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Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

We demonstrate that Atomic Force Microscopy nanolithography can be used to control effectively the adhesion, growth and interconnectivity of cortical neurons on Au surfaces. We demonstrate immobilization of neurons at well-defined locations on Au surfaces using two different types of patterned proteins: 1) poly-d-lysine (PDL), a positively charged polypeptide used extensively in tissue culture and 2) laminin, a component of the extracellular matrix. Our results show that both PDL and laminin patterns can be used to confine neuronal cells and to control their growth and interconnectivity on Au surfaces, a significant step towards the engineering of artificial neuronal assemblies with well-controlled neuron position and connections.

Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using Atomic Force Microscopy.

Wir zeigen, dass Atomic Force Microscopy Nanolithographie verwendet werden kann, um effektiv zu steuern, die Adh&auml;sion, Wachstum und Interkonnektivit&auml;t kortikale Neuronen auf Au-Oberfl&auml;chen. Wir demonstrieren Immobilisierung von Neuronen in klar definierten Standorten auf Au-Oberfl&auml;chen, die mit zwei verschiedene Arten von gemusterten Proteine: 1) Poly-d-Lysin (PDL), ein positiv geladenes Polypeptid extensiv in Gewebekultur und 2) Laminin, eine Komponente der extrazellul&auml;ren Matrix. Unsere Ergebnisse zeigen, dass PDL und Laminin Muster neuronale Zellen beschr&auml;nken und Steuerung ihres Wachstums und Interkonnektivit&auml;t auf Au Oberfl&auml;chen, ein wesentlicher Baustein f&uuml;r das Engineering von k&uuml;nstlichen neuronalen Assemblys mit kontrollierten Neuron Position und Anschl&uuml;sse verwendet werden k&ouml;nnen.

Positionierung und F&uuml;hrung von Neuronen auf gold Oberfl&auml;chen von gerichtete Versammlung von Proteinen mit Atomic Force Microscopy.

Understanding network development in the brain is of tremendous fundamental importance, but it is immensely challenging because of the complexity of both its architecture and function. The mechanisms of axonal navigation to target regions and the specific interactions with guidance factors such as membrane-bound proteins, chemical gradients, mechanical guidance cues, etc., are largely unknown. A current limitation for the study of neural network formation is the ability to control precisely the connectivity of small groups of neurons. A first step in designing such networks is to understand the "rules" central nervous system (CNS) neurons use to form functional connections with one another. Here we begin to delineate novel rules for growth and connectivity of small numbers of neurons patterned on Au substrates in simplified geometries. These studies yield new insights into the mechanisms determining the organizational features present in intact systems. We use a previously reported atomic force microscopy (AFM) nanolithography method to control precisely the location and growth of neurons on these surfaces. By examining a series of systems with different geometrical parameters, we quantitatively and systematically analyze how neuronal growth depends on these parameters.

Distance dependence of neuronal growth on nanopatterned gold surfaces.

Netzentwicklung im Gehirn zu verstehen ist enorme grundlegend, aber es ist ungemein schwierig aufgrund der Komplexit&auml;t von seiner Architektur und Funktion. Die Mechanismen der axonalen Navigation zu Zielregionen und die spezifischen Wechselwirkungen mit Anleitung Faktoren wie membrangebundener Proteine, chemischen Gradienten, mechanische Anleitung Hinweise usw., sind weitgehend unbekannt. Eine Strombegrenzung zur Erforschung der neuronalen Netzwerkbildung ist die F&auml;higkeit, genau die Anbindung von kleinen Gruppen von Nervenzellen zu steuern. Ein erster Schritt bei der Gestaltung solcher Netzwerke ist zu verstehen, dass die &quot;Regeln&quot; zentrales Nervensystem (ZNS) Neuronen funktionale Verbindungen miteinander verwenden. Hier beginnen wir neuartige Regeln f&uuml;r Wachstum und Konnektivit&auml;t der kleinen Anzahl von Neuronen, die ein Muster auf Au Substrate in vereinfachten Geometrien abzugrenzen. Diese Studien liefern neue Erkenntnisse &uuml;ber die Mechanismen, die Bestimmung der Organisationsfunktionen in intakten Systeme vorhanden. Wir verwenden eine bereits berichtet Rasterkraft Mikroskopie (AFM) Nanolithographie Methode, um genau die Lage und das Wachstum von Neuronen auf diesen Fl&auml;chen steuern. Durch eine Reihe von Systemen mit verschiedenen geometrischen Parameter untersuchen, quantitativ und systematisch analysieren wir wie neuronale Wachstum h&auml;ngt diese Parameter.

Distanz-Abh&auml;ngigkeit der neuronale Wachstum auf Nanopatterned gold-Oberfl&auml;chen.

In many neural culture studies, neurite migration on a flat, open surface does not reflect the three-dimensional (3D) microenvironment in vivo. With that in mind, we fabricated arrays of semiconductor tubes using strained silicon (Si) and germanium (Ge) nanomembranes and employed them as a cell culture substrate for primary cortical neurons. Our experiments show that the SiGe substrate and the tube fabrication process are biologically viable for neuron cells. We also observe that neurons are attracted by the tube topography, even in the absence of adhesion factors, and can be guided to pass through the tubes during outgrowth. Coupled with selective seeding of individual neurons close to the tube opening, growth within a tube can be limited to a single axon. Furthermore, the tube feature resembles the natural myelin, both physically and electrically, and it is possible to control the tube diameter to be close to that of an axon, providing a confined 3D contact with the axon membrane and potentially insulating it from the extracellular solution.

Semiconductor nanomembrane tubes: three-dimensional confinement for controlled neurite outgrowth.

In vielen Studien neuronale Kultur Neurit Migration auf eine flache, reflektiert die offene Oberfl&auml;che nicht die dreidimensionale (3D) Mikromilieu in-vivo. In diesem Sinne wir Arrays von Halbleiter-Rohren mit angespannt Silizium (Si) und Germanium (Ge) Nanomembranen fabriziert und sie als eine Zell-Kultur-Substrat f&uuml;r prim&auml;re kortikale Neuronen angestellt. Unsere Experimente zeigen, dass das SiGe-Substrat und die Rohr-Fertigung f&uuml;r Neuron Zellen biologisch lebensf&auml;hig sind. Wir beobachten auch, dass Neuronen von der Rohr-Topographie, auch in Abwesenheit von Adh&auml;sion Faktoren, angezogen sind und geleitet werden k&ouml;nnen, um die Rohre w&auml;hrend Auswuchs durchlaufen. Verbunden mit selektiven Aussaat von einzelnen Neuronen in der N&auml;he der R&ouml;hre &ouml;ffnen, begrenzt Wachstum innerhalb einer R&ouml;hre auf ein einzelnes Axon. Dar&uuml;ber hinaus die Rohr-Funktion &auml;hnelt der nat&uuml;rlichen Myelin, physikalisch und elektrisch, und es ist m&ouml;glich, der Rohrdurchmesser in der N&auml;he von einem Axon, die einen engen 3D Kontakt mit der Axon-Membran und potenziell Isolier-und es aus der extrazellul&auml;ren L&ouml;sung zu sein zu steuern.

Halbleiter Nanomembrane R&ouml;hren: dreidimensionale Beengtheit f&uuml;r kontrollierte Neurit Auswuchs.

Microtubules (MTs) are capable of entering dendritic spines in mature hippocampal neurons through dynamic polymerization. Although these MT invasions are directly associated with neuronal activity, their function remains unknown. Here we demonstrate in mouse hippocampal neurons that MT entries into spines regulate the increase in postsynaptic density-95 (PSD-95) protein after brain-derived neurotrophic factor (BDNF) treatment. Using multiwavelength total internal reflectance fluorescence microscopy, we show that BDNF prolonged the average MT dwell time in spines and that this effect was dependent on TrkB receptor activation. Further examination revealed that peaks of MT polymerization into spines corresponded to rapid PSD-95 increases in the spine head. Over time, spines targeted by MTs after BDNF application, but not before, showed a robust increase in PSD-95. Conversely, spines completely devoid of MT invasions showed no significant change in the level of PSD-95. Pharmacological inhibition of MT dynamics abolished the BDNF-induced increase in PSD-95. Together, these results support the hypothesis that the well known increase in PSD-95 within spines after BDNF treatment is dependent on MT invasions of dendritic spines. Thus, our study provides a direct link between dynamic MTs and the postsynaptic structure, and provides a functional role for MT invasion of dendritic spines.

BDNF-induced increase of PSD-95 in dendritic spines requires dynamic microtubule invasions.

Mikrotubuli (MTs) k&ouml;nnen dendritische Dornen in Reife Neuronen durch dynamische Polymerisation eingeben. Obwohl diese MT-Invasionen direkt sind im Zusammenhang mit neuronalen Aktivit&auml;t, ihre Funktion ist unbekannt. Hier zeigen wir in Maus-Neuronen, dass MT Eintr&auml;ge in Stacheln die Zunahme postsynaptisches Dichte-95 (PSD-95) Protein nach Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) Behandlung zu Regeln. Verwenden multiwavelength interne Totalreflexion Fluoreszenzmikroskopie, zeigen wir, dass BDNF die durchschnittliche Verweilzeit der MT in Dornen verl&auml;ngert und dieser Effekt TrkB-Rezeptor-Aktivierung abh&auml;ngig war. Weitere Pr&uuml;fung ergab, dass die Gipfel des MT-Polymerisation in Dornen raschen Anstieg der PSD-95 zu der Wirbels&auml;ule-Kopf entsprach. Im Laufe der Zeit Stacheln von MTs nach BDNF Anwendung ausgerichtet, aber nicht vor, zeigten eine robuste Zunahme PSD-95. Umgekehrt zeigte Stacheln v&ouml;llig frei von MT Invasionen keine signifikante Ver&auml;nderung des Niveaus der PSD-95. Pharmakologische Hemmung der MT Dynamik schaffte die BDNF-induzierte Zunahme der PSD-95. Diese Ergebnisse unterst&uuml;tzen gemeinsam die Hypothese, dass die bekannte Zunahme der PSD-95 innerhalb Stacheln nach BDNF Behandlung MT Invasionen dendritische Dornen abh&auml;ngig ist. So unsere Studie stellt eine direkte Verbindung zwischen dynamischen MTs und der postsynaptisches Struktur, und bietet eine funktionale Rolle f&uuml;r MT Invasion dendritische Dornen.

BDNF-induzierte Zunahme der PSD-95 dendritische Dornen erfordert dynamischen Microtubule Invasionen.

Most excitatory synaptic terminals in the brain impinge on dendritic spines. We and others have recently shown that dynamic microtubules (MTs) enter spines from the dendritic shaft. However, a direct role for MTs in long-lasting spine plasticity has yet to be demonstrated and it remains unclear whether MT-spine invasions are directly influenced by synaptic activity. Lasting changes in spine morphology and synaptic strength can be triggered by activation of synaptic NMDA receptors (NMDARs) and are associated with learning and memory processes. To determine whether MTs are involved in NMDAR-dependent spine plasticity, we imaged MT dynamics and spine morphology in live mouse hippocampal pyramidal neurons before and after acute activation of synaptic NMDARs. Synaptic NMDAR activation promoted MT-spine invasions and lasting increases in spine size, with invaded spines exhibiting significantly faster and more growth than non-invaded spines. Even individual MT invasions triggered rapid increases in spine size that persisted longer following NMDAR activation. Inhibition of either NMDARs or dynamic MTs blocked NMDAR-dependent spine growth. Together these results demonstrate for the first time that MT-spine invasions are positively regulated by signaling through synaptic NMDARs, and contribute to long-lasting structural changes in targeted spines.

Dynamic microtubules promote synaptic NMDA receptor-dependent spine enlargement.

Die meisten erregenden synaptischen Terminals im Gehirn beeinflussen auf dendritische Dornen. Wir und andere haben vor kurzem gezeigt, dynamische Mikrotubuli (MTs) Stacheln von der dendritischen Welle eingeben. Jedoch eine direkte Rolle f&uuml;r MTs in dauerhafte Wirbels&auml;ule Plastizit&auml;t muss noch bewiesen werden, und es bleibt unklar, ob MT-Spine Invasionen von synaptischen Aktivit&auml;t direkt beeinflusst werden. Bleibende Ver&auml;nderungen in der Wirbels&auml;ule Morphologie und synaptische St&auml;rke k&ouml;nnen durch Aktivierung der synaptischen NMDA-Rezeptoren (NMDARs) ausgel&ouml;st werden und lernen und Ged&auml;chtnis Prozesse zugeordnet sind. Um festzustellen, ob MTs an NMDAR-abh&auml;ngige Wirbels&auml;ule Plastizit&auml;t beteiligt sind, abgebildet wir MT Dynamik und Wirbels&auml;ule Morphologie im Leben Maus pyramidale Neuronen vor und nach der akuten Aktivierung des synaptischen NMDARs. Synaptische NMDAR Aktivierung bef&ouml;rdert MT-Spine Invasionen und dauerhaften Anstieg der Gr&ouml;&szlig;e der Wirbels&auml;ule, mit &uuml;berfallen Stacheln ausstellen deutlich schneller und mehr Wachstum als Stacheln nicht eingefallen. Sogar einzelne MT Invasionen ausgel&ouml;st raschen Anstieg der Wirbels&auml;ule-Gr&ouml;&szlig;e, die l&auml;ngere folgende NMDAR Aktivierung beibehalten. Hemmung von NMDARs oder dynamische MTs blockiert NMDAR-abh&auml;ngige Wirbels&auml;ule Wachstum. Zusammen diese Ergebnisse zeigen erstmals, die MT-Spine Invasionen positiv f&uuml;r die Signalisierung durch synaptische NMDARs geregelt sind und f&uuml;r langfristige strukturelle Ver&auml;nderungen gezielt Stacheln beitragen.

Article	Year
Positioning and guidance of neurons on gold surfaces by directed assembly of proteins using Atomic Force Microscopy. Biomaterials\| PubMed ID: 19342092	2009
Distance dependence of neuronal growth on nanopatterned gold surfaces. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids\| PubMed ID: 21121598	2011
Semiconductor nanomembrane tubes: three-dimensional confinement for controlled neurite outgrowth. ACS nano\| PubMed ID: 21366271	2011
BDNF-induced increase of PSD-95 in dendritic spines requires dynamic microtubule invasions. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience\| PubMed ID: 22031905	2011
Dynamic microtubules promote synaptic NMDA receptor-dependent spine enlargement. PloS one\| PubMed ID: 22096612	2011

Jason Ballweg

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