decellularization-and-recellularization-of-whole-livers

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

The in vitro production of highly organized collagen fibrils by corneal keratocytes in a three-dimensional scaffold-free culture system presents a unique opportunity for the direct observation of organized matrix formation. The objective of this investigation was to develop such a culture system in a glass substrate (for optical accessibility) and to directly examine the effect of reducing serum and/or increasing insulin on the stratification and secretion of aligned matrix by fourth- to fifth-passage bovine corneal stromal keratocytes. Medium concentrations of 0%, 1%, or 10% fetal bovine serum and 0% or 1% insulin-transferrin-selenium were investigated. High-resolution differential interference contrast microscopy, quick-freeze/deep-etch, and conventional transmission electron microscopy were used to monitor the evolution, morphology, and ultrastructure of the cell-matrix constructs. In a medium containing 1% each of serum and insulin-transferrin-selenium, stromal cells stratified and secreted abundant and locally aligned matrix, generating the thickest cell-matrix constructs (allowing handling with forceps). The results of this study have the potential to significantly advance the field of developmental functional engineering of load-bearing tissues by (i) elucidating cues that modulate in vitro cell secretion of organized matrix and (ii) establishing an optically accessible cell culture system for investigating the mechanism of cell secretion of aligned collagen fibrils.

Effect of serum and insulin modulation on the organization and morphology of matrix synthesized by bovine corneal stromal cells.

Die in-vitro-Erzeugung von straff organisierten Kollagen-Fibrillen durch Hornhaut Keratocytes in einem dreidimensionalen Ger&uuml;st-freie Kultursystem stellt eine einzigartige Gelegenheit f&uuml;r die direkte Beobachtung der organisierten Matrix-Formation. Ziel dieser Untersuchung war, solch eine Kultursystem in einem Glassubstrat (f&uuml;r optische Zug&auml;nglichkeit) zu entwickeln und den Effekt der Verringerung des Serum bzw. Steigerung von Insulin auf die Schichtung und Sekretion ausgerichteten Matrix durch vierten und f&uuml;nften Durchgang bovine Hornhaut stromal Keratocytes direkt zu untersuchen. Mittlere Konzentrationen von 0 %, 1 % oder 10 % Rinderf&ouml;tenserum und 0 % oder 1 % Insulin-Transferrin-Selen wurden untersucht. Hochaufl&ouml;sende differenzielle Interferenz-Kontrast-Mikroskopie, tiefgefroren-Tiefk&uuml;hl-/tief-&Auml;tzung, und konventionelle Transmissionselektronenmikroskopie wurden verwendet, um die Evolution, Morphologie und Ultrastruktur der Zelle-Matrix Konstrukte zu &uuml;berwachen. In einem Medium mit jeweils 1 % Serum und Insulin-Transferrin-Selen Stromale Zellen geschichtet und reichlich abgesondert und lokal ausgerichtet Matrix, generieren die dicksten Zelle-Matrix-Konstrukte (so dass die Behandlung mit einer Pinzette). Die Ergebnisse dieser Studie haben das Potenzial, erheblich voranbringen Bereich Entwicklungsst&ouml;rungen funktionalen Engineering der tragenden Gewebe durch (i) die Hinweise, die in-vitro-Zelle Absonderung von organisierten Matrix zu modulieren und (Ii) die Einrichtung eines optisch zug&auml;nglichen Zellkultursystem zur Untersuchung des Mechanismus der Zelle Sekretion ausgerichteten Kollagen-Fibrillen.

Wirkung von Serum und Insulin Modulation auf die Gestaltung und die Morphologie der Matrix von Rindern Hornhaut stromal Zellen synthetisiert.

There has been great interest in understanding the methods by which collagen-based load-bearing tissue is constructed, grown and maintained in vertebrate animals. To date, the responsibility for this process has largely been placed with mesenchymal fibroblastic cells that are thought to fully control the morphology of load-bearing extracellular matrix (ECM). However, given clear limitations in the ability of fibroblastic cells to precisely place or remove single collagen molecules to sculpt tissue, we have hypothesized that the material itself must play a critical role in the determination of the form of structural ECM. We here demonstrate directly, using live, dynamic, differential interference contrast imaging, that mechanically strained networks of collagen fibrils, exposed to collagenase (Clostridium histolyticum), degrade preferentially. Specifically, unstrained fibrils are removed 'quickly', while strained fibrils persist significantly longer. The demonstration supports the idea that collagen networks are mechanosensitive in that they are stabilized by mechanical strain. Thus, collagen molecules (together with their complement enzymes) may comprise the basis of a smart, load-adaptive, structural material system. This concept has the potential to drastically simplify the assumed role of the fibroblast, which would need only to provide ECM molecules and mechanical force to sculpt collagenous tissue.

Mechanical strain enhances survivability of collagen micronetworks in the presence of collagenase: implications for load-bearing matrix growth and stability.

Es gab gro&szlig;es Interesse an verstehen der Methoden ist mit denen Kollagen-basierten tragenden Gewebe, gewachsen und gepflegt in Wirbeltieren. Bis heute wurde die Verantwortung f&uuml;r diesen Prozess weitgehend mit Mesenchymale fibroblastic Zellen platziert, die gedacht werden, um die volle Kontrolle &uuml;ber der Morphologie der tragenden extrazellul&auml;ren Matrix (ECM). Allerdings haben da klare Einschr&auml;nkungen in der F&auml;higkeit der fibroblastic Zellen genau platzieren oder Entfernen von einzelnen Kollagen Molek&uuml;le um Gewebe zu Formen, wir vermutet, dass das Material selbst eine entscheidende Rolle bei der Festlegung der Form der strukturellen ECM spielen muss. Wir zeigen hier direkt, live, dynamische, differenzielle Interferenz-Kontrast imaging, dass mechanisch gespannte Netze von Kollagen-Fibrillen, ausgesetzt Collagenase (Clostridium Histolyticum), bevorzugt beeintr&auml;chtigen. Insbesondere werden unangestrengt Fibrillen &#39;schnell&#39;, entfernt, w&auml;hrend angespannte Fibrillen signifikant l&auml;nger beibehalten. Die Demonstration unterst&uuml;tzt die Idee, dass Kollagen-Netzwerke Mechanosensitive sind, dass sie durch mechanische Belastung stabilisiert werden. Kollagen-Molek&uuml;le (zusammen mit ihrer Erg&auml;nzung Enzyme) k&ouml;nnen somit die Grundlage f&uuml;r eine intelligente, laden-adaptive, strukturelle Materialsystems umfassen. Dieses Konzept hat das Potenzial, die angenommene Rolle der Fibroblasten, drastisch zu vereinfachen, die m&uuml;ssten nur zum Bereitstellen von ECM-Molek&uuml;le und mechanische Kraft um kollagenen Gewebe zu Formen.

Mechanische Belastung erh&ouml;ht die &Uuml;berlebensf&auml;higkeit des Kollagen-Micronetworks in Anwesenheit von Collagenase: Implikationen f&uuml;r tragende Matrix-Wachstum und Stabilit&auml;t.

The ability to influence the direction of polymerization of a self-assembling biomolecular system has the potential to generate materials with extremely high anisotropy. In biological systems where highly-oriented cellular populations give rise to aligned and often load-bearing tissue such organized molecular scaffolds could aid in the contact guidance of cells for engineered tissue constructs (e.g. cornea and tendon). In this investigation we examine the detailed dynamics of pepsin-extracted type I bovine collagen assembly on a glass surface under the influence of flow between two plates. Differential Interference Contrast (DIC) imaging (60x-1.4NA) with focal plane stabilization was used to resolve and track the growth of collagen aggregates on borosilicate glass for 4 different shear rates (500, 80, 20, and 9s(-1)). The detailed morphology of the collagen fibrils/aggregates was examined using Quick Freeze Deep Etch (QFDE) electron microscopy. Nucleation of fibrils on the glass was observed to occur rapidly (approximately 2 min) followed by continued growth of the fibrils. The growth rates were dependent on flow in a complex manner with the highest rate of axial growth (0.1 micro/s) occurring at a shear rate of 9s(-1). The lowest growth rate occurred at the highest shear. Fibrils were observed to both branch and join during the experiments. The best alignment of fibrils was observed at intermediate shear rates of 20 and 80s(-1). However, the investigation revealed that fibril directional growth was not stable. At high shear rates, fibrils would often turn downstream forming what we term "hooks" which are likely the combined result of monomer interaction with the initial collagen layer or "mat" and the high shear rate. Further, QFDE examination of fibril morphology demonstrated that the assembled fibrillar structure did not possess native D-periodicity. Instead, fibrils comprised a collection of generally aligned, monomers which were self-assembled to form a fibril-like aggregate. In conclusion, though constant shear-rate clearly influences collagen fibrillar alignment, the formation of highly-organized collagenous arrays of native-like D-banded fibrils remains a challenge. Modulation of shear in combination with surface energy patterning to produce a highly-aligned initial mat may provide significant improvement of both the fibril morphology and alignment.

Dynamic shear-influenced collagen self-assembly.

Die M&ouml;glichkeit, Einfluss auf die Richtung der Polymerisationsgrad eines selbstorganisierende Biomolekulare-Systems hat das Potenzial, Materialien mit extrem hohe Anisotropie zu generieren. Steigen in biologischen Systemen, wo hoch-orientierte zellulare Bev&ouml;lkerungen geben, ausgerichtet und oft tragende Gewebe Kontakt Anleitung von Zellen f&uuml;r solche organisierten molekularen Ger&uuml;sten unterst&uuml;tzen k&ouml;nnte engineered Gewebe Konstrukte (z.B. Hornhaut und Sehnen). In dieser Untersuchung untersucht Typ die detaillierte Dynamik von Pepsin-extrahiert I bovinen Kollagen Montage auf einer Glasoberfl&auml;che unter dem Einfluss der Str&ouml;mung zwischen zwei Platten. Differenzieller Interferenzkontrast (DIC) Bildgebung (60 X-1.4NA) mit der Brennebene Stabilisierung wurde verwendet, um zu beheben und verfolgen Sie das Wachstum von Kollagen Aggregate auf Borosilicatglas f&uuml;r 4 verschiedene Scheren-Preise (&quot;500&quot;, &quot;80&quot;, &quot;20&quot; und &quot;9s(-1))&quot;. Die ausf&uuml;hrliche Morphologie der Kollagen-Fibrillen/Aggregate wurde mit Quick Freeze Deep Etch (QFDE)-Elektronenmikroskopie &uuml;berpr&uuml;ft. Keimbildung Fibrillen auf dem Glas wurde beobachtet, anhaltendes Wachstum der Fibrillen schnell auftreten (ca. 2 min.) folgen. Die Zuwachsraten waren flie&szlig;en auf komplexe Weise mit der h&ouml;chsten Wachstumsrate axial (0,1 Mikro/s), die bei einer Schergeschwindigkeit des 9s(-1) abh&auml;ngig. Die niedrigste Wachstumsrate ereignete sich auf der h&ouml;chsten Scherung. Fibrillen wurden w&auml;hrend der Experimente auf Niederlassung und Join beobachtet. Die optimale Ausrichtung der Fibrillen wurde mit zwischengeschalteten Scherung Raten von 20 und 80s(-1) beobachtet. Die Untersuchung ergab jedoch, dass Fibrille gerichtetes Wachstum nicht stabil war. Hohe Scherung raten w&uuml;rde Fibrillen oft wiederum nachgeschaltete bilden was wir Begriff &quot;Haken&quot; die d&uuml;rften das Ergebnis der Monomer Interaktion mit der anf&auml;nglichen Kollagen-Ebene oder &quot;Mat&quot; und die hohe Schergeschwindigkeit. QFDE Pr&uuml;fung der Fibrille Morphologie nachweislich weiter, die versammelten fibrillar Struktur nicht native D-H&auml;ufigkeit besitzen,. Stattdessen umfasst Fibrillen eine Sammlung von allgemein ausgerichteten, Monomere, die monomolekularen ein Aggregat Fibrille-wie zu bilden waren. Obwohl konstanter Schergeschwindigkeit Kollagen fibrillar Ausrichtung deutlich beeinflusst, bleibt die Bildung von kollagenen Arrays hoch organisiert, Native-wie D-geb&auml;ndert Fibrillen abschlie&szlig;end eine Herausforderung. Modulation von Schubkr&auml;ften in Kombination mit Oberfl&auml;chenenergie Musterung produzieren in eine h&ouml;chst ausgerichtete erste Matte kann signifikante Verbesserung sowohl der Ausrichtung der Fibrille Morphologie vorsehen.

Dynamische Scherung beeinflussten Kollagen Selbstmontage.

Mechanical strain or stretch of collagen has been shown to be protective of fibrils against both thermal and enzymatic degradation. The details of this mechanochemical relationship could change our understanding of load-bearing tissue formation, growth, maintenance, and disease in vertebrate animals. However, extracting a quantitative relationship between strain and the rate of enzymatic degradation is extremely difficult in bulk tissue due to confounding diffusion effects. In this investigation, we develop a dynamic, enzyme-induced creep assay and diffusion/reaction rate scaling arguments to extract a lower bound on the relationship between strain and the cutting rate of bacterial collagenase (BC) at low strains. The assay method permits continuous, forced probing of enzyme-induced strain which is very sensitive to degradation rate differences between specimens at low initial strain. The results, obtained on uniaxially loaded strips of bovine corneal tissue (0.1, 0.25, or 0.5 N), demonstrate that small differences in strain alter the enzymatic cutting rate of the BC substantially. It was estimated that a change in tissue elongation of only 1.5% (at approximately 5% strain) reduces the maximum cutting rate of the enzyme by more than half. Estimation of the average load per monomer in the tissue strips indicates that this protective "cutoff" occurs when the collagen monomers are transitioning from an entropic to an energetic mechanical regime. The continuous tracking of the enzymatic cleavage rate as a function of strain during the initial creep response indicates that the decrease in the cleavage rate of the BC is nonlinear (initially steep between 4.5 and 6.5% and then flattens out from 6.5 to 9.5%). The high sensitivity to strain at low strain implies that even lightly loaded collagenous tissue may exhibit significant strain protection. The dynamic, enzyme-induced creep assay described herein has the potential to permit the rapid characterization of collagen/enzyme mechanochemistry in many different tissue types.

Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep.

Hat gezeigt, dass mechanische Belastung oder Strecken von Kollagen sch&uuml;tzenden Fibrillen gegen sowohl thermische als auch enzymatischen Abbau werden. Die Details dieser MECHANOCHEMISCHE Beziehung konnte unser Verst&auml;ndnis der tragenden Gewebe Bildung, Wachstum, Pflege und Krankheit bei Wirbeltieren &auml;ndern. Extrahieren eine quantitative Beziehung zwischen Belastung und die Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaus ist jedoch &auml;u&szlig;erst schwierig, in loser Sch&uuml;ttung Gewebe durch Verluste zuf&uuml;gte Verbreitung Effekte. Bei dieser Untersuchung entwickeln wir eine dynamische, Enzym-induzierte Kriech-Assay und Verbreitung/Reaktion beurteilen Skalierung Argumente eine Untergrenze f&uuml;r die Beziehung zwischen Belastung und die Schneiden-Rate der bakteriellen Collagenase (BC) extrahieren bei geringen Belastungen. Die Assay-Methode erm&ouml;glicht kontinuierliche, erzwungene Sondierung der Enzym-induzierte Belastung, die sehr empfindlich auf Abbau Kursdifferenzen zwischen Proben bei niedrigen anf&auml;ngliche Dehnung ist. Die Ergebnisse, die auf uniaxiale geladene Streifen von Rindern Hornhaut Gewebe (0.1, 0,25 oder 0,5 N), zeigen, dass kleine Unterschiede in der Belastung die enzymatischen schneiden-Rate des BC wesentlich &auml;ndern. Es wurde gesch&auml;tzt, dass eine Ver&auml;nderung im Gewebe-Dehnung von nur 1,5 % (bei ca. 5 % Dehnung) die maximale Schneiden des Enzyms vermindert um mehr als die H&auml;lfte. Sch&auml;tzung der durchschnittlichen Belastung pro Monomer in der Gewebe-Streifen zeigt, dass diese sch&uuml;tzende &quot;Schwellenwertabgrenzung&quot; tritt auf, wenn die Kollagen-Monomere aus einer entropischen zu einer energetischen mechanische Regelung wechseln. Die kontinuierliche Verfolgung der enzymatische Spaltung Rate als Funktion der Belastung w&auml;hrend der anf&auml;nglichen Seitenversatz Antwort zeigt an, dass die Verringerung der Spaltung Rate des BC nichtlineare ist (anfangs steil von 4,5 bis 6,5 % und dann flacht von 6,5 bis 9,5 %). Die hohe Empfindlichkeit bei geringer Dehnung Belastung bedeutet, dass sogar leicht geladen kollagenen Gewebe erhebliche Belastung Schutz aufweisen kann. Der dynamische, induziert durch Enzym-Kriech-Assay hierin beschriebenen hat das Potenzial, die schnelle Charakterisierung von Kollagen/Enzym Mechanochemie in viele verschiedene Gewebearten zu gestatten.

Sondierung Kollagen/Enzym Mechanochemie im nativen Gewebe mit dynamischen, Enzym-induzierte kriechen.

Collagen, a triple-helical, self-organizing protein, is the predominant structural protein in mammals. It is found in bone, ligament, tendon, cartilage, intervertebral disc, skin, blood vessel, and cornea. We have recently postulated that fibrillar collagens (and their complementary enzymes) comprise the basis of a smart structural system which appears to support the retention of molecules in fibrils which are under tensile mechanical strain. The theory suggests that the mechanisms which drive the preferential accumulation of collagen in loaded tissue operate at the molecular level and are not solely cell-driven. The concept reduces control of matrix morphology to an interaction between molecules and the most relevant, physical, and persistent signal: mechanical strain.

Mechanical strain stabilizes reconstituted collagen fibrils against enzymatic degradation by mammalian collagenase matrix metalloproteinase 8 (MMP-8).

Kollagen, ein dreifach-Kegelrad, selbstorganisierende Protein, ist das vorherrschende strukturelle Protein in S&auml;ugetieren. Es findet sich in Knochen, Ligament, Sehnen, Knorpel, Bandscheibe, Haut, Blutgef&auml;&szlig;e und Hornhaut. Wir haben vor kurzem postuliert, dass dieser fibrillar Kollagenase (und ihre erg&auml;nzenden Enzyme) die Basis f&uuml;r ein intelligentes strukturelle System enthalten, die angezeigt wird, die Beibehaltung der Molek&uuml;le in Fibrillen zu unterst&uuml;tzen, die Zugfestigkeit mechanischen Belastungen ausgesetzt sind. Die Theorie besagt, dass die Mechanismen, die die bevorzugte Anh&auml;ufung von Kollagen im geladenen Gewebe fahren auf molekularer Ebene zu betreiben und nicht ausschlie&szlig;lich von der Zelle getrieben. Das Konzept reduziert Kontrolle der Matrix Morphologie auf eine Interaktion zwischen Molek&uuml;len und die meisten relevanten physikalischen und persistente Signal: mechanische Belastung.

Mechanische Belastung stabilisiert rekonstituierten Kollagen-Fibrillen gegen enzymatischen Abbau von S&auml;ugetier-Collagenase-Matrix-Metalloproteasen (MMP-8) 8.

Trauma such as burns induces a hypermetabolic response associated with altered central carbon and nitrogen metabolism. The liver plays a key role in these metabolic changes; however, studies to date have evaluated the metabolic state of liver using ex vivo perfusions or isotope labeling techniques targeted to specific pathways. Herein, we developed a unique mass balance approach to characterize the metabolic state of the liver in situ, and used it to quantify the metabolic changes to experimental burn injury in rats. Rats received a sham (control uninjured), 20% or 40% total body surface area (TBSA) scald burn, and were allowed to develop a hypermetabolic response. One day prior to evaluation, all animals were fasted to deplete glycogen stores. Four days post-burn, blood flow rates in major vessels of the liver were measured, and blood samples harvested. We combined measurements of metabolite concentrations and flow rates in the major vessels entering and leaving the liver with a steady-state mass balance model to generate a quantitative picture of the metabolic state of liver. The main findings were: (1) Sham-burned animals exhibited a gluconeogenic pattern, consistent with the fasted state; (2) the 20% TBSA burn inhibited gluconeogenesis and exhibited glycolytic-like features with very few other significant changes; (3) the 40% TBSA burn, by contrast, further enhanced gluconeogenesis and also increased amino acid extraction, urea cycle reactions, and several reactions involved in oxidative phosphorylation. These results suggest that increasing the severity of injury does not lead to a simple dose-dependent metabolic response, but rather leads to qualitatively different responses. Biotechnol. Bioeng. Â© 2010 Wiley Periodicals, Inc.

In situ metabolic flux analysis to quantify the liver metabolic response to experimental burn injury.

Trauma wie Verbrennungen induziert eine hypermetabolische Antwort mit ver&auml;nderten zentralen Kohlenstoff und Stickstoff-Stoffwechsel verbunden. Die Leber spielt eine zentrale Rolle in dieser metabolischen Ver&auml;nderungen; jedoch haben Studien bisher den metabolischen Zustand der Leber mit ex Vivo Nichtstarter oder Isotope Labelling Techniken gezielt an bestimmte Wege ausgewertet. Hierin, wir einen einzigartigen Massenbilanz Ansatz zur den metabolischen Zustand der Leber, die in-situ Charakterisierung entwickelt, und benutzte es, um die metabolischen &Auml;nderungen an experimentellen brennen Verletzungen bei Ratten zu quantifizieren. Ratten erhielten eine Sham (Steuerelement unverletzt), 20 % oder 40 % gesamt K&ouml;rper Fl&auml;che (TBSA) verbr&uuml;hen brennen und hypermetabolische Reaktion entwickeln durften. Einen Tag vor der Bewertung, wurden alle Tiere gefastet, um die Glykogenvorr&auml;te ersch&ouml;pfen. Vier Tage post-burn, Blut-Durchfluss in gro&szlig;en Gef&auml;&szlig;en der Leber wurden gemessen und Blutproben geerntet. Wir kombinierten Messungen der Metabolit Konzentrationen und Durchflussmengen in die gro&szlig;en Schiffe betreten und verlassen der Leber mit einem station&auml;ren Massenbilanz-Modell um ein quantitatives Bild des metabolischen Zustands der Leber zu generieren. Die wichtigsten Ergebnisse waren: (1) die Sham-verbrannten Tiere ausgestellt eine gluconeogenic Muster, Einklang mit der schnellste Zustand; (2) die 20 % TBSA brennen gehemmt Glukoneogenese und Glykolytische-&auml;hnliche Funktionen mit wenigen wesentlichen &Auml;nderungen ausgestellt; (3) die 40 % TBSA brennen, verbessert hingegen weiter Glukoneogenese und auch erh&ouml;hte Aminos&auml;ure-Extraktion, Harnstoff-Zyklus-Reaktionen und mehrere Reaktionen oxidativen Phosphorylierung beteiligt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nicht zu einer einfachen dosisabh&auml;ngige metabolische Reaktion f&uuml;hrt erh&ouml;hen die Schwere der Verletzungen, sondern vielmehr zu qualitativ unterschiedliche Antworten f&uuml;hrt. Biotechnol. Bioeng. &copy; 2010 Wiley-Zeitschriften, Inc.

In-situ metabolische Flussmittel Analyse die Leber metabolische Reaktion auf experimentellen Quantifizierung brennen Verletzungen.

In vertebrate animals, fibrillar collagen accumulates, organizes, and persists in structures which resist mechanical force. This antidissipative behavior is possibly due to a mechanochemical force-switch which converts collagen from enzyme-susceptible to enzyme-resistant. Degradation experiments on native tissue and reconstituted fibrils suggest that collagen/enzyme kinetics favor the retention of loaded collagen. We used a massively parallel, single molecule, mechanochemical reaction assay to demonstrate that the effect is derivative of molecular mechanics. Tensile loads higher than 3 pN dramatically reduced (10Ã—) the enzymatic degradation rate of recombinant human type I collagen monomers by Clostridium histolyticum compared to unloaded controls. Because bacterial collagenase accesses collagen at multiple sites and is an aggressive cleaver of the collagen triple helical domain, the results suggest that collagen molecular architecture is generally more stable when mechanically strained in tension. Thus the tensile mechanical state of collagen monomers is likely to be correlated to their longevity in tissues. Further, strain-actuated molecular stability of collagen may constitute the fundamental basis of a smart structural mechanism which enhances the ability of animals to place, retain, and load-optimize material in the path of mechanical forces.

Molecular mechanochemistry: low force switch slows enzymatic cleavage of human type I collagen monomer.

In Wirbeltieren fibrillar Kollagen sammelt, organisiert und den Strukturen, die mechanische Kraft zu widerstehen. Dieses Antidissipative Verhalten ist m&ouml;glicherweise aufgrund einer MECHANOCHEMISCHE-Option Force die Kollagen von Enzym-anf&auml;llig f&uuml;r Enzym-resistenten konvertiert. Abbau Experimente auf native Gewebe und rekonstituierten Fibrillen deuten darauf hin, dass die Beibehaltung der geladenen Kollagen Kollagen/Enzym-Kinetik zu beg&uuml;nstigen. Wir verwendet eine massiv parallele, einzelne Molek&uuml;l, MECHANOCHEMISCHE Reaktion Assay um zu zeigen, dass die Ableitung des molekularen Mechanik wirkt. Zugfestigkeit Lasten h&ouml;her als 3 pN drastisch reduziert (10 &times;) die Rate der enzymatischen Abbau der rekombinanten menschlichen Typ I Kollagen Monomere durch Clostridium Histolyticum im Vergleich zu entladen Steuerelemente. Da bakteriellen Collagenase eine aggressive Hackmesser der dreifachen spiralf&ouml;rmige Dom&auml;ne Kollagen ist und greift auf Kollagen an mehreren Standorten, zufolge die Ergebnisse Kollagen molekulare Architektur im allgemeinen best&auml;ndiger, wenn mechanisch in Spannung zu angespannt ist. Somit d&uuml;rfte der Zug-mechanische Zustand der Kollagen-Monomere mit ihrer Langlebigkeit im Gewebe korreliert werden. Weitere Belastung bet&auml;tigt Molekulare Stabilit&auml;t von Kollagen kann die Grundlage eines intelligenten struktureller Mechanismus darstellen, die erh&ouml;ht die F&auml;higkeit der Tiere zu platzieren, behalten und Material im Pfad der mechanischen Kr&auml;fte Auslastung zu optimieren.

Molekulare Mechanochemie: Option niedrige Force verlangsamt enzymatische Spaltung der menschlichen Typ I Kollagen Monomer.

Load-bearing tissues owe their mechanical strength to their highly anisotropic collagenous structure. To date attempts to engineer mechanically strong connective tissue have failed, mainly due to a lack of ability to reproduce the native collagen organization in constructs synthesized by cultured cells in vitro. The ability to influence the orientation of self-assembling collagen molecules to produce highly anisotropic structures has applications ranging from de novo engineering of complex tissues to the production of organized scaffolds for cell culture contact guidance. In this investigation we have used the simple technique of spin-coating to produce highly aligned arrays of collagen fibrils. By a simple modification of the method we have also successfully produced orthogonal collagen lamellae. Alternating collagen lamellae are frequently seen in load-bearing tissues such as cornea, annulus fibrosus, and cortical bone. Culturing of corneal fibroblasts on aligned collagen shows that the cells adopt the organization of fibrils. In this investigation we observed the reversal of fibrillar growth direction or "hook" formation similar to that seen previously in a microfluidic shear flow chamber. Although the results of this investigation clearly show that it is possible to produce small areas (1cm(2)) of collagen fibrils with enough alignment to guide fibroblasts, there is evidence that thin film instabilities are likely to be a significant barrier to producing organized collagen fibrils over larger areas. Successful application of this method to produce highly controlled and organized collagenous structures will require the development of techniques to control thin film instability and will be the subject of future work.

Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement.

Tragende Gewebe verdanken ihre mechanischen Festigkeit ihrer stark anisotrope kollagene Struktur. Bisher sind Versuche, mechanisch stark Bindegewebe Ingenieur gescheitert, vor allem auf eine mangelnde F&auml;higkeit zur Reproduktion von der systemeigenen Kollagen-Organisation in Konstrukten von kultivierten Zellen in vitro synthetisiert. Anwendungen, die von de-Novo-Engineering von komplexen Geweben bis hin zu Herstellung von organisierten Ger&uuml;sten f&uuml;r die Ausrichtung der Zelle-Kultur-Kontakt hat die M&ouml;glichkeit, Einfluss auf die Ausrichtung der Selbstassemblierung Kollagen Molek&uuml;le stark anisotrope Strukturen zu produzieren. In dieser Untersuchung haben wir die einfache Technik der Spin-Coating, um hoch ausgerichtete Arrays von Kollagen-Fibrillen zu produzieren verwendet. Durch eine einfache &Auml;nderung der Methode haben wir auch erfolgreich orthogonal Kollagen Lamellen hergestellt. Abwechselnde Kollagen-Lamellen sind h&auml;ufig in tragenden Gewebe wie Hornhaut, Bandscheibe und kortikalem Knochen sehen. Die Z&uuml;chtung der Kornea Fibroblasten auf ausgerichteten Kollagen zeigt, dass die Zellen den Aufbau Fibrillen &uuml;bernehmen. In dieser Untersuchung beobachteten wir die Umkehrung der Richtung oder &quot;Haken&quot; Formation fibrillar Wachstum wie man zuvor in einer Kammer, Microfluidic Scherung flie&szlig;en. Obwohl die Ergebnisse dieser Untersuchung deutlich zeigen, dass es m&ouml;glich ist, kleine Fl&auml;chen zu produzieren (1cm(2)) Kollagen-Fibrillen mit gen&uuml;gend Ausrichtung, Fibroblasten f&uuml;hren, gibt es Hinweise, dass D&uuml;nnschicht-Instabilit&auml;ten ein ernsthaftes Hindernis f&uuml;r die Herstellung von d&uuml;rften organisiert Kollagen-Fibrillen &uuml;ber gr&ouml;&szlig;ere Bereiche. Erfolgreiche Anwendung dieser Methode sehr kontrollierte und organisierte kollagene Strukturen zu produzieren erfordert die Entwicklung von Techniken zur Steuerung von D&uuml;nnschicht-Instabilit&auml;t und werden Gegenstand der k&uuml;nftigen Arbeiten.

Herstellung von hoch ausgerichtete Kollagen Lamellen durch die Kombination von Schubkraft und D&uuml;nnschicht-Entbindung.

Trauma such as burns induces a hypermetabolic response associated with altered central carbon and nitrogen metabolism. The liver plays a key role in these metabolic changes; however, studies to date have evaluated the metabolic state of liver using ex vivo perfusions or isotope labeling techniques targeted to specific pathways. Herein, we developed a unique mass balance approach to characterize the metabolic state of the liver in situ, and used it to quantify the metabolic changes to experimental burn injury in rats. Rats received a sham (control uninjured), 20% or 40% total body surface area (TBSA) scald burn, and were allowed to develop a hypermetabolic response. One day prior to evaluation, all animals were fasted to deplete glycogen stores. Four days post-burn, blood flow rates in major vessels of the liver were measured, and blood samples harvested. We combined measurements of metabolite concentrations and flow rates in the major vessels entering and leaving the liver with a steady-state mass balance model to generate a quantitative picture of the metabolic state of liver. The main findings were: (1) Sham-burned animals exhibited a gluconeogenic pattern, consistent with the fasted state; (2) the 20% TBSA burn inhibited gluconeogenesis and exhibited glycolytic-like features with very few other significant changes; (3) the 40% TBSA burn, by contrast, further enhanced gluconeogenesis and also increased amino acid extraction, urea cycle reactions, and several reactions involved in oxidative phosphorylation. These results suggest that increasing the severity of injury does not lead to a simple dose-dependent metabolic response, but rather leads to qualitatively different responses.

Trauma wie Verbrennungen induziert eine hypermetabolische Antwort mit ver&auml;nderten zentralen Kohlenstoff und Stickstoff-Stoffwechsel verbunden. Die Leber spielt eine zentrale Rolle in dieser metabolischen Ver&auml;nderungen; jedoch haben Studien bisher den metabolischen Zustand der Leber mit ex Vivo Nichtstarter oder Isotope Labelling Techniken gezielt an bestimmte Wege ausgewertet. Hierin, wir einen einzigartigen Massenbilanz Ansatz zur den metabolischen Zustand der Leber, die in-situ Charakterisierung entwickelt, und benutzte es, um die metabolischen &Auml;nderungen an experimentellen brennen Verletzungen bei Ratten zu quantifizieren. Ratten erhielten eine Sham (Steuerelement unverletzt), 20 % oder 40 % gesamt K&ouml;rper Fl&auml;che (TBSA) verbr&uuml;hen brennen und hypermetabolische Reaktion entwickeln durften. Einen Tag vor der Bewertung, wurden alle Tiere gefastet, um die Glykogenvorr&auml;te ersch&ouml;pfen. Vier Tage post-burn, Blut-Durchfluss in gro&szlig;en Gef&auml;&szlig;en der Leber wurden gemessen und Blutproben geerntet. Wir kombinierten Messungen der Metabolit Konzentrationen und Durchflussmengen in die gro&szlig;en Schiffe betreten und verlassen der Leber mit einem station&auml;ren Massenbilanz-Modell um ein quantitatives Bild des metabolischen Zustands der Leber zu generieren. Die wichtigsten Ergebnisse waren: (1) die Sham-verbrannten Tiere ausgestellt eine gluconeogenic Muster, Einklang mit der schnellste Zustand; (2) die 20 % TBSA brennen gehemmt Glukoneogenese und Glykolytische-&auml;hnliche Funktionen mit wenigen wesentlichen &Auml;nderungen ausgestellt; (3) die 40 % TBSA brennen, verbessert hingegen weiter Glukoneogenese und auch erh&ouml;hte Aminos&auml;ure-Extraktion, Harnstoff-Zyklus-Reaktionen und mehrere Reaktionen oxidativen Phosphorylierung beteiligt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass nicht zu einer einfachen dosisabh&auml;ngige metabolische Reaktion f&uuml;hrt erh&ouml;hen die Schwere der Verletzungen, sondern vielmehr zu qualitativ unterschiedliche Antworten f&uuml;hrt.

Currently available bioreactor systems used by tissue engineers permit either direct, high-magnification observation of cell behavior or application of mechanical loads to growing tissue constructs, but not both simultaneously. Further, in most loading bioreactors, the volume of the dead space is not minimized to reduce the cost associated with perfusion media, exogenous stimulatory/inhibitory agents, proteases, and label. We have designed, developed, and tested a bioreactor that simultaneously satisfies the combined requirements of providing (i) controlled tensile mechanical stimulation, (ii) direct high-magnification imaging capability, and (iii) low dead-space volume. This novel mechanostimulatory (uniaxial tensile loading) bioreactor operates on an inverted microscope and permits continuous optical access (up to 600Ã—) to a loaded, growing construct for extended periods of time (weeks). The reactor employs an adjustable reaction chamber in which the dead space can be reduced to <2â€‰mL. The device has been used to cultivate our human primary corneal fibroblast-derived, tissue-engineered system for up to 14 days. Using the instrument we have successfully recorded (i) the process of fibroblasts populating, growing to confluence, and stratifying on different substrates; (ii) recorded complex and organized cell sheet motions; and (iii) recorded the behavior of a subpopulation of what appear to be degradative/catabolic cells within our fibroblast culture. The device is capable of providing detailed, long-term, dynamic images of mechanically stimulated cell/matrix interaction that have not been observed previously.

Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs.

Derzeit verwendeten Gewebe-Ingenieure zur Verf&uuml;gung Bioreaktor-Systeme erlauben entweder direkt, hoch-Vergr&ouml;&szlig;erung Beobachtung der Zelle Verhalten oder Anwendung von mechanischen l&auml;dt zu wachsenden Gewebe-Konstrukte, aber nicht beides gleichzeitig. Dar&uuml;ber hinaus wird in den meisten laden Bioreaktoren, das Volumen der Totraum nicht minimiert, zur Senkung Perfusion Medien, exogene stimulierende und hemmende Agenten, Proteasen und Label zugeordnet. Wir haben entworfen, entwickelt und getestet von einem Bioreaktor, der gleichzeitig die kombinierten Anforderungen i kontrollierte Zug-mechanische Stimulierung, (Ii) direkte Bildgebung hoch-Vergr&ouml;&szlig;erung-F&auml;higkeit und (Iii) Lautst&auml;rke der Toten-Raum erf&uuml;llt. Diese neuartige Mechanostimulatory (einachsige Zug-laden)-Bioreaktor arbeitet auf einem inversen Mikroskop und erm&ouml;glicht kontinuierlichen optischen Zugang (bis zu 600 &times;), ein geladen, wachsende Konstrukt f&uuml;r l&auml;ngere Zeit (Wochen). Der Reaktor besch&auml;ftigt eine einstellbare Reaktionszelle der Totraum zu reduziert werden kann &lt; 2 mL. Das Ger&auml;t wurde eingesetzt, unsere menschlichen Hornhaut Fibroblast-abgeleitet, Tissue-engineered Hauptsystems f&uuml;r bis zu 14 Tage zu kultivieren. Mit Hilfe des Instruments, haben wir erfolgreich aufgezeichnet (i) den Prozess der Fibroblasten auff&uuml;llen, w&auml;chst bis M&uuml;ndung und Schichten auf unterschiedlichen Substraten; (Ii) Komplex und organisierten Zelle Blatt Bewegungen aufgezeichnet; und (Iii) erfasst das Verhalten einer Teilgesamtheit von scheinbar Degradations/katabolischen Zellen innerhalb unserer Fibroblastenkultur. Das Ger&auml;t kann detaillierte, langfristige, dynamische Bilder der mechanisch stimuliert Zelle/Matrix-Interaktion, die bisher nicht beobachtet wurden.

Article	Year
Effect of serum and insulin modulation on the organization and morphology of matrix synthesized by bovine corneal stromal cells. Tissue engineering. Part A\| PubMed ID: 19480568	2009
Mechanical strain enhances survivability of collagen micronetworks in the presence of collagenase: implications for load-bearing matrix growth and stability. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences\| PubMed ID: 19657003	2009
Dynamic shear-influenced collagen self-assembly. Biomaterials\| PubMed ID: 19765820	2009
Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids\| PubMed ID: 20429513	2010
Mechanical strain stabilizes reconstituted collagen fibrils against enzymatic degradation by mammalian collagenase matrix metalloproteinase 8 (MMP-8). PloS one\| PubMed ID: 20808784	2010
In situ metabolic flux analysis to quantify the liver metabolic response to experimental burn injury. Biotechnology and bioengineering\| PubMed ID: 21077107	2010
Molecular mechanochemistry: low force switch slows enzymatic cleavage of human type I collagen monomer. Journal of the American Chemical Society\| PubMed ID: 21348512	2011
Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta biomaterialia\| PubMed ID: 21362500	2011
In situ metabolic flux analysis to quantify the liver metabolic response to experimental burn injury. Biotechnology and bioengineering\| PubMed ID: 21404258	2011
Design and performance of an optically accessible, low-volume, mechanobioreactor for long-term study of living constructs. Tissue engineering. Part C, Methods\| PubMed ID: 21413901	2011

Nima Saeidi

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