single-cell-electroporation-in-vivo-within-the-intact-developing-brain

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Illuminating cracks in the fragile mind.

Leuchtende Risse in der zerbrechlichen Seele.

Electroporation is becoming more popular as a technique for transfecting neurons within intact tissues. One of the advantages of electroporation over other transfection techniques is the ability to precisely target an area for transfection. Here we highlight this advantage by describing methods to restrict transfection to either a single cell, clusters of cells, or to include large portions of the brain of the intact Xenopus tadpole. Electroporation is also an effective means of gene delivery in the retina. We have developed these techniques to examine the effects of regulated gene expression on various neuronal properties, including structural plasticity and synaptic transmission. Restriction of transfection to individual cells aids in imaging of neuronal morphology, while bulk cell transfection allows examination of the affects of gene expression on populations of cells by biochemical assays, imaging, and electrophysiological recording.

Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.

Gezielte Elektroporation in Xenopus Kaulquappen in vivo - von einzelnen Zellen auf das gesamte Gehirn.

Previous studies suggest that neuronal activity may guide the development of synaptic connections in the central nervous system through mechanisms involving glutamate receptors and GTPase-dependent modulation of the actin cytoskeleton. Here we demonstrate by in vivo time-lapse imaging of optic tectal cells in Xenopus laevis tadpoles that enhanced visual activity driven by a light stimulus promotes dendritic arbor growth. The stimulus-induced dendritic arbor growth requires glutamate-receptor-mediated synaptic transmission, decreased RhoA activity and increased Rac and Cdc42 activity. The results delineate a role for Rho GTPases in the structural plasticity driven by visual stimulation in vivo.

Dendrite growth increased by visual activity requires NMDA receptor and Rho GTPases.

Dendritenwachstum durch visuelle Aktivit&#xE4;t erh&#xF6;ht erfordert NMDA-Rezeptor und Rho GTPasen.

Der menschliche MC4R Promoter: Charakterisierung und Rolle bei Fettleibigkeit.

Heterozygous mutations in the coding sequence of the serpentine melanocortin 4 receptor (MC4R) are the most frequent genetic cause of severe human obesity. Since haploinsufficiency has been proposed as a causal mechanism of obesity associated with these mutations, reduction in gene transcription caused by mutations in the transcriptionally essential regions of the MC4R promoter may also be a cause of severe obesity in humans. To test this hypothesis we defined the minimal promoter region of the human MC4R and evaluated the extent of genetic variation in this region compared with the coding region in two cohorts of severely obese subjects. 5'RACE followed by functional promoter analysis in multiple cell lines indicates that an 80-bp region is essential for the transcriptional activity of the MC4R promoter. Systematic screening of 431 obese children and adults for mutations in the coding sequence and the minimal core promoter of MC4R reveals that genetic variation in the transcriptionally essential region of the MC4R promoter is not a significant cause of severe obesity in humans.

The human MC4R promoter: characterization and role in obesity.

The size and shape of neuronal dendritic arbors affect the number and type of synaptic inputs, as well as the complexity and function of brain circuits. In the intact brain, dendritic arbor growth and the development of excitatory glutamatergic synapse are concurrent. Consequently, it has been difficult to resolve whether synaptic inputs drive dendritic arbor development. Here, we test the role of AMPA receptor (AMPAR)-mediated glutamatergic transmission in dendrite growth by expressing peptides corresponding to the intracellular C-terminal domains of AMPAR subunits GluR1 (GluR1Ct) and GluR2 (GluR2Ct) in optic tectal neurons of the Xenopus retinotectal system. These peptides significantly reduce AMPAR synaptic transmission in transfected neurons while leaving visual system circuitry intact. Daily in vivo imaging over 5 days revealed that GluR1Ct or GluR2Ct expression dramatically impaired dendrite growth, resulting in less complex arbors than controls. Time-lapse images collected at 2-h intervals over 6 h show that both GluR1Ct and GluR2Ct decrease branch lifetimes. Ultrastructural analysis indicates that synapses formed onto neurons expressing the GluRCt are less mature than synapses onto control neurons. These data suggest that the failure to form complex arbors is due to reduced stabilization of new synapses and dendritic branches. Although visual stimulation increases dendritic arbor growth rates in control tectal neurons, a weak postsynaptic response to visual experience in GluRCt-expressing cells leads to retraction of branches. These results indicate that AMPAR-mediated transmission underlies experience-dependent dendritic arbor growth by stabilizing branches, and support a competition-based model for dendrite growth.

AMPA receptors regulate experience-dependent dendritic arbor growth in vivo.

Die Gr&ouml;&szlig;e und Form der neuronalen dendritischer Dorne beeinflussen die Anzahl und Art der synaptischen Eing&auml;nge, sowie die Komplexit&auml;t und Funktion von Gehirn-Schaltungen. Im intakten Gehirn sind dendritische Arbor Wachstum und die Entwicklung von exzitatorischen Glutamat Synapse gleichzeitige. Daher war es schwierig zu l&ouml;sen, ob synaptische Eing&auml;nge dendritische Arbor Entwicklung fahren. Hier testen wir die Rolle des AMPA-Rezeptors (AMPAR)-vermittelte Glutamat-&Uuml;bertragung in Dendrit Wachstum zum Ausdruck bringen, Peptide, die intrazellul&auml;ren C-terminalen Dom&auml;nen AMPAR Untereinheiten GluR1 (GluR1Ct) entspricht und GluR2 (GluR2Ct) in Optik tectal Neuronen des Xenopus Retinotectal Systems. Diese Peptide verringern erheblich AMPAR synaptischen &Uuml;bertragung in transfizierte Neuronen w&auml;hrend visuelle System Schaltung intakt. T&auml;gliche in-vivo imaging &uuml;ber 5 Tage ergab, dass GluR1Ct oder GluR2Ct Ausdruck Dendrit Wachstum, was zu weniger komplexen Dorne als Steuerelemente drastisch beeintr&auml;chtigt. Zeitraffer-Bilder-besonders im Abstand von 2 Stunden &uuml;ber 6 h zeigen, dass sowohl die GluR1Ct als auch die GluR2Ct Branch Lebensdauer verringern. Ultrastrukturelle Analyse ergibt, dass Synapsen gebildet auf Neuronen, die Ausdruck der GluRCt weniger ausgereift als Synapsen auf Steuerelement Neuronen sind. Diese Daten legen nahe, dass das Vers&auml;umnis, komplexe Dorne bilden aufgrund reduzierter Stabilisierung der neuen Synapsen und dendritischer Verzweigungen. Obwohl visuelle Stimulation dendritischer Arbor Wachstumsraten im Steuerelement tectal Neuronen erh&ouml;ht, f&uuml;hrt eine schwache postsynaptisches Reaktion auf visuelle Erfahrung in GluRCt Ausdr&uuml;cken Zellen zur R&uuml;cknahme der Zweige. Diese Ergebnisse zeigen, dass AMPAR-vermittelten &Uuml;bertragung zugrunde liegt Erfahrung-abh&auml;ngige dendritische Arbor Wachstum von Filialen zu stabilisieren und ein Wettbewerb basierendes Modell Dendrit Wachstum zu unterst&uuml;tzen.

AMPA-Rezeptoren regulieren Erfahrung-abh&auml;ngige dendritische Arbor Wachstum in-vivo.

The synaptotropic hypothesis, which states that synaptic inputs control the elaboration of dendritic (and axonal) arbors was articulated by Vaughn in 1989. Today the role of synaptic inputs in controlling neuronal structural development remains an area of intense research activity. Several recent studies have applied modern molecular genetic, imaging and electrophysiological methods to this question and now provide strong evidence that maturation of excitatory synaptic inputs is required for the development of neuronal structure in the intact brain. Here we critically review data concerning the hypothesis with the expectation that understanding the circumstances when the data do and do not support the hypothesis will be most valuable. The synaptotrophic hypothesis contributes at both conceptual and mechanistic levels to our understanding of how relatively minor changes in levels or function of synaptic proteins may have profound effects on circuit development and plasticity.

The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis.

Die Synaptotropic-Hypothese, die besagt, dass synaptische Eing&auml;nge die Ausarbeitung der dendritischen (und axonale) Dorne Steuern wurde 1989 von Vaughn formuliert. Heute bleibt die Rolle der synaptischen Eing&auml;nge im controlling neuronale Strukturentwicklung intensiver Forschung T&auml;tigkeitsfeld. Mehrere aktuelle Studien moderne Molekulare genetische, imaging und elektrophysiologische Methoden angewendet haben, auf diese Frage und bieten jetzt zuverl&auml;ssig nachgewiesen, dass die Reifung der erregenden synaptischen Eing&auml;nge f&uuml;r die Entwicklung der neuronalen Struktur im intakten Gehirn ben&ouml;tigt. Hier &uuml;berpr&uuml;fen wir kritisch Daten betreffend die Hypothese mit der Erwartung, die Umst&auml;nde zu verstehen, wenn die Daten und nicht die Hypothese unterst&uuml;tzen der wertvollsten sein wird. Die Synaptotrophic-Hypothese tr&auml;gt sowohl konzeptionelle und mechanistische Niveaus, um unser Verst&auml;ndnis davon, wie relativ wenige &Auml;nderungen in Ebenen oder Funktion der synaptischen Proteine haben gro&szlig;e Auswirkungen auf Schaltung Entwicklung und Plastizit&auml;t.

Die Regulierung der dendritischen Arbor Entwicklung und Plastizit&auml;t durch Glutamat synaptische Input: ein &Uuml;berblick &uuml;ber die Synaptotrophic-Hypothese.

The immature brain is exceptionally susceptible to seizures. However, it remains unclear whether seizures occurring during development affect critical processes underlying neural circuit formation, leading to long-term functional consequences. Here we characterize a novel in vivo model system of developmental seizures based on the transparent albino Xenopus laevis tadpole, which allows direct examination of seizure activity, and seizure-induced effects on neuronal development within the intact unanesthetized brain. Pentylenetetrazol (PTZ), kainic acid, bicuculline, picrotoxin, 4-aminopyridine, and pilocarpine were tested for their ability to induce behavioral seizures in freely swimming tadpoles when bath applied. All six chemoconvulsants consistently induced similar patterns of abnormal behavior in a dose-dependent manner, characterized by convulsive clonus-like motor patterns with periods of behavioral arrest. Extracellular field recordings demonstrated rhythmic synchronous epileptiform electrographic responses induced by convulsants irrespective of mechanism of action, that could be terminated by the anti-epileptic drug valproate. PTZ-induced seizures were further characterized using in vivo two-photon fluorescence imaging of neuronal calcium dynamics, in unanesthetized immobilized tadpoles. Imaging of calcium dynamics during PTZ-induced seizures revealed waves of neural activity propagating through large populations of neurons within the brain. Analysis of single-cell responses demonstrated distinct synchronized high-amplitude calcium spikes not observed under baseline conditions. Similar to other developmental seizure models, prolonged seizures failed to induce marked neuronal death within the brain, detected by cellular propidium iodide incorporation in vivo or TUNEL labeling. This novel developmental seizure model system has distinct advantages for controlled seizure induction, and direct visualization of both seizure activity and seizure-induced effects on individual developing neurons within the intact unanesthetized brain. Such a system is necessary to address important questions relating to the long-term impact of common perinatal seizures on developing neural circuits.

In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model.

Das unreife Gehirn ist besonders anf&auml;llig f&uuml;r Kr&auml;mpfe. Allerdings bleibt unklar, ob Anf&auml;lle auftreten w&auml;hrend der Entwicklung kritischer Prozesse Neuronaler Schaltkreis-Bildung, zur funktionalen Sp&auml;tfolgen zugrunde beeinflussen. Hier pr&auml;gen wir neuartige in-vivo Modellsystem Entwicklungsst&ouml;rungen Sicherstellungen, basierend auf der transparenten Albino Xenopus Laevis Kaulquappe, die direkte Pr&uuml;fung der Beschlagnahme-Aktivit&auml;t, und induziert durch Beschlagnahme von Auswirkungen auf die neuronale Entwicklung im intakten unanesthetized Gehirn erm&ouml;glicht. Pentetrazol (PTZ), Kainic S&auml;ure, Bicuculline Picrotoxin, 4-Pyridinamin und Pilocarpin wurden getestet, f&uuml;r ihre F&auml;higkeit zu Verhaltens-Anf&auml;llen Kaulquappen frei schwimmen, wenn Bad angewendet. Alle sechs Chemoconvulsants induzierte konsequent &auml;hnliche abnorme Verhaltensmuster in dosisabh&auml;ngiger Weise charakterisiert durch konvulsivische Klonus-&auml;hnlichen motor Muster mit Perioden von verhaltensbasierten Verhaftung. Extrazellul&auml;re Field Recordings bewiesen rhythmische synchrone Epileptiform Elektrografische Reaktionen induziert durch Convulsants ungeachtet der Wirkungsmechanismus, die durch die Antiepileptika Medikament Valproat beendet werden konnte. PTZ-induzierte Anf&auml;lle waren weitere gekennzeichnet mit in-vivo-zwei-Photonen-Fluoreszenz-Bildgebung der neuronale Kalzium-Dynamik, in unanesthetized immobilisierte Kaulquappen. Bildgebung der Kalzium-Dynamik bei PTZ-induzierte Anf&auml;lle offenbart Wellen der neuronalen Aktivit&auml;t propagieren durch gro&szlig;e Bev&ouml;lkerungen der Neuronen im Gehirn. Analyse der einzelnen Zelle Antworten zeigte unterschiedliche synchronisierte hoher Amplitude Kalzium-Spitzen, die nicht unter geplanten Bedingungen beobachtet. &Auml;hnlich wie andere Entwicklungsst&ouml;rungen Beschlagnahme Modelle, l&auml;ngere Anf&auml;lle konnte nicht markierten neuronalen Tod innerhalb des Gehirns, erkannt durch zellul&auml;re Propidium Jodid Einbindung in-vivo oder TUNEL Kennzeichnung zu induzieren. Diese neuartige Entwicklungsst&ouml;rungen Beschlagnahme-Modell-System hat deutliche Vorteile f&uuml;r kontrollierte Beschlagnahme Induktion und direkte Visualisierung der Beschlagnahme Aktivit&auml;t und Beschlagnahme-induzierte Effekte auf einzelne entwickelnden Neuronen im Gehirn intakt unanesthetized. Ein solches System ist notwendig, um wichtige Fragen in Bezug auf die langfristigen Auswirkungen der gemeinsamen Perinatale Anf&auml;lle auf die Entwicklung von neuronalen Schaltkreise zu begegnen.

In-vivo Bildgebung der Beschlagnahme Aktivit&auml;t in einem neuartigen Entwicklungsst&ouml;rungen Beschlagnahme-Modell.

The molecular mechanisms underlying activity-dependent neural circuit growth and plasticity during early brain development remain poorly understood. Protein kinase Mzeta (PKMz), an endogenous constitutively active kinase associated with late-phase long-term synaptic potentiation and memory in the mature brain, is expressed in the embryonic Xenopus retinotectal system with heightened levels during peak periods of dendrite growth and synaptogenesis. In vivo rapid time-lapse imaging of actively growing tectal neurons and comprehensive three-dimensional tracking of dynamic dendritic growth behavior finds that altered PKMz activity affects morphologic stabilization. Exogenous expression of PKMz within single neurons stabilizes dendritic filopodia by increasing dendritic filopodial lifetimes and decreasing filopodial additions, eliminations, and motility, whereas long-term in vivo imaging demonstrates restricted expansion of the dendritic arbor. Alternatively, blocking endogenous PKMz activity in individual growing tectal neurons with an inhibitory peptide (zeta-inhibitory peptide) destabilizes dendritic filopodia and over long periods promotes excessive arbor expansion. Furthermore, inhibiting endogenous PKMz throughout the tectum decreases colocalization of immunostained presynaptic and postsynaptic markers, SNAP-25 and PSD-95, respectively, suggesting impaired synapse maintenance. Together, these results implicate PKMz activity in restricting dendritic arborization during embryonic brain circuit development through synaptotropic stabilization of dynamic processes.

PKM zeta restricts dendritic arbor growth by filopodial and branch stabilization within the intact and awake developing brain.

Die molekularen Mechanismen Neuronaler Schaltkreis leistungsabh&auml;ngige Wachstum und Plastizit&auml;t w&auml;hrend der fr&uuml;hen Gehirnentwicklung bleiben weitgehend unverstanden. Proteinkinase Mzeta (PKMz), eine endogene konstitutiv aktive Kinase-Sp&auml;tphase langfristigen synaptischen Potenzierung und Speicher im Reife Gehirn zugeordnet wird in der embryonalen Xenopus-Retinotectal-System mit erh&ouml;hten Ebenen w&auml;hrend der Spitzenzeiten Dendrit Wachstums-und Synaptogenese ausgedr&uuml;ckt. In-vivo schnelle Time-Lapse Bildgebung der aktiv wachsenden tectal Neuronen und umfassende dreidimensionale Tracking von dendritischen Wachstumsdynamik Verhalten findet, die PKMz Aktivit&auml;t ver&auml;ndert betrifft morphologische Stabilisierung. Exogene Ausdruck des PKMz innerhalb der einzelnen Neuronen stabilisiert dendritische Filopodium durch Steigerung der dendritischen Filopodial Lebensdauer und abnehmende Filopodial Erg&auml;nzungen, Eliminierungen und Motilit&auml;t, w&auml;hrend langfristige in-vivo Bildgebung beschr&auml;nkten Ausbau der dendritischen Arbor veranschaulicht. Alternativ blockiert endogene PKMz Aktivit&auml;t in einzelnen wachsenden tectal Neuronen mit einem hemmenden Peptid (Zeta-hemmenden Peptid) destabilisiert dendritische Filopodium und &uuml;ber einen l&auml;ngeren Zeitraum f&ouml;rdert &uuml;berm&auml;&szlig;iger Arbor Erweiterung. Dar&uuml;ber hinaus verringert Hemmung der endogenen PKMz w&auml;hrend der Tectum Kolokalisation Immunostained pr&auml;synaptischen und postsynaptisches Marker, SNAP-25 und PSD-95, bzw. gest&ouml;rte Synapse Wartung vorgeschlagen. Diese Ergebnisse implizieren zusammen, PKMz Aktivit&auml;t dendritische Arborization w&auml;hrend der embryonalen Gehirn Schaltung Entwicklung durch Synaptotropic Stabilisierung der dynamischen Prozesse beschr&auml;nken.

PKM Zeta schr&auml;nkt dendritische Arbor Wachstum durch Filopodial und Branch Stabilisierung innerhalb der intakten und wach Gehirn zu entwickeln.

During embryogenesis, brain neurons receiving the same sensory input may undergo potentiation or depression. While the origin of variable plasticity in vivo is unknown, it plays a key role in shaping dynamic neural circuit refinement. Here, we investigate effects of natural visual stimuli on neuronal firing within the intact, awake, developing brain using calcium imaging of 100 s of central neurons in the Xenopus retinotectal system. We find that specific patterns of visual stimuli shift population responses toward either potentiation or depression in an N-methyl-D-aspartate receptor (NMDA-R)-dependent manner. In agreement with Bienenstock-Cooper-Munro metaplasticity, our results show that functional potentiation or depression can be predicted by individual neurons' specific receptive field properties and historic firing rates. Interestingly, this activity-dependent metaplasticity is itself NMDA-R dependent. Furthermore, network analysis reveals increased correlated firing of neurons that undergo potentiation. These findings implicate metaplasticity as a natural property regulating experience-dependent refinement of nascent embryonic brain circuits.

Metaplasticity governs natural experience-driven plasticity of nascent embryonic brain circuits.

W&auml;hrend der Embryogenese k&ouml;nnen Gehirn Neuronen empfangen den gleichen sensorischen Input Potenzierung oder Depression unterzogen werden. W&auml;hrend der Ursprung der in-vivo Variable Plastizit&auml;t unbekannt ist, spielt es eine Schl&uuml;sselrolle bei der Gestaltung dynamischer neuronaler Schaltkreis Raffinesse. Hier untersuchen wir die Auswirkungen der nat&uuml;rlichen visuellen Reizen auf neuronale Feuern im intakt, wach, sich entwickelnde Gehirn mit Kalzium Bildgebung von 100 s von zentralen Neuronen im Xenopus Retinotectal System. Wir finden, dass bestimmte Muster von visuellen Reizen Bev&ouml;lkerung Antworten in Richtung Potenzierung oder Depression in eine N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDA-R) verlagern-abh&auml;ngigen Weise. Im Einvernehmen mit den Bienenstock-Cooper-Munro Metaplastizit&auml;t zeigen unsere Ergebnisse, dass funktionelle Potenzierung oder Depression kann von einzelnen Neuronen spezifische rezeptive Feldeigenschaften vorhergesagt und historische Preise zu feuern. Interessant ist, dass diese leistungsabh&auml;ngige Metaplastizit&auml;t selbst NMDA-R abh&auml;ngig. Netzwerkanalyse zeigt dar&uuml;ber hinaus erh&ouml;hte korrelierte Feuern von Neuronen, die Potenzierung unterzogen werden. Diese Erkenntnisse implizieren Metaplastizit&auml;t als nat&uuml;rliche Eigenschaft Regulierung Erfahrung-abh&auml;ngige Verfeinerung der aufkeimenden embryonalen Gehirn Schaltungen.

Metaplastizit&auml;t regelt die nat&uuml;rliche Erfahrung-gesteuerte Plastizit&auml;t der aufkeimenden embryonalen Gehirn Schaltungen.

Sensory experience can elicit long-lasting plasticity of both single neurons and ensemble neural circuit response properties during embryonic development. To investigate their relationship, one must image functional responses of large neuronal populations simultaneously with single-cell resolution. In this protocol, we describe a noninvasive approach to assay functional plasticity of individual neurons and neuronal populations in vivo using targeted infusion of calcium-sensitive dyes, two-photon microscopy and synchronized visual stimuli presentations. This technique allows visualization of approximately 200 neurons while probing visual responses in the optic tectum of awake, immobilized Xenopus laevis tadpoles. The protocol includes visual training paradigms that elicit long-lasting potentiation or depression of functional responses, allowing investigations of population and single-neuron plasticity induced by natural sensory stimuli in the awake, intact, developing brain. Setup time for this protocol, including dye injection and chamber preparation, is approximately 2 h. Excitability probing experiments can then be performed for at least 3 h.

In vivo single-cell excitability probing of neuronal ensembles in the intact and awake developing Xenopus brain.

Sensorische Erfahrung kann langfristige Plastizit&auml;t der einzelnen Neuronen und Ensemble neuralen Schaltkreis Antwort Eigenschaften w&auml;hrend der Embryonalentwicklung entlocken. Um ihre Beziehung zu untersuchen, muss eine funktionale Antworten der gro&szlig;en neuronalen Populationen gleichzeitig mit einzelligen Aufl&ouml;sung Bild. In diesem Protokoll beschreiben wir einen nicht-invasive Ansatz um funktionelle Plastizit&auml;t der einzelnen Neuronen und in-vivo mit gezielten Infusion von Kalzium-empfindlichen Farbstoffen, zwei-Photonen-Mikroskopie und synchronisierte visuelle Reize Pr&auml;sentationen neuronalen Populationen Brutversuch. Diese Technik erm&ouml;glicht die Visualisierung von rund 200 Neuronen w&auml;hrend der Sondierung visuelle Antworten in der Optik Tectum wach, immobilisierte Xenopus Laevis Kaulquappen. Das Protokoll enth&auml;lt visuelle Training-Paradigmen, die langfristig Potenzierung oder funktionale Antworten, so dass Untersuchungen der Bev&ouml;lkerung und Einzel-Neuron Plastizit&auml;t induziert durch nat&uuml;rliche sensorische Reize im Gehirn wach, intakt, sich entwickelnde Depression hervorrufen. R&uuml;stzeit f&uuml;r dieses Protokoll, einschlie&szlig;lich Farbstoff-Injektion und Kammer-Vorbereitung, ist ca. 2 h. Erregbarkeit bohrenden Experimente dann f&uuml;r mindestens 3 h durchgef&uuml;hrt werden k&ouml;nnen.

Entwickeln in Vivo einzellige Erregbarkeit Sondierung der neuronalen Ensembles in der intakten und wach Xenopus Gehirn.

Cell adhesion molecules are well characterized for mediating synapse initiation, specification, differentiation, and maturation, yet their contribution to directing dendritic arborization during early brain circuit formation remains unclear. Using two-photon time-lapse imaging of growing neurons within intact and awake embryonic Xenopus brain, we examine roles of Î²-neurexin (NRX) and neuroligin-1 (NLG1) in dendritic arbor development. Using methods of dynamic morphometrics for comprehensive 3D quantification of rapid dendritogenesis, we find initial trans-synaptic NRX-NLG1 adhesions confer transient morphologic stabilization independent of NMDA receptor activity, whereas persistent stabilization requires NMDA receptor-dependent synapse maturation. Disrupting NRX-NLG1 function destabilizes filopodia while reducing synaptic density and AMPA receptor mEPSC frequency. Altered dynamic growth culminates in reduced dendritic arbor complexity as neurons mature over days. These results expand the synaptotropic model of dendritogenesis to incorporate cell adhesion molecule-mediated morphological stabilization necessary for directing normal dendritic arborization, providing a potential morphological substrate for developmental cognitive impairment associated with cell adhesion molecule mutations.

Neurexin-neuroligin cell adhesion complexes contribute to synaptotropic dendritogenesis via growth stabilization mechanisms in vivo.

ZELLADH&Auml;SIONSMOLEK&Uuml;LE zeichnen sich f&uuml;r die Vermittlung von Synapse-Einleitung, Spezifikation, Differenzierung und Reifung, dennoch ihren Beitrag zur Regie dendritische Arborization w&auml;hrend der fr&uuml;hen Gehirn Schaltung Bildung bleibt unklar. Mit zwei-Photonen Zeitraffer Bildgebung der wachsenden Neuronen innerhalb intakt und wach embryonalen Xenopus-Gehirn, untersuchen wir die Rollen von &beta;-Neurexin (NRX) und Neuroligin-1 (NLG1) in dendritischen Arbor Entwicklung. Verwenden dynamische Morphometrie f&uuml;r umfassende 3D Quantifizierung der schnellen Dendritogenesis, finden wir dass erste Trans-synaptische NRX-NLG1 Adh&auml;sionen transient morphologische Stabilisierung unabh&auml;ngig von NMDA-Rezeptor-Aktivit&auml;t, verleihen dauerhafte Stabilisierung NMDA-Rezeptor-abh&auml;ngige Synapse Reifung erfordert. Unterbrechung des NRX-NLG1 Funktion destabilisiert Filopodium synaptische Dichte und AMPA-Rezeptor mEPSC Frequenz reduziert. Ge&auml;nderte Wachstumsdynamik gipfelt in reduzierten dendritische Arbor Komplexit&auml;t wie Neuronen &uuml;ber Tage &auml;ltere. Diese Ergebnisse erweitern das Synaptotropic Modell der Dendritogenesis Zelle Adh&auml;sion Molek&uuml;l-vermittelte morphologische Stabilisierung notwendig f&uuml;r die Leitung der normalen dendritische Arborization, die einem m&ouml;glichen morphologischen Substrat f&uuml;r Entwicklungsst&ouml;rungen kognitive Beeintr&auml;chtigung, die Adh&auml;sion Molek&uuml;l Zellver&auml;nderungen zugeordnet zu &uuml;bernehmen.

Neurexin-Neuroligin Zelle Adh&auml;sion komplexe tragen zur Synaptotropic Dendritogenesis &uuml;ber Wachstum Stabilisierungsmechanismen in-vivo.

Using in vivo rapid and long-interval two-photon time-lapse imaging of brain neuronal growth within the intact and unanesthetized Xenopus laevis tadpole, we characterize dynamic dendritic growth behaviors of filopodia, branches, and dendritic growth cones (DGCs), and analyze their contribution to persistent arbor morphology. The maturational progression of dynamic dendritogenesis was captured by short-term, 5 min interval, imaging for 1h every day for 5 days, and the contribution of short-term growth to persistent structure was captured by imaging at 5 min intervals for 5h, and at 2h intervals for 10h during the height of arbor growth. We find that filopodia and branch stability increases with neuronal maturation, and while the vast majority of dendritic filopodia rapidly retract, 3-7% of interstitial filopodia transition into persistent branches with lifetimes greater than 90 min. Here, we provide the first characterization of DGC dynamics, including morphology and behavior, in the intact and awake developing vertebrate brain. We find that DGCs occur on all growing branches indicating an essential role in branch elongation, and that DGC morphology correlates with dendritic branch growth behavior and varies with maturation. These results demonstrate that dendritogenesis involves a remarkable amount of continuous remodeling, with distinct roles for filopodia and DGCs across neuronal maturation. Â© 2011 Wiley Periodicals, Inc. Develop Neurobiol, 2011.

Dynamic Morphometrics reveals contributions of dendritic growth cones and filopodia to dendritogenesis in the intact and awake embryonic brain.

Mit in-vivo schnelle und lang-Intervall zwei-Photonen Zeitraffer Imaging Gehirn neuronale Wachstum innerhalb der intakt und unanesthetized Xenopus Laevis Kaulquappe, Dendritische Wachstumsdynamik Verhaltensweisen von Filopodium, Zweige und dendritischen Wachstums Zapfen (DGCs) zu charakterisieren, und analysieren wir ihren Beitrag zur permanenten Arbor Morphologie. Die Reifungs-Progression der dynamischen Dendritogenesis geriet kurzfristige, 5 min Pause, imaging f&uuml;r 1 h t&auml;glich f&uuml;r 5 Tage, und des Beitrags der Kurzzeit-Wachstum auf best&auml;ndige Struktur wurde von Imaging in Intervallen von 5 min f&uuml;r 5 h und im Abstand von 2 Stunden f&uuml;r 10 h auf dem H&ouml;hepunkt der Arbor Wachstum. Wir finden, dass Filopodium und Branch Stabilit&auml;t erh&ouml;ht mit neuronalen Reifung, und w&auml;hrend die &uuml;berwiegende Mehrheit der dendritischen Filopodium schnell zur&uuml;ckziehen, 3-7 % interstitielle Filopodium &Uuml;bergang in dauerhafte Niederlassungen mit Lebensdauer gr&ouml;&szlig;er als 90 min. Hier bieten wir die erste Charakterisierung der DGC-Dynamik, auch Morphologie und Verhalten, die intakt und wach vertebrate Gehirn zu entwickeln. Wir finden, dass die DGCs treten bei allen wachsenden Zweigen angibt, eine wesentliche Rolle in der Filiale Dehnung und die DGC-Morphologie korreliert mit dendritische Verzweigung Wachstum Verhalten und variiert mit der Reifung. Diese Ergebnisse zeigen, dass Dendritogenesis eine beachtliche Menge an kontinuierlichen Umbau, mit Rollen f&uuml;r Filopodium und DGCs &uuml;ber neuronale Reifung beinhaltet. &copy; 2011 Wiley-Zeitschriften, Inc. entwickeln Neurobiol, 2011.

Dynamische Morphometrie zeigt Beitr&auml;ge von dendritischen Wachstums Kegeln und Filopodium zu Dendritogenesis im embryonalen Gehirn intakt und wach.

Function directs form of neuronal architecture.

Funktion leitet die Form der neuronalen Architektur.

Single-cell electroporation (SCE) is a versatile technique for delivering electrically charged macromolecules, including DNA, RNA, synthetic oligonucleotides, peptides, dyes, and drugs, to individual cells within intact tissues. Here, we describe methods for SCE of single tectal neurons within the albino Xenopus laevis tadpole for delivery of plasmid DNA-expressing protein fluorophores or fluorescent dye. Individual neurons labeled by this technique can then be imaged in three dimensions (3D) within the intact and living brain using in vivo two-photon microscopy for studies of morphology and growth. The SCE protocol is relatively simple and requires minimal and common laboratory equipment, including a fluorescent stereomicroscope, micropipette puller, and electrical stimulator. Once equipment is set up, learning to label cells with fluorescent dyes is straightforward and usually quickly achieved, because direct visualization with fluorescent microscopy offers immediate feedback of success. The main challenges are positioning the pipette tip in a cell body layer and optimizing pipette tip shape and stimulation parameters. Once fluorescent dye loading has been achieved, transfecting neurons with DNA should follow by using the same pipette tip parameters, but extending the stimulation parameters, because plasmid DNA is larger than dye and requires formation of larger pores. Detectable expression of protein fluorophores from transfected DNA typically takes 6-12 h. SCE for dye loading or DNA transfection of tadpole tectal neurons is highly efficient and can be learned in 1 or 2 d by novice laboratory personnel.

Single-cell electroporation of Xenopus tadpole tectal neurons.

Einzellige Elektroporation (SCE) ist eine vielseitige Technik zur Bereitstellung von elektrisch geladenen Makromolek&uuml;len, einschlie&szlig;lich DNA, RNA, synthetischen Oligonucleotides, Peptide, Farbstoffe und Drogen, um einzelne Zellen im intakten Gewebe. Hier beschreiben wir Methoden f&uuml;r SCE einzelne tectal Neuronen innerhalb der Albino Xenopus Laevis Kaulquappe f&uuml;r die Lieferung von Plasmid DNA-Ausdruck Protein Fluorophore oder Leuchtstofff&auml;rbung. Einzelne Neuronen gekennzeichnet durch diese Technik k&ouml;nnen dann innerhalb des Gehirns intakt und lebendigen mit in-vivo-zwei-Photonen-Mikroskopie f&uuml;r Studien der Morphologie und des Wachstums in drei Dimensionen (3D) dargestellt werden. Das SCE-Protokoll ist relativ einfach und erfordert minimal und gemeinsame Laborger&auml;te, einschlie&szlig;lich eine Fluoreszenz Stereomikroskop, mikropipette Abzieher und elektrischen Stimulator. Sobald Ger&auml;te eingerichtet ist, wird lernen auf Etikett Zellen mit Leuchtstofff&auml;rbungen in der Regel schnell und unkompliziert erreicht weil direkte Visualisierung mit Fluoreszenz-Mikroskopie sofortiges Feedback von Erfolg bietet. Die gr&ouml;&szlig;ten Herausforderungen sind Positionierung der Pipettenspitze in einer Schicht Zellk&ouml;rper und Parameteroptimierung Pipette Tip Shape und Stimulation. Nachdem Leuchtstofff&auml;rbung laden erreicht worden ist, sollten transfecting Neuronen mit DNA folgen, durch Verwendung der gleichen Pipette-Tipp-Parameter, sondern erweitern die Stimulationsparameter da Plasmid-DNA gr&ouml;&szlig;er als Farbstoff ist und Bildung von gr&ouml;&szlig;eren Poren erfordert. Nachweisbar Ausdruck des Proteins Fluorophore aus transfizierte DNA dauert in der Regel 6-12 h. SCE f&uuml;r Farbstoff laden oder DNATransfection Kaulquappe tectal Neuronen ist hoch effizient und kann in 1 oder 2 d von Anf&auml;nger-Labor-Personal erlernt werden.

Einzellige Electroporation Xenopus Kaulquappe tectal Neuronen.

Single-cell electroporation (SCE) is a versatile technique for delivering electrically charged macromolecules including DNA, RNA, synthetic oligonucleotides, peptides, dyes, and drugs to individual cells within intact tissues. Here, we describe methods for in vivo-targeted electroporation of single tectal neurons within the albino Xenopus laevis tadpole. Focal electroporation is achieved using a pipette electrode filled with a solution of the delivery molecules and with a tip diameter much smaller than the width of the target cell. The small tip allows for localization of an electric field, which restricts pore formation to only the individual cell in direct contact with the tip. Thus, the small tip permits focal delivery of the charged molecules within the pipette into individual cells. Factors affecting the efficiency of SCE, as well as various applications of this technique, are discussed. Particular focus is directed toward combining SCE with in vivo two-photon microscopy for three-dimensional (3D) imaging of neuron growth and cell-autonomous effects of altered protein function.

Single-cell electroporation in Xenopus.

Einzellige Elektroporation (SCE) ist eine vielseitige Technik zur Bereitstellung von elektrisch geladenen Makromolek&uuml;len, einschlie&szlig;lich DNA, RNA, synthetische Oligonukleotide, Peptide, Farbstoffe und Medikamente zu einzelnen Zellen im intakten Gewebe. Hier beschreiben wir Methoden zur in Vivo-bezogene Elektroporation von einzelnen tectal Neuronen innerhalb der Albino Xenopus Laevis Kaulquappe. Fokale Electroporation erreicht man mit eine Pipette-Elektrode, gef&uuml;llt mit einer L&ouml;sung aus der Lieferung-Molek&uuml;le und mit einem Tipp-Durchmesser viel kleiner als die Breite des die Zielzelle. Die kleine Spitze erlaubt f&uuml;r die Lokalisierung eines elektrischen Feldes, die Porenbildung auf nur die einzelne Zelle in direktem Kontakt mit der Spitze beschr&auml;nkt. Somit gestattet die kleine Spitze fokale Anlieferung der geladenen Molek&uuml;le innerhalb der Pipette in einzelne Zellen. Faktoren, die die Effizienz der SCE, sowie verschiedene Anwendungen dieser Technik werden erl&auml;utert. Besonderes Augenmerk richtet sich an SCE mit in-vivo-zwei-Photonen-Mikroskopie f&uuml;r dreidimensionale (3D) Bildgebung der Neuron-Wachstum und Zelle-autonome Effekte der ver&auml;nderten Proteinfunktion kombinieren.

Einzellige Electroporation in Xenopus.

Sensory experience drives dramatic structural and functional plasticity in developing neurons. However, for single-neuron plasticity to optimally improve whole-network encoding of sensory information, changes must be coordinated between neurons to ensure a full range of stimuli is efficiently represented. Using two-photon calcium imaging to monitor evoked activity in over 100 neurons simultaneously, we investigate network-level changes in the developing Xenopus laevis tectum during visual training with motion stimuli. Training causes stimulus-specific changes in neuronal responses and interactions, resulting in improved population encoding. This plasticity is spatially structured, increasing tuning curve similarity and interactions among nearby neurons, and decreasing interactions among distant neurons. Training does not improve encoding by single clusters of similarly responding neurons, but improves encoding across clusters, indicating coordinated plasticity across the network. NMDA receptor blockade prevents coordinated plasticity, reduces clustering, and abolishes whole-network encoding improvement. We conclude that NMDA receptors support experience-dependent network self-organization, allowing efficient population coding of a diverse range of stimuli.

Functional Clustering Drives Encoding Improvement in a Developing Brain Network during Awake Visual Learning.

Sensorische Erfahrung treibt dramatische strukturelle und funktionelle Plastizit&auml;t in der Entwicklung von Neuronen. Jedoch m&uuml;ssen f&uuml;r Einzel-Neuron Plastizit&auml;t optimal zu verbessern, ganz-Netzwerk-Codierung von sensorischen Informationen, &Auml;nderungen koordiniert werden zwischen den Neuronen um sicherzustellen, dass vielf&auml;ltige Reize effizient dargestellt wird. Unter Verwendung von zwei-Photonen-Kalzium imaging evozierten Aktivit&auml;ten in mehr als 100 Neuronen gleichzeitig &uuml;berwachen, untersuchen wir auf Netzwerkebene &Auml;nderungen in den Entwicklungsl&auml;ndern Xenopus Laevis Tectum im visuellen Training mit Bewegung reizen. Training verursacht Reiz-spezifischen &Auml;nderungen in neuronale Reaktionen und Interaktionen, was zu verbesserten Bev&ouml;lkerung Codierung. Diese Plastizit&auml;t ist r&auml;umlich strukturiert, Erh&ouml;hung tuning Kurve &Auml;hnlichkeit und Interaktionen zwischen nahe gelegenen Neuronen, und abnehmender Interaktionen zwischen weit entfernten Neuronen. Training verbessert nicht Codierung durch einzelne Cluster von &auml;hnlich reagieren Neuronen, sondern verbessert &uuml;ber Cluster, Codierung angibt, koordinierte Plastizit&auml;t im Netzwerk. NMDA-Rezeptor-Blockade verhindert koordinierte Plastizit&auml;t, reduziert die Clusterbildung und schafft ganz-Netz Codierung Verbesserung. Wir schlie&szlig;en, dass NMDA-Rezeptoren Erfahrung-abh&auml;ngige Netzwerk Selbstorganisation unterst&uuml;tzen erm&ouml;glicht effiziente Bev&ouml;lkerung Kodierung der zahlreichen Reize.

Article	Year
Illuminating cracks in the fragile mind. Trends in neurosciences\| PubMed ID: 11998683	2002
Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain. Differentiation; research in biological diversity\| PubMed ID: 12147134	2002
Dendrite growth increased by visual activity requires NMDA receptor and Rho GTPases. Nature\| PubMed ID: 12368855	2002
The human MC4R promoter: characterization and role in obesity. Diabetes\| PubMed ID: 14633862	2003
AMPA receptors regulate experience-dependent dendritic arbor growth in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 16882725	2006
The regulation of dendritic arbor development and plasticity by glutamatergic synaptic input: a review of the synaptotrophic hypothesis. The Journal of physiology\| PubMed ID: 18202093	2008
In vivo imaging of seizure activity in a novel developmental seizure model. Experimental neurology\| PubMed ID: 18402939	2008
PKM zeta restricts dendritic arbor growth by filopodial and branch stabilization within the intact and awake developing brain. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience\| PubMed ID: 19793981	2009
Metaplasticity governs natural experience-driven plasticity of nascent embryonic brain circuits. Neuron\| PubMed ID: 19874791	2009
In vivo single-cell excitability probing of neuronal ensembles in the intact and awake developing Xenopus brain. Nature protocols\| PubMed ID: 20379139	2010
Neurexin-neuroligin cell adhesion complexes contribute to synaptotropic dendritogenesis via growth stabilization mechanisms in vivo. Neuron\| PubMed ID: 20869594	2010
Dynamic Morphometrics reveals contributions of dendritic growth cones and filopodia to dendritogenesis in the intact and awake embryonic brain. Developmental neurobiology\| PubMed ID: 21793227	2011
Function directs form of neuronal architecture. Bioarchitecture\| PubMed ID: 21866253	2011
Single-cell electroporation of Xenopus tadpole tectal neurons. Cold Spring Harbor protocols\| PubMed ID: 21880812	2011
Single-cell electroporation in Xenopus. Cold Spring Harbor protocols\| PubMed ID: 21880813	2011
Functional Clustering Drives Encoding Improvement in a Developing Brain Network during Awake Visual Learning. PLoS biology\| PubMed ID: 22253571	2012

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