assessing-neural-stem-cell-motility-using-an-agarose-gel-based

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

We have developed a prototype three-channel microfluidic chip that is capable of generating a linear concentration gradient within a microfluidic channel and is useful in the study of bacterial chemotaxis. The linear chemical gradient is established by diffusing a chemical through a porous membrane located in the side wall of the channel and can be established without through-flow in the channel where cells reside. As a result, movement of the cells in the center channel is caused solely by the cells chemotactic response and not by variations in fluid flow. The advantages of this microfluidic chemical linear gradient generator are (i) its ability to produce a static chemical gradient, (ii) its rapid implementation, and (iii) its potential for highly parallel sample processing. Using this device, wildtype Escherichia coli strain RP437 was observed to move towards an attractant (e.g., l-asparate) and away from a repellent (e.g., glycerol) while derivatives of RP437 that were incapable of motility or chemotaxis showed no bias of the bacteria's distribution. Additionally, the degree of chemotaxis could be easily quantified using this assay in conjunction with fluorescence imaging techniques, allowing for estimation of the chemotactic partition coefficient (CPC) and the chemotactic migration coefficient (CMC). Finally, using this approach we demonstrate that E. coli deficient in autoinducer-2-mediated quorum sensing respond to the chemoattractant l-aspartate in a manner that is indistinguishable from wildtype cells suggesting that chemotaxis is insulated from this mode of cell-cell communication.

A three-channel microfluidic device for generating static linear gradients and its application to the quantitative analysis of bacterial chemotaxis.

Wir haben einen Prototyp 3-Kanal Microfluidic Chip entwickelt, der ist f&auml;hig einen linearen Farbverlauf Konzentration innerhalb einer mikrofluidische-Kanal erzeugen und eignet sich die Untersuchung der bakteriellen Chemotaxis. Chemische linearen Farbverlaufs wird durch eine Chemikalie durch eine por&ouml;se Membran befindet sich in der Seitenwand des Kanals zu einer Diffusion und hergestellt werden kann, ohne durch-Flow in den Kanal, in denen sich Zellen befinden. Dadurch wird die Bewegung der Zellen in den Center-Kanal ausschlie&szlig;lich durch die chemotaktische Reaktion der Zellen und nicht durch Schwankungen der Fl&uuml;ssigkeitsstr&ouml;mung verursacht. Die Vorteile dieser mikrofluidische chemische linear gradient Generator sind (i) ihre F&auml;higkeit, einem statischen chemischen Gradienten, (Ii) seiner raschen Umsetzung und (Iii) ihr Potenzial f&uuml;r hochgradig parallel Probenbearbeitung zu produzieren. Mit diesem Ger&auml;t, zeigte Wildtyp Escherichia-coli-Stamm, die RP437 beobachtet wurde, verschieben in Richtung einer Lockstoff (z.B. l-Asparate) und Weg von einer abweisenden (z. B. Glycerin) w&auml;hrend Derivate des RP437, die Motilit&auml;t oder Chemotaxis unf&auml;hig waren keine Voreingenommenheit der Bakterien-Distribution. Dar&uuml;ber hinaus k&ouml;nnte der Grad der Chemotaxis leicht mit dieser Probe in Verbindung mit Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren, zulassend Sch&auml;tzung der chemotaktische Verteilungskoeffizient (CPC) und die chemotaktische Migration-Koeffizient (CMC) quantifiziert werden. Schlie&szlig;lich zeigen mit diesem Ansatz wir, dass E. Coli einen Mangel an Autoinducer-2-vermittelten Quorum sensing reagieren auf die anziehenden l-Aspartat in einer Weise, die nicht von Wildtyp-Zellen, die darauf hindeutet, dass die Chemotaxis von diesem Modus der Zell-Zell-Kommunikation isoliert ist.

Ein drei-Kanal-Microfluidic-Ger&auml;t zur Erzeugung von statischen linearen Farbverl&auml;ufen und ihre Anwendung auf die Quantitative Analyse der bakteriellen Chemotaxis.

An ability to monitor bacterial locomotion and collective dynamics is crucial to our understanding of a number of well-characterized phenotypes including biofilm formation, chemotaxis, and virulence. Here, we report the tracking of multiple swimming Escherichia coli cells in three spatial dimensions and at single-cell resolution using a novel three-dimensional (3D) defocused particle tracking (DPT) method. The 3D trajectories were generated for wild-type Escherichia coli strain RP437 as well as for isogenic derivatives that display smooth swimming due to a cheA deletion (strain RP9535) or incessant tumbling behavior due to a cheZ deletion (strain RP1616). The 3D DPT method successfully differentiated these three modes of locomotion and allowed direct calculation of the diffusion coefficient for each strain. As expected, we found that the smooth swimmer diffused more readily than the wild type, and both the smooth swimmer and the wild-type cells exhibited diffusion coefficients that were at least two orders of magnitude larger than that of the tumbler. Finally, we found that the diffusion coefficient increased with increasing cell density, a phenomenon that can be attributed to the hydrodynamic disturbances caused by neighboring bacteria.

Collective bacterial dynamics revealed using a three-dimensional population-scale defocused particle tracking technique.

Eine M&ouml;glichkeit, bakterielle Fortbewegung und kollektive Dynamik zu &uuml;berwachen ist entscheidend f&uuml;r unser Verst&auml;ndnis f&uuml;r eine Reihe von gut charakterisierten Ph&auml;notypen einschlie&szlig;lich Biofilm Formation, Chemotaxis und Virulenz. Hier berichten wir &uuml;ber die Verfolgung von mehreren Schwimmen Escherichia coli Zellen in drei Raumdimensionen und bei einzelligen Aufl&ouml;sung mithilfe eines Romans, die dreidimensionale (3D), Unscharf gestellt Partikel tracking (DPT)-Methode. Die 3D Trajektorien f&uuml;r Wildtyp Escherichia coli Stamm RP437 sowie f&uuml;r isogene Derivate, die glatte Schwimmen wegen einer CheA-L&ouml;schung (Stamm RP9535) oder unaufh&ouml;rlichen taumelnde Verhalten aufgrund von anzeigen generiert wurden ein cheZ l&ouml;schen (Stamm RP1616). Die 3D DPT-Methode erfolgreich differenziert diese drei Modi der Fortbewegung und erlaubt direkte Berechnung des Diffusionskoeffizienten f&uuml;r jede Sorte. Wie erwartet, fanden wir, dass der reibungslose Schwimmer leichter als der Wildtyp und sowohl der reibungslose Schwimmer verbreitet und die Wild-Typ-Zellen ausgestellt Diffusionskoeffizienten, die mindestens zwei Gr&ouml;&szlig;enordnungen gr&ouml;&szlig;er als die von den Tumbler waren. Schlie&szlig;lich fanden wir, dass der Diffusionskoeffizient erh&ouml;ht sich mit zunehmender Zelldichte, ein Ph&auml;nomen, das die hydrodynamischen St&ouml;rungen verursacht durch benachbarte Bakterien zugeschrieben werden kann.

Gemeinsame bakterielle Dynamik offenbart ein dreidimensionales Bev&ouml;lkerung-Skala Defokussiert Teilchen tracking-Technik mit.

Xylella fastidiosa, a bacterium responsible for Pierce's disease in grapevines, possesses both type I and type IV pili at the same cell pole. Type IV pili facilitate twitching motility, and type I pili are involved in biofilm development. The adhesiveness of the bacteria and the roles of the two pili types in attachment to a glass substratum were evaluated using a microfluidic flow chamber in conjunction with pilus-defective mutants. The average adhesion force necessary to detach wild-type X. fastidiosa cells was 147 +/- 11 pN. Mutant cells possessing only type I pili required a force of 204 +/- 22 pN for removal, whereas cells possessing only type IV pili required 119 +/- 8 pN to dislodge these cells. The experimental results demonstrate that microfluidic flow chambers are useful and convenient tools for assessing the drag forces necessary for detaching bacterial cells and that with specific pilus mutants, the role of the pilus type can be further assessed.

Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber.

Xylella Fastidiosa, ein Bakterium verantwortlich f&uuml;r Pierces Krankheit in Weinreben, besitzt sowohl Typ I und Typ IV Pili am gleichen Pol der Zelle. Typ IV Pili erleichtern die zuckenden Motilit&auml;t und Typ I Pili Biofilm-Entwicklung beteiligt sind. Die Haftf&auml;higkeit der Bakterien und die Rollen der beiden Pili, die Typen in Verbundenheit mit einer Glas-Substrat mit einer mikrofluidische ausgewertet wurden flie&szlig;en Kammer in Verbindung mit Pilus-Genen Mutanten. Die durchschnittliche Haftung Kraft notwendig, Wildtyp X. Fastidiosa Zellen zu trennen war 147 +/-11 pN. &Uuml;ber mutierte Zellen nur Typ I Pili ben&ouml;tigt eine Truppe von 204 +/-22 pN f&uuml;r Entfernung, w&auml;hrend Zellen besitzen nur Typ IV Pili 119 +/-8 pN zu vertreiben diese Zellen ben&ouml;tigt. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass mikrofluidische Str&ouml;mung Kammern n&uuml;tzliche sind und praktische Tools f&uuml;r die Beurteilung des Drag zwingt f&uuml;r bakterielle Zellen trennen und mit spezifischen Pilus Mutanten, die Rolle des Typs Pilus weiter beurteilt werden kann.

Beurteilung der Adh&auml;sion zwingt vom Typ I und Typ IV Pili Xylella Fastidiosa Bakterien durch Verwenden einer mikrofluidische Str&ouml;mung Kammer.

We have developed a hydrogel-based microfluidic device that is capable of generating a steady and long term linear chemical concentration gradient with no through flow in a microfluidic channel. Using this device, we successfully monitored the chemotactic responses of wildtype Escherichia coli (suspension cells) to alpha-methyl-DL-aspartate (attractant) and differentiated HL-60 cells (a human neutrophil-like cell line that is adherent) to formyl-Met-Leu-Phe (f-MLP, attractant). This device advances the current state of the art in microchemotaxis devices in that (1) it demonstrates the validity of using hydrogels as the building material for a microchemotaxis device; (2) it demonstrates the potential of the hydrogel based microfluidic device in biological experiments since most of the proteins and nutrients essential for cell survival are readily diffusible in hydrogel; (3) it is capable of applying chemical stimuli independently of mechanical stimuli; (4) it is straightforward to make, and requires very basic tools that are commonly available in biological labs. This device will also be useful in controlling the chemical and mechanical environment during the formation of tissue engineered constructs.

A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration.

Wir haben ein Hydrogel-basierte Microfluidic-Ger&auml;t entwickelt, das eine verl&auml;ssliche und langfristige lineare chemischen Konzentrationsgradienten ohne durch flie&szlig;en in einen Microfluidic-Kanal erzeugen kann. Mit diesem Ger&auml;t, wir erfolgreich &uuml;berwacht die chemotaktischen Reaktionen Wildtyp Escherichia coli (Aussetzung Zellen) auf Alpha-Methyl-DL-Aspartat (Lockstoff) und differenzierte HL-60-Zellen (eine menschliche Zelle der Neutrophilen-wie Linie, Anh&auml;nger) zu Formyl-Met-Leu-Phe (f-MLP, Lockstoff). Dieses Ger&auml;t setzt den aktuellen Stand der Technik in Microchemotaxis Ger&auml;te in diesem (1) It zeigt die G&uuml;ltigkeit Hydrogele als Baumaterial f&uuml;r ein Microchemotaxis-Ger&auml;t zu verwenden; (2) Es zeigt das Potenzial des Ger&auml;ts basierend mikrofluidische Hydrogel in biologische Experimente, da die meisten Proteine und N&auml;hrstoffe wichtig f&uuml;r das &Uuml;berleben der Zelle ohne weiteres diffusible in Hydrogel sind; (3) Es ist in der Lage der Anwendung chemischer Reize unabh&auml;ngig von mechanischen Reize; (4) Es ist einfach zu machen, und erfordert sehr grundlegenden Werkzeuge, die h&auml;ufig in biologischen Laboren verf&uuml;gbar sind. Dieses Ger&auml;t wird auch bei der Kontrolle der chemischen und mechanischen Umwelt bei der Bildung von Tissue Engineering Konstrukten n&uuml;tzlich sein.

Ein Hydrogel-basierte Microfluidic-Ger&auml;t f&uuml;r die Studien der gerichtete Zellmigration.

The heart is a vital organ that provides essential circulation throughout the body. Malfunction of cardiac pumping, thus, leads to serious and most of the times, to fatal diseases. Mechanics of cardiac pumping is a complex process, and many experimental and theoretical approaches have been undertaken to understand this process. We have taken advantage of the simplicity of the embryonic heart of an invertebrate, Drosophila melanogaster, to understand the fundamental mechanics of the beating heart. We applied a live imaging technique to the beating embryonic heart combined with analytical imaging tools to study the dynamic mechanics of the pumping. Furthermore, we have identified one mutant line that exhibits aberrant pumping mechanics. The Drosophila embryonic heart consists of only 104 cardiac cells forming a simple straight tube that can be easily accessed for real-time imaging. Therefore, combined with the wealth of available genetic tools, the embryonic Drosophila heart may serve as a powerful model system for studies of human heart diseases, such as arrhythmia and congenital heart diseases. We, furthermore, believe our mechanistic data provides important information that is useful for our further understanding of the design of biological structure and function and for engineering the pumps for medical uses.

On the mechanics of cardiac function of Drosophila embryo.

Das Herz ist ein lebenswichtiges Organ, das wesentliche Verbreitung im ganzen K&ouml;rper bereitstellt. Fehlfunktion des Herz pumpt, also zu ernst und f&uuml;hrt in den meisten F&auml;llen, zu t&ouml;dlichen Krankheiten. Mechanik von kardialen Pumpen ist ein komplexer Prozess, und viele experimentelle und theoretische Ans&auml;tze zu verstehen, diesen Prozess durchgef&uuml;hrt wurden. Wir haben die Einfachheit des embryonalen Herzens von einem Wirbellosen, Drosophila Melanogaster, die grundlegende Funktionsweise des schlagenden Herzens verstehen ausgenutzt. Wir haben ein live bildgebendes Verfahren auf das embryonale Herz, kombiniert mit analytischen imaging-Tools, die dynamische Funktionsweise von Pumpen zu studieren angewendet. Dar&uuml;ber hinaus haben wir eine Mutante Zeile identifiziert, die aberrante pumpenden Mechanik aufweist. Das Drosophila embryonale Herz besteht aus nur 104 Herzzellen bilden eine einfache gerade Tube, die leicht f&uuml;r Echtzeit zugegriffen werden kann. Daher kann in Kombination mit der F&uuml;lle der verf&uuml;gbaren genetischen Werkzeuge embryonalen Drosophila Herzen als leistungsf&auml;higes Modellsystem f&uuml;r Studien der menschlichen Herz-, Kreislauf-, wie Arrhythmie und angeborene Herzkrankheiten dienen. Wir glauben au&szlig;erdem, dass unsere mechanistischen Daten liefert wichtige Informationen, die n&uuml;tzlich f&uuml;r das weitere Verst&auml;ndnis der Gestaltung der biologischen Struktur und Funktion und f&uuml;r Ihre Pumpen f&uuml;r medizinische Zwecke.

Auf die Mechanik der Herzfunktion Drosophila Embryos.

We studied the response of swimming Escherichia coli (E. coli) bacteria in a comprehensive set of well-controlled chemical concentration gradients using a newly developed microfluidic device and cell tracking imaging technique. In parallel, we carried out a multi-scale theoretical modeling of bacterial chemotaxis taking into account the relevant internal signaling pathway dynamics, and predicted bacterial chemotactic responses at the cellular level. By measuring the E. coli cell density profiles across the microfluidic channel at various spatial gradients of ligand concentration grad[L] and the average ligand concentration [L] near the peak chemotactic response region, we demonstrated unambiguously in both experiments and model simulation that the mean chemotactic drift velocity of E. coli cells increased monotonically with grad [L]/[L] or approximately grad(log[L])--that is E. coli cells sense the spatial gradient of the logarithmic ligand concentration. The exact range of the log-sensing regime was determined. The agreements between the experiments and the multi-scale model simulation verify the validity of the theoretical model, and revealed that the key microscopic mechanism for logarithmic sensing in bacterial chemotaxis is the adaptation kinetics, in contrast to explanations based directly on ligand occupancy.

Logarithmic sensing in Escherichia coli bacterial chemotaxis.

Wir studierten die Reaktion der Schwimmen Escherichia coli (E. Coli) Bakterien in ein umfassendes Set an gut kontrollierten chemischen Konzentration Steigungen mit einem neu entwickelten mikrofluidische Ger&auml;t und Zelle Verfolgung bildgebendes Verfahren. Gleichzeitig wir eine skalen&uuml;bergreifenden theoretische Modellierung der bakteriellen Chemotaxis unter Ber&uuml;cksichtigung der relevanten internen Signalling Stoffwechselweg Dynamik durchgef&uuml;hrt und vorausgesagt bakterielle chemotaktische Antworten auf zellul&auml;rer Ebene. Durch die Messung der E. Coli Zelle Dichte Profile &uuml;ber den Microfluidic-Kanal bei verschiedenen r&auml;umlichen Gradienten von Liganden-Konzentration-Grad [L] und der durchschnittliche Liganden-Konzentration [L] nahe der Spitze chemotaktische Reaktion Region, wir bewiesen eindeutig in Experimenten und Modellsimulation, die erh&ouml;hte sich die mittlere chemotaktische Driftgeschwindigkeit von E. Coli Zellen monoton mit Grad [L] / [L] oder ungef&auml;hr Grad (Log [L])--das ist E. Coli Zellen sp&uuml;ren r&auml;umlichen Verlaufs der logarithmischen Liganden-Konzentration. Der genaue Farbbereich des Protokoll-Sensorik-Regimes wurde ermittelt. Die Vereinbarungen zwischen den Experimenten und der skalen&uuml;bergreifenden Modellsimulation &uuml;berpr&uuml;fen Sie die G&uuml;ltigkeit des theoretischen Modells, und zeigte, dass die mikroskopische Schl&uuml;sselmechanismus f&uuml;r logarithmische Sensorik in bakterielle Chemotaxis die Anpassung-Kinetik, im Gegensatz zu Erkl&auml;rungen, die aufgrund des Ligand-Belegung.

Logarithmische Sensorik in Escherichia coli bakterielle Chemotaxis.

The current state-of-art in 3D microfluidic chemotaxis device (microFCD) is limited by the inherent coupling of the fluid flow and chemical concentration gradients. Here, we present an agarose-based 3D microFCD that decouples these two important parameters, in that the flow control channels are separated from the cell compartment by an agarose gel wall. This decoupling is enabled by the transport property of the agarose gel, which-in contrast to the conventional microfabrication material such as polydimethylsiloxane (PDMS)-provides an adequate physical barrier for convective fluid flow while at the same time readily allowing protein diffusion. We demonstrate that in this device, a gradient can be pre-established in an agarose layer above the cell compartment (a gradient buffer) before adding the 3D cell-containing matrix, and the dextran (10 kDa) concentration gradients can be re-established within 10 min across the cell-containing matrix and remain stable indefinitely. We successfully quantified the chemotactic response of murine dendritic cells to a gradient of CCL19, an 8.8 kDa lymphoid chemokine, within a type I collagen matrix. This model system is easy to set up, highly reproducible, and will benefit research on 3D chemoinvasion studies, for example with cancer cells or immune cells. Because of its gradient buffering capacity, it is particularly suitable for studying rapidly migrating cells like mature dendritic cells and neutrophils.

An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies.

Die aktuelle State-of-Art 3D mikrofluidische Chemotaxis-Ger&auml;t (MicroFCD) wird durch die inh&auml;rente Kopplung der Fl&uuml;ssigkeitsstr&ouml;mung und chemische Konzentration Steigungen begrenzt. Hier pr&auml;sentieren wir eine Agarose-basierte 3D MicroFCD, die diese beiden wichtigen Parameter entkoppelt, insofern die Str&ouml;mungskan&auml;le Steuerelement aus der Zelle Fach durch eine Agarose-Gel-Wand getrennt sind. Diese Entkopplung wird aktiviert, indem die Transport-Eigenschaft von der Agarose-Gel, welches-in Gegensatz zu den herk&ouml;mmlichen Microfabrication Material wie Polydimethylsiloxan (PDMS)-stellt eine angemessene physische Barriere f&uuml;r konvektiver Fl&uuml;ssigkeitsstr&ouml;mung und gleichzeitig leicht erm&ouml;glichen Protein Verbreitung. Wir zeigen, dass in diesem Ger&auml;t ein Farbverlauf kann in einer Agarose-Schicht oberhalb der Zelle Fach (einen Farbverlauf Puffer) vor dem Hinzuf&uuml;gen der 3D Zelle-haltige Matrix Eigenbedarf werden und die Dextran (10 kDa) Konzentration Farbverl&auml;ufe k&ouml;nnen innerhalb von 10 min in der Zelle-haltige Matrix wiederhergestellt werden und auf unbestimmte Zeit stabil bleiben. Wir erfolgreich quantifiziert die chemotaktische Reaktion der Murine dendritischen Zellen zu einer Steigung von CCL19, eine 8.8 kDa lymphatischen Chemokine, innerhalb eines Typs I Kollagen-Matrix. Dieses Modellsystem ist einfach einzurichten, hoch reproduzierbare und profitieren Forschung auf 3D Chemoinvasion Studien, zum Beispiel mit Krebszellen oder Immunzellen. Aufgrund seiner Steigung Pufferkapazit&auml;t eignet sie sich besonders f&uuml;r das Studium schnell Migration von Zellen wie Reifen dendritischen Zellen und Neutrophilen.

Eine mikrofluidische Agarose-basierte Plattform mit einem Farbverlauf Puffer f&uuml;r 3D Chemotaxisstudien.

Escherichia coli chemotaxis has long served as a simple model of environmental signal processing, and bacterial responses to single chemical gradients are relatively well understood. Less is known about the chemotactic behavior of E. coli in multiple chemical gradients. In their native environment, cells are often exposed to multiple chemical stimuli. Using a recently developed microfluidic chemotaxis device, we exposed E. coli cells to two opposing but equally potent gradients of major attractants, methyl-aspartate and serine. The responses of E. coli cells demonstrated that chemotactic decisions depended on the ratio of the respective receptor number of Tar/Tsr. In addition, the ratio of Tar to Tsr was found to vary with cells' growth conditions, whereby it depended on the culture density but not on the growth duration. These results provide biological insights into the decision-making processes of chemotactic bacteria that are subjected to multiple chemical stimuli and demonstrate the importance of the cellular microenvironment in determining phenotypic behavior.

Responses of Escherichia coli bacteria to two opposing chemoattractant gradients depend on the chemoreceptor ratio.

Escherichia coli Chemotaxis diente lange als ein einfaches Modell der &ouml;kologischen Signalverarbeitung und bakterielle Antworten zu einzelnen chemischen Gradienten sind relativ gut verstanden. Weniger bekannt ist &uuml;ber die chemotaktische Verhalten von E. Coli in mehreren chemischen Gradienten. Zellen sind oft mehrere chemische Reize in ihrer eigenen Umgebung ausgesetzt. Mit einem neu entwickelten mikrofluidische Chemotaxis, gemachten wir E. Coli Zellen zu zwei gegens&auml;tzliche, aber ebenso starke Steigungen von gro&szlig;en Lockstoffe, Methyl-Aspartat und Serin. Die Antworten der E. Coli Zellen zeigte, dass das Verh&auml;ltnis der jeweiligen Rezeptor-Zahl von Tar/Tsr chemotaktische Entscheidungen abh&auml;ngig. Dar&uuml;ber hinaus wurde das Verh&auml;ltnis von Tar zum Tsr gefunden, um mit Wachstumsbedingungen von Zellen, zu variieren, wobei es auf die Kultur-Dichte aber nicht auf die Dauer des Wachstums abhing. Diese Ergebnisse liefern biologische Einblicke in die Entscheidungsprozesse des chemotaktische Bakterien, die auf mehrere chemische Reize ausgesetzt sind und zeigen die Bedeutung der zellul&auml;ren Mikromilieu ph&auml;notypische Verhalten bestimmen.

Antworten der Escherichia coli Bakterien in zwei gegnerische Chemoattractant Farbverl&auml;ufe h&auml;ngen die Chemorezeptor-Verh&auml;ltnis.

Dendritic cell (DC) homing to the lymphatics and positioning within the lymph node is important for adaptive immunity, and is regulated by gradients of CCL19 and CCL21, ligands for CCR7. Despite the importance of DC chemotaxis, it is not well understood how DCs interpret gradients of these chemokines in a complex 3D microenvironment. Here, we use a microfluidic device that allows rapid establishment of stable gradients in 3D matrices to show that DC chemotaxis in 3D can respond to CCR7 ligand gradients as small as 0.4%, which helps explain how DCs sense lymphatic vessels in an environment where broadcast distance for chemokine diffusion is hindered by convective flows into the vessel. Interestingly, DCs displayed similar sensitivities to both chemokines at small gradients (â‰¤ 60 nM/mm), but migrated more efficiently towards higher gradients of CCL21, which unlike CCL19 binds strongly to matrix proteoglycans and signals without the need for internalization. Furthermore, cells preferentially migrated towards CCL21 when exposed to equal and opposite gradients of CCL21 and CCL19 simultaneously, even when matrix-binding of CCL21 was prevented. Although these ligands have similar binding affinity to CCR7, our results demonstrate that, in a 3D environment, CCL21 is a more potent directional cue for DC migration than CCL19. These findings provide new quantitative insight into DC chemotaxis in a physiological 3D environment and suggest how CCL19 and CCL21 may signal differently to fine-tune DC homing and positioning within the lymphatic system. These results also have broad relevance to other systems of cell chemotaxis, which remain poorly understood in the 3D context.

Dendritic cell chemotaxis in 3D under defined chemokine gradients reveals differential response to ligands CCL21 and CCL19.

Dendritischen Zellen (DC) homing auf das Lymphsystem und Positionierung innerhalb der Lymphknoten ist wichtig f&uuml;r die adaptive Immunit&auml;t und Verl&auml;ufe von CCL19 und CCL21, Liganden f&uuml;r CCR7 geregelt ist. Trotz der Bedeutung der DC Chemotaxis ist es nicht gut verstanden wie DCs Verl&auml;ufe bei diesen Chemokinen in einem komplexen 3D Mikromilieu interpretieren. Hier verwenden wir ein Microfluidic-Ger&auml;t, das erm&ouml;glicht die rasche Einrichtung stabiler Gradienten in 3D Matrizen zu zeigen, dass DC Chemotaxis in 3D CCR7 Ligand Verl&auml;ufe so klein wie 0,4 %, reagieren die hilft zu erkl&auml;ren, wie DCs Lymphgef&auml;&szlig;e in einer Umgebung sp&uuml;ren wo Sendung Distanz f&uuml;r Chemokine Diffusion durch konvektive m&uuml;ndet das Schiff behindert wird. Interessanterweise DCs &auml;hnliche Empfindlichkeiten beide Chemokine bei kleinen Steigungen (&le; 60 nM/mm) angezeigt, aber effizienter in Richtung h&ouml;here Gradienten von CCL21, die im Gegensatz zu CCL19 bindet stark an Matrix Proteoglykane und Signale ohne die Notwendigkeit der Internalisierung migriert. Dar&uuml;ber hinaus migriert Zellen bevorzugt in Richtung CCL21, wenn gleich und gegen&uuml;ber Gradienten von CCL21 und CCL19 gleichzeitig ausgesetzt, selbst wenn Matrix-Bindung von CCL21 verhindert worden sei. Obwohl diese Liganden &auml;hnlichen Bindungsaffinit&auml;t zu CCR7 haben, zeigen unsere Ergebnisse, dass, in einer 3D-Umgebung, CCL21 ein potenter direktionale Stichwort f&uuml;r DC-Migration als CCL19. Diese Befunde geben neuen quantitativen Einblick in DC Chemotaxis in einer physiologischen 3D-Umgebung und vorschlagen, wie CCL19 und CCL21 anders hinweisen k&ouml;nnen DC Feinabstimmung Referenzfahrt und Positionierung auf das lymphatische System. Diese Ergebnisse haben auch gro&szlig;e Relevanz zu anderen Systemen der Zelle Chemotaxis, die im Zusammenhang mit 3D weitgehend unverstanden bleiben.

Dendritische Zelle Chemotaxis in 3D unter definierten Chemokin-Gradienten zeigt differenzierte Antwort auf Liganden CCL21 und CCL19.

In vitro, animal cells are mostly cultured on a gel substrate. It was recently shown that substrate stiffness affects cellular behaviors in a significant way, including adhesion, differentiation, and migration. Therefore, an accurate method is needed to characterize the modulus of the substrate. In situ microscopic measurements of the gel substrate modulus are based on Hertz contact mechanics, where Young's modulus is derived from the indentation force and displacement measurements. In Hertz theory, the substrate is modeled as a linear elastic half-space with an infinite depth, whereas in practice, the thickness of the substrate, h, can be comparable to the contact radius and other relevant dimensions such as the radius of the indenter or steel ball, R. As a result, measurements based on Hertz theory overestimate the Young's modulus. In this work, we discuss the limitations of Hertz theory and then modify it, taking into consideration the nonlinearity of the material and large deformation using a finite-element method. We present our results in a simple correction factor, Ïˆ, the ratio of the corrected Young's modulus and the Hertz modulus in the parameter regime of Î´/h â‰¤ min (0.6, R/h) and 0.3Â â‰¤R/h â‰¤ 12.7. The Ïˆ factor depends on two dimensionless parameters, R/h and Î´/h (where Î´ is the indentation depth), both of which are easily accessible to experiments. This correction factor agrees with experimental observations obtained with the use of polyacrylamide gel and a microsphere indentation method in the parameter range of 0.1Â â‰¤Î´/h â‰¤ 0.4 and 0.3Â â‰¤R/h â‰¤ 6.2. The effect of adhesion on the use of Hertz theory for small indentation depth is also discussed.

Effects of gel thickness on microscopic indentation measurements of gel modulus.

In-vitro, tierische Zellen sind meist auf einem Gel-Substrat kultiviert. Es wurde k&uuml;rzlich gezeigt, dass Substrat Steifigkeit zellul&auml;re Verhaltensweisen in signifikanter Weise, einschlie&szlig;lich Haftung, Differenzierung und Migration beeinflusst. Daher ist eine genaue Methode erforderlich, um den Elastizit&auml;tsmodul des Substrates zu charakterisieren. In-situ mikroskopische Messungen der Gel-Substrat-Fehlergrenze basieren auf Hertz Kontaktmechanik, in dem Elastizit&auml;tsmodul aus den Einzug Kraft- und Wegsensoren Messungen abgeleitet wird. In Hertz Theorie wird das Substrat als einer linear elastischen Halbraum mit einer unendlichen Tiefe modelliert, w&auml;hrend in der Praxis die Dicke des Substrats, h, vergleichbar mit den Kontaktdaten Radius und anderen wichtigen Aspekten wie der Radius des Indenter oder Stahlkugel, R. werden kann Infolgedessen &uuml;bersch&auml;tzen Messungen auf der Grundlage von Hertz Theorie der Elastizit&auml;tsmodul. In dieser Arbeit wir besprechen die Einschr&auml;nkungen von Hertz Theorie und dann &auml;ndern es, unter Ber&uuml;cksichtigung der Nichtlinearit&auml;t des Materials und Verformungen mit einer Finite-Elemente-Methode. Wir pr&auml;sentieren unsere Ergebnisse in eine einfache Korrekturfaktor, &psi;, das Verh&auml;ltnis von der korrigierten Elastizit&auml;tsmodul und die Hertz-Modulus des Regimes Parameter &delta;/h &le; min (0.6, R/h) und 0,3 &le;R/h &le; 12,7. Der &psi;-Faktor h&auml;ngt von zwei dimensionslose Parameter, R/h und &delta;/h (&delta; ist die Eindrucktiefe), beide leicht zug&auml;nglich f&uuml;r Experimente sind. Dieser Korrekturfaktor stimmt mit experimentellen Beobachtungen gewonnen mit dem Einsatz von Polyacrylamid-Gel und eine Mikrosph&auml;ren-Einzug-Methode in den Parameterbereich 0,1 &le;&delta;/h &le; 0,4 und 0,3 &le;R/h &le; 6.2. Die Wirkung der Adh&auml;sion auf die Verwendung von Hertz Theorie f&uuml;r kleine Eindrucktiefe wird auch diskutiert.

Auswirkungen des Gel Dicke auf mikroskopische Einzug Messungen Gel Fehlergrenze.

The emerging field of micro-technology has opened up new possibilities for exploring cellular chemotaxis in real space and time, and at single cell resolution. Chemotactic cells sense and move in response to chemical gradients and play important roles in a number of physiological and pathological processes, including development, immune responses, and tumor cell invasions. Due to the size proximity of the microfluidic device to cells, microfluidic chemotaxis devices advance the traditional macro-scale chemotaxis assays in two major directions: one is to build well defined and stable chemical gradients at cellular length scales, and the other is to provide a platform for quantifying cellular responses at both cellular and molecular levels using advanced optical imaging systems. Here, we present a critical review on the designing principles, recent development, and potential capabilities of the microfluidic chemotaxis assay for solving problems that are of importance in the biomedical engineering field.

Microfluidics for Mammalian Cell Chemotaxis.

Dem aufstrebenden Gebiet der Mikrotechnologie er&ouml;ffnet neue M&ouml;glichkeiten f&uuml;r die Erforschung der zellul&auml;ren Chemotaxis im realen Raum und Zeit und bei einzelligen Aufl&ouml;sung. Chemotaktische Zellen sp&uuml;ren und bewegen sich in Reaktion auf chemische Gradienten und spielen eine wichtige Rolle in einer Reihe von physiologischer und pathologischer Prozesse, einschlie&szlig;lich Entwicklung, Immunantworten und Tumor Zelle Invasionen. Aufgrund der Gr&ouml;&szlig;e N&auml;he des Ger&auml;ts mikrofluidische Zellen, Microfluidic Chemotaxis Ger&auml;te voraus der traditionellen Makro-Skala Chemotaxis-Assays in zwei gro&szlig;e Richtungen: eine gut definierte und stabile chemische Gradienten an zellul&auml;ren L&auml;nge Skalen bauen soll, und das andere ist, eine Plattform zu bieten, f&uuml;r Quantifizierung zellulare Antworten sowohl zellul&auml;rer und molekularer Ebene mit optischen Bildsysteme erweiterte. Hier pr&auml;sentieren wir eine kritische &Uuml;berpr&uuml;fung auf die Design-Prinzipien, neuere Entwicklung und Potenziale des mikrofluidische Chemotaxis-Assays zur L&ouml;sung von Problemen, die im Bereich Biomedizinische Technik von Bedeutung sind.

Article	Year
A three-channel microfluidic device for generating static linear gradients and its application to the quantitative analysis of bacterial chemotaxis. Lab on a chip\| PubMed ID: 16511621	2006
Collective bacterial dynamics revealed using a three-dimensional population-scale defocused particle tracking technique. Applied and environmental microbiology\| PubMed ID: 16820497	2006
Assessing adhesion forces of type I and type IV pili of Xylella fastidiosa bacteria by use of a microfluidic flow chamber. Applied and environmental microbiology\| PubMed ID: 17293518	2007
A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab on a chip\| PubMed ID: 17538719	2007
On the mechanics of cardiac function of Drosophila embryo. PloS one\| PubMed ID: 19107195	2008
Logarithmic sensing in Escherichia coli bacterial chemotaxis. Biophysical journal\| PubMed ID: 19289068	2009
An agarose-based microfluidic platform with a gradient buffer for 3D chemotaxis studies. Biomedical microdevices\| PubMed ID: 19343497	2009
Responses of Escherichia coli bacteria to two opposing chemoattractant gradients depend on the chemoreceptor ratio. Journal of bacteriology\| PubMed ID: 20118262	2010
Dendritic cell chemotaxis in 3D under defined chemokine gradients reveals differential response to ligands CCL21 and CCL19. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 21422278	2011
Effects of gel thickness on microscopic indentation measurements of gel modulus. Biophysical journal\| PubMed ID: 21806932	2011
Microfluidics for Mammalian Cell Chemotaxis. Annals of biomedical engineering\| PubMed ID: 22189490	2011

Mingming Wu

Biography

JoVE Journal Publications

Other Publications