsufficient f&uuml;r AID(WT), gegen&uuml;ber. Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die Integrit&auml;t der Site Hilfe S38 Phosphorylierung ist erforderlich f&uuml;r normale CSR und SHM bei M&auml;usen und bef&uuml;rworte eine Rolle f&uuml;r Beihilfen Phosphorylierung an S38 und RPA Interaktion bei der Regulierung von CSR und SHM.

Integrit&auml;t des Standortes Serin-38 Phosphorylierung Hilfe ist wichtig f&uuml;r Klasse Switch Rekombination und somatische Hypermutation in den M&auml;usen.

Human and mouse Ig genes are diversified in mature B-cells by distinct processes known as Ig heavy-chain CSR (class switch recombination) and Ig variable-region exon SHM (somatic hypermutation). These DNA-modification processes are initiated by AID (activation-induced cytidine deaminase), a DNA cytidine deaminase predominantly expressed in activated B-cells. AID is post-transcriptionally regulated via multiple mechanisms, including microRNA regulation, nucleocytoplasmic shuttling, ubiquitination and phosphorylation. Among these regulatory processes, AID phosphorylation at Ser(38) has been a focus of particularly intense study and debate. In the present paper, we discuss recent biochemical and mouse genetic studies that begin to elucidate the functional significance of AID Ser(38) phosphorylation in the context of the evolution of this mode of AID regulation and the potential roles that it may play in activated B-cells during a normal immune response.

Regulation of activation-induced cytidine deaminase DNA deamination activity in B-cells by Ser38 phosphorylation.

Mensch und Maus-Ig-Gene sind diversifiziert in Reifen B-Zellen durch unterschiedliche Prozesse bekannt als Ig schwere Kette CSR (Klasse Switch Rekombination) und Ig Variable-Region Exon SHM (somatische Hypermutation). Diese DNA-Modifikation-Prozesse werden durch Beihilfen (induziert durch Aktivierung Cytidin-Deaminase), ein DNA-Cytidin-Deaminase &uuml;berwiegend ausgedr&uuml;ckt in aktivierten B-Zellen eingeleitet. Hilfe ist post-transcriptionally &uuml;ber mehrere Mechanismen, einschlie&szlig;lich MicroRNA-Verordnung, Nucleocytoplasmic pendelt, Ubiquitination und Phosphorylierung reguliert. Unter dieser regulatorischen Prozesse wurde Hilfe Phosphorylierung an Ser(38) ein Schwerpunkt der besonders intensiven Studiums und des Diskurses. In dem vorliegenden Papier diskutieren wir aktuelle biochemische und Maus genetische Studien, die anfangen, die funktionelle Bedeutung der Beihilfe Ser(38) Phosphorylierung im Zusammenhang mit der Entwicklung dieses Verkehrstr&auml;gers Beihilfenregelung und die m&ouml;glichen Rollen, die es bei aktivierten B-Zellen, w&auml;hrend eine normale Immunantwort spielen kann zu erhellen.

Regelung der Aktivierung induziert Cytidin Desaminase DNA Deamination T&auml;tigkeit in B-Zellen durch Ser38 Phosphorylierung.

Activation-induced cytidine deaminase (AID) initiates immunoglobulin (Ig) heavy-chain (IgH) class switch recombination (CSR) and Ig variable region somatic hypermutation (SHM) in B lymphocytes by deaminating cytidines on template and nontemplate strands of transcribed DNA substrates. However, the mechanism of AID access to the template DNA strand, particularly when hybridized to a nascent RNA transcript, has been an enigma. We now implicate the RNA exosome, a cellular RNA-processing/degradation complex, in targeting AID to both DNA strands. In B lineage cells activated for CSR, the RNA exosome associates with AID, accumulates on IgH switch regions in an AID-dependent fashion, and is required for optimal CSR. Moreover, both the cellular RNA exosome complex and a recombinant RNA exosome core complex impart robust AID- and transcription-dependent DNA deamination of both strands of transcribed SHM substrates in vitro. Our findings reveal a role for noncoding RNA surveillance machinery in generating antibody diversity.

The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.

Aktivierung induziert Cytidin-Deaminase (AID) initiiert Immunglobuline (Ig) schwere-Kette (IgH) Klasse Switch Rekombination (CSR) und Ig Variable Region somatische Hypermutation (SHM) in B-Lymphozyten, indem deaminating Cytidines auf Vorlage und nicht auf Vorlagen basierende Str&auml;nge transkribierte DNA-Substrate. Der Mechanismus der Hilfe Zugang zu der Vorlage-DNA-Strang, wurde insbesondere dann, wenn auf eine entstehende RNA-Transkript hybridisiert ein R&auml;tsel jedoch. Wir jetzt implizieren die RNA Exosome, komplexe zellul&auml;re RNA-Verarbeitung/Abbau, ins Visier nehmen Hilfe an beiden DNA-Str&auml;nge. In B-Linie-Zellen aktiviert f&uuml;r CSR verkn&uuml;pft mit Hilfe der RNA-Exosome, sammelt IgH Switch Regionen in einer Weise Hilfe abh&auml;ngig, und f&uuml;r optimale CSR ist erforderlich. Dar&uuml;ber hinaus vermitteln die komplexen zellul&auml;ren RNA-Exosome und ein rekombinantes RNA Exosome Kernkomplex robuste Beihilfen - und Transkription-abh&auml;ngigen DNA Deamination von beide Str&auml;nge der transkribierten SHM-Substrate, die in-vitro. Unsere Ergebnisse zeigen eine Rolle f&uuml;r nichtkodierende RNA-&Uuml;berwachung-Maschinen bei der Erzeugung von Antik&ouml;rper-Vielfalt.

Die RNA-Exosome zielt auf die Hilfe-Cytidin-Desaminase auf beide Str&auml;nge der transkribierten duplex DNA-Substrate.

The transcription factor BATF controls the differentiation of interleukin 17 (IL-17)-producing helper T cells (T(H)17 cells) by regulating expression of the transcription factor RORÎ³t itself and RORÎ³t target genes such as Il17. Here we report the mechanism by which BATF controls in vivo class-switch recombination (CSR). In T cells, BATF directly controlled expression of the transcription factors Bcl-6 and c-Maf, both of which are needed for development of follicular helper T cells (T(FH) cells). Restoring T(FH) cell activity to Batf(-/-) T cells in vivo required coexpression of Bcl-6 and c-Maf. In B cells, BATF directly controlled the expression of both activation-induced cytidine deaminase (AID) and of germline transcripts of the intervening heavy-chain region and constant heavy-chain region (I(H)-C(H)). Thus, BATF functions at multiple hierarchical levels in two cell types to globally regulate switched antibody responses in vivo.

The transcription factor BATF controls the global regulators of class-switch recombination in both B cells and T cells.

Der Transkriptionsfaktor BATF steuert die Differenzierung der Interleukin 17 (IL-17)-Herstellung von T-Helferzellen (T (H) 17-Zellen) durch Regulierung der Expression des Transkriptionsfaktors ROR&gamma;t Ziel selbst und ROR&gamma;t Gene wie Il17. Hier berichten wir den Mechanismus durch welche, den, den, den BATF Steuerelemente in-vivo-Klasse-Rekombination (CSR) Switch. BATF direkt kontrolliert Ausdruck der Transkription Faktoren im T-Zellen Bcl-6 und c-Maf, die f&uuml;r die Entwicklung des follikul&auml;ren Helfer T Zellen (T(FH)) erforderlich sind. Wiederherstellung T(FH) Zellaktivit&auml;t zu in-vivo-Batf(-/-) T-Zellen ben&ouml;tigt Coexpression von Bcl-6 und c-Maf. In B-Zellen kontrolliert BATF direkt den Ausdruck sowohl Aktivierung induziert Cytidin-Deaminase (AID) und von Keimbahn Mitschriften der eingreifenden Heavy-Kette-Region und st&auml;ndige schwere Kette Region (I(H)-C(H)). So BATF Funktionen bei mehreren Hierarchieebenen in zwei Zelltypen, Global geschaltete Antik&ouml;rperantworten in-vivo zu regulieren.

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Phosphorylation of mammalian eukaryotic translation initiation factor 6 and its Saccharomyces cerevisiae homologue Tif6p: evidence that phosphorylation of Tif6p regulates its nucleocytoplasm... Molecular and cellular biology\| PubMed ID: 12917340	2003
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Uttiya Basu

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