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Determination of Molecular Structures of HIV Envelope Glycoproteins using Cryo-Electron Tomography and Automated Sub-tomogram Averaging

Since its discovery nearly 30 years ago, more than 60 million people have been infected with the human immunodeficiency virus (HIV) (www.usaid.gov). The ...

Therapeutika Brequinar Natrium und leflunomid (Arava) arbeiten durch Bindung in einem hydrophoben Tunnel durch eine sehr Variable N-Terminus Familie 2-Dihydroorotate-Dehydrogenase (DHODH) gebildet. Die x-ray kristallographische Struktur der ein analoges Brequinar an menschlichen DHODH gebunden wurde ermittelt. In Silico schlug Screening von einer Bibliothek Verbindungen eine andere Teilmenge der Brequinar-Analoga, die nicht menschliche DHODH als potenziell wirksame Inhibitoren von Plasmodium Falciparum DHODH hemmen.

Brequinar-Derivate und artspezifische Drug Design f&uuml;r Dihydroorotate-Dehydrogenase.

Therapeutic agents brequinar sodium and leflunomide (Arava) work by binding in a hydrophobic tunnel formed by a highly variable N-terminus of family 2 dihydroorotate dehydrogenase (DHODH). The X-ray crystallographic structure of an analog of brequinar bound to human DHODH was determined. In silico screening of a library of compounds suggested another subset of brequinar analogs that do not inhibit human DHODH as potentially effective inhibitors of Plasmodium falciparum DHODH.

Brequinar derivatives and species-specific drug design for dihydroorotate dehydrogenase.

Membrane-associated dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) is an antimalarial therapeutic target without an effective inhibitor. Studies on human DHODH (HsDHODH) led to a structural mechanistic model in which respiratory quinones bind in a tunnel formed by the highly variable N-terminus that leads to the flavin mononucleotide-binding site. The therapeutic agents leflunomide (Arava) and brequinar sodium inhibit HsDHODH by binding in this tunnel. Plasmodium falciparum DHODH (PfDHODH) and HsDHODH have markedly different sensitivities to the two drugs. To understand the structural basis of this differential sensitivity and begin a structure-based drug-design cycle for PfDHODH inhibitors, the three-dimensional structure (2.4 Angstroms, R = 20.1%) of PfDHODH bound to the active metabolite of leflunomide was determined by X-ray crystallography. Comparison of the structures of HsDHODH and PfDHODH reveals a completely different binding mode for the same inhibitor in these two catalytically identical enzymes and explains the previously observed species-specific preferential binding. Because no effective inhibitors have been described for PfDHODH, this structure provides critical insight for the design of potential antimalarials.

Structure of Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase with a bound inhibitor.

Membran-assoziierte Dihydroorotate-Dehydrogenase (DHODH) ist ein gegen Malaria therapeutisches Ziel ohne einen wirksamen Inhibitor. Studien zur menschlichen DHODH (HsDHODH) f&uuml;hrte zu ein strukturelles mechanistisches Modell in dem Atemwege Chinone in einem Tunnel binden durch die sehr Variable Amino-Terminus, die zu der Flavin-Mononucleotide-Bindungsstelle f&uuml;hrt gebildet. Die Therapeutika leflunomid (Arava) und Brequinar-Natrium hemmen HsDHODH durch Bindung in diesem Tunnel. Plasmodium Falciparum DHODH (PfDHODH) und HsDHODH haben deutlich unterschiedliche Empfindlichkeiten gegen&uuml;ber den zwei Medikamente. Verstehen die strukturelle Grundlage f&uuml;r diese differenzielle Empfindlichkeit und beginnen einen Struktur-basiertes Wirkstoffdesign-Zyklus f&uuml;r PfDHODH-Inhibitoren, die dreidimensionale Struktur (2,4 Angstr&ouml;m, R = 20,1 %) des PfDHODH gebunden sein, der aktive Metabolit von leflunomid wurde durch Kristallstrukturanalyse bestimmt. Vergleich der Strukturen von HsDHODH und PfDHODH offenbart eine v&ouml;llig andere Bindungsmodus f&uuml;r die gleichen Inhibitor in diese zwei Enzyme, die katalytisch identisch und erkl&auml;rt die zuvor beobachtete artspezifische bevorzugte Bindung. Da keine wirksamen Inhibitoren f&uuml;r PfDHODH beschrieben wurden, bietet diese Struktur kritische Einsicht f&uuml;r die Gestaltung von potenziellen Malariamittel.

Struktur der Plasmodium Falciparum Dihydroorotate Dehydrogenase mit einem gebundenen Inhibitor.

Immunization with a recombinant yeast-expressed Plasmodium falciparum merozoite surface protein 3 (MSP3) protected Aotus nancymai monkeys against a virulent challenge infection. Unfortunately, the production process for this yeast-expressed material was not optimal for human trials. In an effort to produce a recombinant MSP3 protein in a scaleable manner, we expressed and purified near-full-length MSP3 in Escherichia coli (EcMSP3). Purified EcMSP3 formed non-globular dimers as determined by analytical size-exclusion HPLC with in-line multi-angle light scatter and quasi-elastic light scatter detection and velocity sedimentation (R(h) 7.6+/-0.2nm and 6.9nm, respectively). Evaluation by high-resolution atomic force microscopy revealed non-linear asymmetric structures, with beaded domains and flexible loops that were recognized predominantly as dimers, although monomers and larger multimers were observed. The beaded substructure corresponds to predicted structural domains, which explains the velocity sedimentation results and improves the conceptual model of the protein. Vaccination with EcMSP3 in Freund's adjuvant-induced antibodies that recognized native MSP3 in parasitized erythrocytes by an immunofluorescence assay and gave delayed time to treatment in a group of Aotus monkeys in a virulent challenge infection with the FVO strain of P. falciparum. Three of the seven monkeys vaccinated with EcMSP3 had low peak parasitemias. EcMSP3, which likely mimics the native MSP3 structure located on the merozoite surface, is a viable candidate for inclusion in a multi-component malaria vaccine.

Characterization of a protective Escherichia coli-expressed Plasmodium falciparum merozoite surface protein 3 indicates a non-linear, multi-domain structure.

Immunisierung mit einem rekombinanten Hefe ausgedr&uuml;ckt Plasmodium Falciparum Merozoite Oberfl&auml;che Protein 3 (MSP3) gesch&uuml;tzt Aotus Nancymai Affen gegen eine Infektion virulenten Herausforderung. Des Produktionsprozesses f&uuml;r dieses Hefe-ausgedr&uuml;ckt-Material war leider nicht optimal f&uuml;r menschliche Studien. In dem Bem&uuml;hen, ein rekombinantes Protein MSP3 eine skalierbare Weise zu produzieren wir ausgedr&uuml;ckt und in der N&auml;he-Full-Length MSP3 in Escherichia coli (EcMSP3) gereinigt. Gereinigte EcMSP3 gebildet nicht kugelige Dimere festgelegt durch analytische Gr&ouml;&szlig;e-Ausschluss-HPLC mit Inline-Multi-Angle Lichtstreuung und quasi-elastic Lichtstreuung Erkennung und Geschwindigkeit Sedimentation (R(h) 7.6+/-0.2nm und 6.9nm, beziehungsweise). Auswertung von hochaufl&ouml;senden Rasterkraftmikroskopie ergab nichtlineare asymmetrische Strukturen mit Perlen Dom&auml;nen und flexible Loops, die &uuml;berwiegend als Dimere, erkannt wurden, obwohl Monomere und gr&ouml;&szlig;eren Multimere beobachtet wurden. Der wulstige Unterbau entspricht vorhergesagten strukturelle Dom&auml;nen, das erkl&auml;rt die Geschwindigkeit Ablagerung Ergebnisse und verbessert das konzeptionelle Modell des Proteins. Impfung mit EcMSP3 in Freund&#39;s Adjuvans-induzierte Antik&ouml;rper, die native MSP3 in parasitized Erythrozyten durch ein Immunfluoreszenz-Assay erkannt und gab verz&ouml;gert Zeit zur Behandlung in einer Gruppe von Aotus Affen in einer virulenten Herausforderung-Infektion mit der LVA-Belastung von p. Falciparum. Drei der sieben Affen mit EcMSP3 geimpft hatte niedrige Gipfel Parasitemias. EcMSP3, die wahrscheinlich die systemeigene MSP3 Struktur befindet sich auf der Merozoite Oberfl&auml;che imitiert, ist einem denkbaren Kandidaten f&uuml;r die Aufnahme in ein Mehrkomponenten Malaria-Impfstoff.

Charakterisierung von einem sch&uuml;tzenden Escherichia coli ausgedr&uuml;ckt Plasmodium Falciparum Merozoite Oberfl&auml;che Protein 3 gibt eine nicht-lineare, Multi-Domain-Struktur.

The Plasmodium falciparum circumsporozoite protein (CSP) is critical for sporozoite function and invasion of hepatocytes. Given its critical nature, a phase III human CSP malaria vaccine trial is ongoing. The CSP is composed of three regions as follows: an N terminus that binds heparin sulfate proteoglycans, a four amino acid repeat region (NANP), and a C terminus that contains a thrombospondin-like type I repeat (TSR) domain. Despite the importance of CSP, little is known about its structure. Therefore, recombinant forms of CSP were produced by expression in both Escherichia coli (Ec) and then refolded (EcCSP) or in the methylotrophic yeast Pichia pastoris (PpCSP) for structural analyses. To analyze the TSR domain of recombinant CSP, conformation-dependent monoclonal antibodies that recognized unfixed P. falciparum sporozoites and inhibited sporozoite invasion of HepG2 cells in vitro were identified. These monoclonal antibodies recognized all recombinant CSPs, indicating the recombinant CSPs contain a properly folded TSR domain structure. Characterization of both EcCSP and PpCSP by dynamic light scattering and velocity sedimentation demonstrated that both forms of CSP appeared as highly extended proteins (R(h) 4.2 and 4.58 nm, respectively). Furthermore, high resolution atomic force microscopy revealed flexible, rod-like structures with a ribbon-like appearance. Using this information, we modeled the NANP repeat and TSR domain of CSP. Consistent with the biochemical and biophysical results, the repeat region formed a rod-like structure about 21-25 nm in length and 1.5 nm in width. Thus native CSP appears as a glycosylphosphatidylinositol-anchored, flexible rod-like protein on the sporozoite surface.

Structure of the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein, a leading malaria vaccine candidate.

Das Plasmodium Falciparum Circumsporozoite Protein (LSP) ist entscheidend f&uuml;r die Sporozoite Funktion und Invasion der Hepatozyten. Angesichts seiner kritischen Art, ist eine Phase III menschliche CSP Malaria Impfstudie laufenden. Die CSP besteht aus drei Regionen wie folgt: ein Amino-Terminus, die Heparin-Sulfat Proteoglykane bindet, einer vier Aminos&auml;ure wiederholen, Region (NANP) und eine Carboxyl-Terminus, die einen Thrombospondin-wie-Typ, ich wiederhole (TSR) Dom&auml;ne enth&auml;lt. Trotz der Bedeutung der CSP ist wenig bekannt &uuml;ber seine Struktur. Daher rekombinante Formen der CSP wurden von Ausdruck in beiden Escherichia coli (EG) produziert und dann refaltet (EcCSP) oder in die METHYLOTROPHE Hefe Pichia Pastoris (PpCSP) f&uuml;r strukturmechanische Analysen. Um die TSR-Dom&auml;ne des rekombinanten CSP zu analysieren, wurden Konformation abh&auml;ngigen monoklonale Antik&ouml;rper, die nicht fixierten p. Falciparum Sporozoites und HepG2-Zellen in vitro gehemmt Sporozoite Invasion erkannt identifiziert. Diese monoklonalen Antik&ouml;rper erkannt, alle rekombinante CSPs, Angabe der rekombinanten CSPs enthalten eine richtig gefaltete TSR-Dom&auml;nenstruktur. Charakterisierung von EcCSP und PpCSP durch dynamisches Licht Streuung und Geschwindigkeit Sedimentation zeigte, dass beide Formen der CSP als stark erweiterte Proteine erschien (R(h) 4.2 und 4.58 nm, beziehungsweise). Dar&uuml;ber hinaus ergab hohe Aufl&ouml;sung Rasterkraftmikroskopie flexible, Stab-wie Strukturen mit eine Multifunktionsleiste aussehen. Anhand dieser Informationen modelliert wir der NANP Wiederholung und TSR-Gebiet der CSP. In &Uuml;bereinstimmung mit den biochemischen und biophysikalischen Ergebnisse, Wiederholbereich bildete sich eine Stab-Struktur etwa 21-25 nm L&auml;nge und 1,5 nm breit. Somit scheint die native CSP als Glykosylphosphatidyl verankert, flexible Stange-wie Protein auf der Oberfl&auml;che Sporozoite.

Struktur des Plasmodium Falciparum Circumsporozoite Protein, ein f&uuml;hrender Malaria-Impfstoff-Kandidat.

Die Verf&uuml;gbarkeit von N&auml;hrstoffen beeinflusst zellul&auml;ren Wachstum und &Uuml;berleben durch Einwirkung auf Gen-Transkription. Glukokortikoide auch gen-Transkription zu beeinflussen und haben diverse Aktivit&auml;ten auf Zellwachstum, Energieverbrauch und &uuml;berleben. Wir fanden, dass das Wachstum Verhaftung-spezifische 5 (Gas5) nichtkodierende RNA, die reichlich in den Zellen ist deren Wachstum wegen des Mangels an N&auml;hrstoffen oder Wachstumsfaktoren festgenommen wurde, Zellen zum Apoptosis sensibilisiert durch die Unterdr&uuml;ckung von Glukokortikoid-vermittelte Induktion der mehrere Gene reagieren, einschlie&szlig;lich der zellul&auml;ren Inhibitor der Apoptose-2-Codierung. Gas5 gebunden an der DNA-bindenden Dom&auml;ne von der Glucocorticoid-Rezeptor (GR) durch das fungieren als ein K&ouml;der Glucocorticoid Response-Element (GRE), damit im Wettbewerb mit DNA GREs f&uuml;r die Bindung an die GR. Wir schlie&szlig;en, dass Gas5 eine &quot;Riborepressor&quot; der GR, beeinflussen Zelle &uuml;berleben und die metabolischen Aktivit&auml;ten w&auml;hrend Hunger durch Modulation die transkriptionelle Aktivit&auml;t der GR.

Nichtkodierende RNA-gas5 ist ein Wachstum Verhaftung und Hunger-assoziierte Verdr&auml;nger von der Glucocorticoid-Rezeptor.

The availability of nutrients influences cellular growth and survival by affecting gene transcription. Glucocorticoids also influence gene transcription and have diverse activities on cell growth, energy expenditure, and survival. We found that the growth arrest-specific 5 (Gas5) noncoding RNA, which is abundant in cells whose growth has been arrested because of lack of nutrients or growth factors, sensitized cells to apoptosis by suppressing glucocorticoid-mediated induction of several responsive genes, including the one encoding cellular inhibitor of apoptosis 2. Gas5 bound to the DNA-binding domain of the glucocorticoid receptor (GR) by acting as a decoy glucocorticoid response element (GRE), thus competing with DNA GREs for binding to the GR. We conclude that Gas5 is a "riborepressor" of the GR, influencing cell survival and metabolic activities during starvation by modulating the transcriptional activity of the GR.

Noncoding RNA gas5 is a growth arrest- and starvation-associated repressor of the glucocorticoid receptor.

Generalized glucocorticoid resistance syndrome is a rare familial or sporadic condition characterized by partial insensitivity to glucocorticoids, caused by mutations in the glucocorticoid receptor (GR) gene. Most of the reported cases are adults, demonstrating symptoms associated with mineralocorticoid and/or adrenal androgen excess caused by compensatively increased secretion of the adrenocorticotropic hormone.

A novel point mutation in helix 10 of the human glucocorticoid receptor causes generalized glucocorticoid resistance by disrupting the structure of the ligand-binding domain.

Generalisierte Glukokortikoid-Resistenz-Syndrom ist eine seltene famili&auml;re oder sporadische Form durch partielle Schmerzunempfindlichkeit, Glucocorticoide, verursacht durch Mutationen im Gen Glucocorticoid-Rezeptor (GR) charakterisiert. Die meisten der gemeldeten F&auml;lle sind Erwachsene, zeigen Symptome der Mineralokortikoiden und/oder Nebennieren Androgen &uuml;bersch&uuml;ssige durch compensatively erh&ouml;hte Sekretion von der Adrenocorticotropes Hormon verursacht.

Eine neuartige Punktmutation im Helix 10 von den menschlichen Glucocorticoid-Rezeptor verursacht generalisierte Glukokortikoid-Resistenz durch St&ouml;rung der Struktur der Dom&auml;ne Ligand-Bindung.

Antigenic drift in the influenza A virus hemagglutinin (HA) is responsible for seasonal reformulation of influenza vaccines. Here, we address an important and largely overlooked issue in antigenic drift: how does the number and location of glycosylation sites affect HA evolution in man? We analyzed the glycosylation status of all full-length H1 subtype HA sequences available in the NCBI influenza database. We devised the "flow index" (FI), a simple algorithm that calculates the tendency for viruses to gain or lose consensus glycosylation sites. The FI predicts the predominance of glycosylation states among existing strains. Our analyses show that while the number of glycosylation sites in the HA globular domain does not influence the overall magnitude of variation in defined antigenic regions, variation focuses on those regions unshielded by glycosylation. This supports the conclusion that glycosylation generally shields HA from antibody-mediated neutralization, and implies that fitness costs in accommodating oligosaccharides limit virus escape via HA hyperglycosylation.

Glycosylation focuses sequence variation in the influenza A virus H1 hemagglutinin globular domain.

Antigendrift in der Influenza-A-Virus-H&auml;magglutinin (HA) ist verantwortlich f&uuml;r saisonale Neuformulierung des Influenza-Impfstoffe. Hier wir eine Thematik wichtig und weitgehend &uuml;bersehen in Antigendrift: wie wirkt sich die Anzahl und Position der Glykosylierung Seiten aus HA Entwicklung im Mann? Wir analysierten den Glykosylierung-Status aller in H1 Untertyp HA folgen in der Datenbank des NCBI-Grippe. Wir entwickelten den &quot;Flow-Index&quot; (FI), ein einfacher Algorithmus, die die Tendenz, dass Viren zu gewinnen oder verlieren Konsens Glycosylation Websites berechnet. Die FI prognostiziert die Dominanz der Glykosylierung Staaten unter den bestehenden Belastungen. Unsere Analysen zeigen, dass zwar die Anzahl der Glykosylierung Websites in der kugelige HA-Dom&auml;ne nicht das gesamte Ausma&szlig; der Variation in definierten Antigene Regionen beeinflu&szlig;t, Variation durch Glycosylation ungeschirmten Regionen konzentriert. Dies unterst&uuml;tzt die Schlussfolgerung, dass die Glykosylierung HA im Allgemeinen aus antik&ouml;rpervermittelten Neutralisierung abschirmt und impliziert, dass Eignung Kosten in zuvorkommend Oligosaccharide Virus Flucht &uuml;ber HA Hyperglycosylation zu begrenzen.

Article	Year
Brequinar derivatives and species-specific drug design for dihydroorotate dehydrogenase. Bioorganic & medicinal chemistry letters\| PubMed ID: 16406782	2006
Structure of Plasmodium falciparum dihydroorotate dehydrogenase with a bound inhibitor. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography\| PubMed ID: 16510978	2006
Characterization of a protective Escherichia coli-expressed Plasmodium falciparum merozoite surface protein 3 indicates a non-linear, multi-domain structure. Molecular and biochemical parasitology\| PubMed ID: 19073223	2009
Structure of the Plasmodium falciparum circumsporozoite protein, a leading malaria vaccine candidate. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 19633296	2009
Noncoding RNA gas5 is a growth arrest- and starvation-associated repressor of the glucocorticoid receptor. Science signaling\| PubMed ID: 20124551	2010
A novel point mutation in helix 10 of the human glucocorticoid receptor causes generalized glucocorticoid resistance by disrupting the structure of the ligand-binding domain. The Journal of clinical endocrinology and metabolism\| PubMed ID: 20335448	2010
Glycosylation focuses sequence variation in the influenza A virus H1 hemagglutinin globular domain. PLoS pathogens\| PubMed ID: 21124818	2010

Darrell E. Hurt

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