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Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Studies in vitro implicate transforming growth factor beta (TGF-beta) as a key regulator of hematopoiesis with potent inhibitory effects on progenitor and stem cell proliferation. In vivo studies have been hampered by early lethality of knock-out mice for TGF-beta isoforms and the receptors. To directly assess the role of TGF-beta signaling for hematopoiesis and hematopoietic stem cell (HSC) function in vivo, we generated a conditional knock-out model in which a disruption of the TGF-beta type I receptor (T beta RI) gene was induced in adult mice. HSCs from induced mice showed increased proliferation recruitment when cultured as single cells under low stimulatory conditions in vitro, consistent with an inhibitory role of TGF-beta in HSC proliferation. However, induced T beta RI null mice show normal in vivo hematopoiesis with normal numbers and differentiation ability of hematopoietic progenitor cells. Furthermore HSCs from T beta RI null mice exhibit a normal cell cycle distribution and do not differ in their ability long term to repopulate primary and secondary recipient mice following bone marrow transplantation. These findings challenge the classical view that TGF-beta is an essential negative regulator of hematopoietic stem cells under physiologic conditions in vivo.

TGF-beta signaling-deficient hematopoietic stem cells have normal self-renewal and regenerative ability in vivo despite increased proliferative capacity in vitro.

TGF-beta-Signalisierung-defizienten h&#xE4;matopoetischen Stammzellen haben normale Selbsterneuerung und Regenerationsf&#xE4;higkeit in vivo trotz erh&#xF6;hten proliferativen Kapazit&#xE4;t in vitro.

Quiescence von h&#xE4;matopoetischen Stammzellen und die Wartung des Stammzellpools ist nicht abh&#xE4;ngig von TGF-beta-Signal&#xFC;bertragung in vivo.

Maintained quiescence of hematopoietic stem cells (HSCs) is of critical importance to prevent premature exhaustion of the stem cell pool under conditions of hematopoietic stress. The growth inhibitory cytokine transforming growth factor beta (TGF-beta) has been shown to play a critical role in maintaining quiescence of HSCs in vitro. Here, we have used conditional knockout mice for the TGF-beta type I receptor (TbetaRI) to ask whether the naturally quiescent state of HSCs in vivo is dependent on TGF-beta signaling and thus whether TGF-beta serves as a protective factor for the stem cell pool during conditions of stress.

Quiescence of hematopoietic stem cells and maintenance of the stem cell pool is not dependent on TGF-beta signaling in vivo.

Smad5 is known to transduce intracellular signals from bone morphogenetic proteins (BMPs), which belong to the transforming growth factor-beta (TGF-beta) superfamily and are involved in the regulation of hematopoiesis. Recent findings suggest that BMP4 stimulates proliferation of human primitive hematopoietic progenitors in vitro, while early progenitors from mice deficient in Smad5 display increased self-renewal capacity in murine embryonic hematopoiesis. Here, we evaluate the role of Smad5 in the regulation of hematopoietic stem cell (HSC) fate decisions in adult mice by using an inducible MxCre-mediated conditional knockout model. Surprisingly, analysis of induced animals revealed unperturbed cell numbers and lineage distribution in peripheral blood (PB), bone marrow (BM), and the spleen. Furthermore, phenotypic characterization of the stem cell compartment revealed normal numbers of primitive lin(-)Sca-1(+)c-Kit(+) (LSK) cells in Smad5(-)(/)(-) BM. When transplanted in a competitive fashion into lethally irradiated primary and secondary recipients, Smad5-deficient BM cells competed normally with wild-type (wt) cells, were able to provide long-term reconstitution for the hosts, and displayed normal lineage distribution. Taken together, Smad5-deficient HSCs from adult mice show unaltered differentiation, proliferation, and repopulating capacity. Therefore, in contrast to its role in embryonic hematopoiesis, Smad5 is dispensable for hematopoiesis in the adult mouse.

Smad5 is dispensable for adult murine hematopoiesis.

Smad5 ist bekannt, dass die intrazellul&auml;re Signale von Bone morphogenetic Proteins (BMPs), zur&uuml;ckwirken, die der transformierende Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta) &Uuml;berfamilie zugeh&ouml;ren und die Regulierung der Blutbildung beteiligt sind. Neuesten Erkenntnissen zufolge BMP4 Verbreitung von menschlichen primitiver h&auml;matopoetischer Vorl&auml;uferzellen in vitro stimuliert, w&auml;hrend fr&uuml;hen Vorfahre von M&auml;usen, die einen Mangel an Smad5 Selbsterneuerung Kapazit&auml;tssteigerung in murinen embryonalen Blutbildung anzuzeigen. Hier bewerten wir die Rolle des Smad5 bei der Regulierung der h&auml;matopoetischen Stammzellen (HSC) Schicksal Entscheidungen bei Erwachsenen M&auml;usen mithilfe eines durch Induktion MxCre-vermittelte bedingte k.o.-Modells. &Uuml;berraschenderweise ergab eine Analyse der induzierten Tiere unbeirrt Zelle Zahlen und Herkunfts-Verteilung im peripheren Blut (PB), Knochenmark (BM) und der Milz. Dar&uuml;ber hinaus ergab ph&auml;notypische Charakterisierung des Fachs Stammzelle primitiven lin(-)Sca-1(+)c-Kit(+) (LSK) Zellzahl in Smad5(-)(/)(-) BM. Wenn in einem wettbewerbsf&auml;higen Mode in lethally bestrahlten prim&auml;ren und sekund&auml;ren Empf&auml;nger transplantiert, BM Smad5-defizienten Zellen startete normalerweise mit Wildtyp (wt) Zellen konnten langfristige Rekonstitution Hosts liefern und Verteilung der normalen Linie angezeigt. Zusammengenommen zeigen Smad5-defizienten HSCs von Erwachsenen M&auml;usen unver&auml;ndert Differenzierung, Proliferation und repopulating Kapazit&auml;t. Daher ist im Gegensatz zu seiner Rolle bei der embryonalen Blutbildung, Smad5 f&uuml;r die Blutbildung in der adulten Maus entbehrlich.

Smad5 ist entbehrlich f&uuml;r Erwachsene murinen Blutbildung.

The Smad-signaling pathway downstream of the transforming growth factor-beta superfamily of ligands is an evolutionarily conserved signaling circuitry with critical functions in a wide variety of biologic processes. To investigate the role of this pathway in the regulation of hematopoietic stem cells (HSCs), we have blocked Smad signaling by retroviral gene transfer of the inhibitory Smad7 to murine HSCs. We report here that the self-renewal capacity of HSCs is promoted in vivo upon blocking of the entire Smad pathway, as shown by both primary and secondary bone marrow (BM) transplantations. Importantly, HSCs overexpressing Smad7 have an unperturbed differentiation capacity as evidenced by normal contribution to both lymphoid and myeloid cell lineages, suggesting that the Smad pathway regulates self-renewal independently of differentiation. Moreover, phosphorylation of Smads was inhibited in response to ligand stimulation in BM cells, thus verifying impairment of the Smad-signaling cascade in Smad7-overexpressing cells. Taken together, these data reveal an important and previously unappreciated role for the Smad-signaling pathway in the regulation of self-renewal of HSCs in vivo.

Smad7 promotes self-renewal of hematopoietic stem cells.

Die Smad-Signalling Pathway flussabw&auml;rts ist der transformierende Wachstumsfaktor-Beta-Superfamilie Liganden eine evolution&auml;r konservierte Signalling Schaltungstechnik mit kritischen Funktionen in einer Vielzahl von biologischen Prozessen. Um die Rolle von diesem Weg bei der Regulierung der h&auml;matopoetischen Stammzellen (HSCs) zu untersuchen, haben wir Smad Signalisierung durch retroviralen Gentransfer von der hemmenden Smad7, murine HSCs blockiert. Wir berichten hier, dass die Kapazit&auml;t der Selbsterneuerung von HSCs auf Sperrung des gesamten Smad-Signalweges in-vivo gef&ouml;rdert wird, wie beide Transplantationen von prim&auml;ren und sekund&auml;ren Knochenmark (BM) gezeigt. Wichtig ist, werden die HSCs &uuml;berexprimierenden Smad7 haben eine unbeirrt Differenzierung-F&auml;higkeit, wie Sie von normalen Beitrag zu beiden lymphatischen und myeloischen Zell-Linien, und darauf hindeutet, dass die Smad-Pathway Selbsterneuerung unabh&auml;ngig von Differenzierung regelt. Dar&uuml;ber hinaus wurde die Phosphorylierung von Smads als Reaktion auf die Stimulierung der Ligand in BM Zellen, somit &Uuml;berpr&uuml;fung Wertminderung der Smad-Signalisierung Kaskade in Smad7-&uuml;berexprimierenden Zellen gehemmt. Zusammengenommen zeigen diese Daten eine wichtige und bisher unbeachtet Rolle f&uuml;r die Smad-Signalling Pathway bei der Regulierung der Selbsterneuerung von HSCs in-vivo.

Smad7 f&ouml;rdert Selbsterneuerung von h&auml;matopoetischen Stammzellen.

Members of the transforming growth factor beta (TGF-beta) superfamily of growth factors have been shown to regulate the in vitro proliferation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs). Working at a common level of convergence for all TGF-beta superfamily signals, Smad4 is key in orchestrating these effects. The role of Smad4 in HSC function has remained elusive because of the early embryonic lethality of the conventional knockout. We clarify its role by using an inducible model of Smad4 deletion coupled with transplantation experiments. Remarkably, systemic induction of Smad4 deletion through activation of MxCre was incompatible with survival 4 wk after induction because of anemia and histopathological changes in the colonic mucosa. Isolation of Smad4 deletion to the hematopoietic system via several transplantation approaches demonstrated a role for Smad4 in the maintenance of HSC self-renewal and reconstituting capacity, leaving homing potential, viability, and differentiation intact. Furthermore, the observed down-regulation of notch1 and c-myc in Smad4(-/-) primitive cells places Smad4 within a network of genes involved in the regulation HSC renewal.

Smad4 is critical for self-renewal of hematopoietic stem cells.

Mitglieder der transformierende Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta)-Superfamilie von Wachstumsfaktoren wurden gezeigt, die in-vitro-Vermehrung und Pflege von h&auml;matopoetischen Stammzellen (HSCs) zu regulieren. Arbeiten auf einer gemeinsamen Ebene der Konvergenz f&uuml;r alle TGF-Beta &Uuml;berfamilie Signale, ist Smad4 orchestrieren diese Effekte. Die Rolle der Smad4 in HSC-Funktion ist aufgrund der fr&uuml;hen embryonalen Letalit&auml;t von der konventionellen ko schwer fassbaren geblieben. Wir kl&auml;ren ihre Rolle mithilfe eines durch Induktion Modells Smad4 L&ouml;schmethoden gepaart mit Transplantation Experimente. Erstaunlicherweise systemische Induktion von Smad4 L&ouml;schung durch Aktivierung von MxCre inkompatibel mit &Uuml;berleben 4 wk nach Induktion wegen An&auml;mie und histopathologischen Ver&auml;nderungen im Kolon Mucosa. Isolierung von Smad4 L&ouml;schung mit dem h&auml;matopoetischen System &uuml;ber mehrere Transplantation Ans&auml;tze demonstriert eine Rolle zur Smad4 bei der Pflege des HSC Selbsterneuerung und REKONSTITUTIERT Kapazit&auml;t, verlassen die Referenzfahrt potenzielle, Lebensf&auml;higkeit und Differenzierung intakt. Dar&uuml;ber hinaus setzt die beobachtete Herunterregulation der notch1 und c-Myc in Smad4(-/-) primitive Zellen Smad4 innerhalb eines Netzwerkes von Genen die Regulierung HSC Erneuerung beteiligt.

Smad4 ist kritisch f&uuml;r Selbsterneuerung von h&auml;matopoetischen Stammzellen.

Endoglin is a transforming growth factor-beta (TGF-beta) accessory receptor recently identified as being highly expressed on long-term repopulating hematopoietic stem cells (HSC). However, little is known regarding its function in these cells. We have used two complementary approaches toward understanding endoglin's role in HSC biology: one that efficiently knocks down expression via lentiviral-driven short hairpin RNA and another that uses retroviral-mediated overexpression. Altering endoglin expression had functional consequences for hematopoietic progenitors in vitro such that endoglin-suppressed myeloid progenitors (colony-forming unit-granulocyte macrophage) displayed a higher degree of sensitivity to TGF-beta-mediated growth inhibition, whereas endoglin-overexpressing cells were partially resistant. However, transplantation of transduced bone marrow enriched in primitive hematopoietic stem and progenitor cells revealed that neither endoglin suppression nor endoglin overexpression affected the ability of stem cells to short-term or long-term repopulate recipient marrow. Furthermore, transplantation of cells altered in endoglin expression yielded normal white blood cell proportions and peripheral blood platelets. Interestingly, decreasing endoglin expression increased the clonogenic capacity of early blast-forming unit-erythroid progenitors, whereas overexpression compromised erythroid differentiation at the basophilic erythroblast phase, suggesting a pivotal role for endoglin at key stages of adult erythropoietic development.

Endoglin is not critical for hematopoietic stem cell engraftment and reconstitution but regulates adult erythroid development.

Endoglin ist ein transformierende Wachstumsfaktor-Beta (TGF-Beta)-Zubeh&ouml;r-Rezeptor k&uuml;rzlich identifiziert als hoch auf langfristige repopulating hematopoietic Stammzellen (HSC) ausgedr&uuml;ckt. Jedoch ist wenig bekannt &uuml;ber ihre Funktion in diesen Zellen. Wir haben zwei komplement&auml;re Konzepte gegen&uuml;ber Verst&auml;ndnis Endoglin Rolle in der HSC-Biologie verwendet: eine, die effizient nach unten Ausdruck via Lentivirale-gesteuerte kurze Haarnadel RNA und anderen klopft, die Retroviren-vermittelte &Uuml;berexpression verwendet. Endoglin Ausdruck &auml;ndern musste die funktionelle Konsequenzen f&uuml;r in-vitro-h&auml;matopoetische Vorl&auml;uferzellen so dass Endoglin unterdr&uuml;ckt myeloid Vorfahre (kolonienbildende Einheit-Granulozyten-Makrophagen) ein h&ouml;heres Ma&szlig; an Sensibilit&auml;t f&uuml;r Wachstum TGF-Beta-vermittelte Hemmung, angezeigt w&auml;hrend Endoglin-&uuml;berexprimierenden Zellen teilweise resistent waren. Transplantation von transduzierten Knochenmark angereichertes primitiver H&auml;matopoetischer Stammzellen und Vorl&auml;uferzellen Zellen ergab jedoch, dass weder Endoglin Unterdr&uuml;ckung noch Endoglin &Uuml;berexpression die F&auml;higkeit von Stammzellen beeinflusst zu kurz- oder langfristigen Empf&auml;nger Knochenmark wieder zu f&uuml;llen. Dar&uuml;ber hinaus ergab die Transplantation von Zellen, die in Endoglin Ausdruck ver&auml;ndert normalen wei&szlig;en Blutk&ouml;rperchen Proportionen und peripheren Blutpl&auml;ttchen. Interessanterweise erh&ouml;ht die abnehmender Endoglin Ausdruck die Clonogenic Kapazit&auml;t der fr&uuml;hen Explosion-bildenden Einheit-Erythroid Vorfahre, w&auml;hrend &Uuml;berexpression Erythroid Differenzierung bei der Phase basophile Erythroblast schl&auml;gt eine Schl&uuml;sselrolle f&uuml;r Endoglin in wichtigen Phasen des Erwachsenen erythropoetische Entwicklung gef&auml;hrdet.

Endoglin ist nicht wichtig f&uuml;r h&auml;matopoetische Stammzelle-Verteilung und Rekonstitution aber Erwachsenen Erythroid Entwicklung reguliert.

Hematopoietic stem cells (HSCs) are historically the most thoroughly characterized type of adult stem cell, and the hematopoietic system has served as a principal model structure of stem-cell biology for several decades. However, paradoxically, although HSCs can be defined by function and even purified to near-homogeneity, the intricate molecular machinery and the signaling mechanisms regulating fate events, such as self-renewal and differentiation, have remained elusive. Recently, several developmentally conserved signaling pathways have emerged as important control devices of HSC fate, including Notch, Wingless-type (Wnt), Sonic hedgehog (Shh), and Smad pathways. HSCs reside in a complex environment in the bone marrow, providing a niche that optimally balances signals that control self-renewal and differentiation. These signaling circuits provide a valuable structure for our understanding of how HSC regulation occurs, concomitantly with providing information of how the bone marrow microenvironment couples and integrates extrinsic with intrinsic HSC fate determinants. It is the focus of this review to highlight some of the most recent developments concerning signaling pathways governing HSC fate.

Signaling pathways governing stem-cell fate.

H&auml;matopoetischen Stammzellen (HSCs) sind historisch die meisten gr&uuml;ndlich charakterisiert Art von adulten Stammzellen und das h&auml;matopoetische System diente als Prinzipal Modellstruktur der Stammzellbiologie-seit mehreren Jahrzehnten. Jedoch paradoxerweise obgleich HSCs durch Funktion definiert und sogar gereinigt und in der N&auml;he von Homogenit&auml;t, die komplizierten molekularen Maschinerie und die Signalisierung Regulierungsmechanismen Schicksal Ereignisse wie Selbsterneuerung und Differenzierung k&ouml;nnen, schwer fassbaren geblieben. In letzter Zeit mehrere entwicklungspolitisch konserviert Signalisierung Wege entstanden so wichtig Steuereinheiten HSC Schicksal, einschlie&szlig;lich Notch, Wingless-Typ (Wnt), Sonic Hedgehog (Shh) und Smad Wege. HSCs befinden sich in einem komplexen Umfeld im Knochenmark, die einer Nische, die Signale optimal balanciert dieses Steuerelement Selbsterneuerung und Differenzierung. Diese Signalisierung Schaltungen bieten eine wertvolle Struktur f&uuml;r unser Verst&auml;ndnis von wie HSC-Verordnung begleitend auftritt, mit der Bereitstellung von Informationen wie das Knochenmark Mikromilieu Paare und extrinsischen mit systeminternen HSC Schicksal Determinanten integriert. Es ist der Schwerpunkt dieser &Uuml;berpr&uuml;fung um einige der j&uuml;ngsten Entwicklungen &uuml;ber Signalwege f&uuml;r HSC-Schicksal zu markieren.

Signalwege, die EZB Stammzell Schicksal.

Bone morphogenetic proteins (BMPs) regulate essential processes during organogenesis, and a functional understanding of these secreted proteins depends on identification of their target cells. In this study, we generate a transgenic reporter for organogenesis studies that we use to define BMP pathway activation in the developing kidney.

An in vivo reporter of BMP signaling in organogenesis reveals targets in the developing kidney.

Bone morphogenetic Proteins (BMPs) regulieren die wesentlichen Prozesse w&auml;hrend der Organogenese und eine funktionelle Verst&auml;ndnis dieser sekretierten Proteine h&auml;ngt von der Identifikation von ihre Zielzellen. In dieser Studie generieren wir transgenen Reporter f&uuml;r Organogenese-Studien, die wir verwenden, um BMP Stoffwechselweg Aktivierung der dritten Niere zu definieren.

Ein in-vivo Reporter von BMP signalisieren in Organogenese deckt Ziele der Entwicklung Niere.

The iterative formation of nephrons during embryonic development relies on continual replenishment of progenitor cells throughout nephrogenesis. Defining molecular mechanisms that maintain and regulate this progenitor pool is essential to understanding nephrogenesis in developmental and regenerative contexts. Maintenance of nephron progenitors is absolutely dependent on BMP7 signaling, and Bmp7-null mice exhibit rapid loss of progenitors. However, the signal transduction machinery operating downstream of BMP7 as well as the precise target cell remain undefined. Using a novel primary progenitor isolation system, we have investigated signal transduction and biological outcomes elicited by BMP7. We find that BMP7 directly and rapidly activates JNK signaling in nephron progenitors resulting in phosphorylation of Jun and ATF2 transcription factors. This signaling results in the accumulation of cyclin D3 and subsequent proliferation of PAX2(+) progenitors, inversely correlating with the loss of nephron progenitors seen in the Bmp7-null kidney. Activation of Jun and ATF2 is severely diminished in Bmp7-null kidneys, providing an important in vivo correlate. BMP7 thus promotes proliferation directly in nephron progenitors by activating the JNK signaling circuitry.

BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism.

Die iterative Bildung von Nephronen w&auml;hrend der Embryonalentwicklung beruht auf st&auml;ndigen Nachschub von Progenitorzellen in der gesamten Nephrogenesis. Definieren von Molekulare Mechanismen, die unterhalten und Regeln dieser Stammvater Pool unbedingt Verst&auml;ndnis Nephrogenesis in Entwicklungs- und regenerative zusammenh&auml;ngen. Wartung von Nephron Vorfahre ist absolut abh&auml;ngig von BMP7 Signalisierung und Bmp7-Null-M&auml;use zeigen rasche Verlust der Vorfahre. Jedoch, der Signal-Transduktion Maschinen Betrieb stromabw&auml;rts von BMP7 sowie die pr&auml;zise Zielzelle bleiben undefiniert. Mit einem neuartigen prim&auml;re Stammvater-Isolierung-System, haben wir untersucht, Signal-Transduktion und biologische Ergebnisse von BMP7 hervorgerufen. Wir finden, dass BMP7 direkt und schnell aktiviert JNK signalisieren in Nephron Vorl&auml;uferzellen die Phosphorylierung von Jun und ATF2 Transkriptionsfaktoren. Diese Signalisierung f&uuml;hrt die Ansammlung von cyclin D3 und anschlie&szlig;ende Vermehrung von PAX2(+) Vorl&auml;uferzellen, umgekehrt korreliert mit dem Verlust von Nephron-Vorl&auml;uferzellen, die in der Niere Bmp7-Null gesehen. Aktivierung von Jun und ATF2 ist stark geschrumpften Bmp7-Null Nieren, bietet eine wichtige in-vivo korrelieren. BMP7 f&ouml;rdert die Verbreitung direkt im Nephron Vorl&auml;uferzellen somit durch die Aktivierung der JNK-Signalling-Schaltung.

Article	Year
TGF-beta signaling-deficient hematopoietic stem cells have normal self-renewal and regenerative ability in vivo despite increased proliferative capacity in vitro. Blood\| PubMed ID: 12842983	2003
Quiescence of hematopoietic stem cells and maintenance of the stem cell pool is not dependent on TGF-beta signaling in vivo. Experimental hematology\| PubMed ID: 15850837	2005
Smad5 is dispensable for adult murine hematopoiesis. Blood\| PubMed ID: 16896158	2006
Smad7 promotes self-renewal of hematopoietic stem cells. Blood\| PubMed ID: 16917010	2006
Smad4 is critical for self-renewal of hematopoietic stem cells. The Journal of experimental medicine\| PubMed ID: 17353364	2007
Endoglin is not critical for hematopoietic stem cell engraftment and reconstitution but regulates adult erythroid development. Stem cells (Dayton, Ohio)\| PubMed ID: 17673527	2007
Signaling pathways governing stem-cell fate. Blood\| PubMed ID: 17914027	2008
An in vivo reporter of BMP signaling in organogenesis reveals targets in the developing kidney. BMC developmental biology\| PubMed ID: 18801194	2008
BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development (Cambridge, England)\| PubMed ID: 19793891	2009

Ulrika Blank

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