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Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Due to the presence of inhibitors such as extracellular polymeric substances (EPSs) and salts, most microbial mat studies have relied on harsh methods of direct DNA extraction that result in DNA fragments too small for large-insert vector cloning. High molecular weight (HMW) DNA is crucial in functional metagenomic studies, because large fragments present greater access to genes of interest. Here we report improved methodologies for extracting HMW DNA from EPS-rich hypersaline microbial mats. The protocol uses a combination of microbial cell separation with mechanical and chemical methods for DNA extraction and purification followed by precipitation with polyethylene glycol (PEG). The protocol yields >2 Âµg HMW DNA (>48 kb) per gram of mat sample, with A260:280 ratios >1.7. In addition, 16S rRNA gene analysis using denaturing gradient gel electrophoresis and pyrosequencing showed that this protocol extracts representative DNA from microbial mat communities and results in higher overall calculated diversity indices compared with three other standard methods of DNA extraction. Our results show the importance of validating the DNA extraction methods used in metagenomic studies to ensure optimal recovery of microbial richness.

Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats.

Durch die Anwesenheit von Inhibitoren wie extrazellul&auml;rer polymerer Substanzen (EPSs) und Salze haben die meisten mikrobielle Matte Studien auf rauen Methoden der direkten DNA-Extraktion verlassen, die DNA-Fragmente zu klein f&uuml;r gro&szlig;e-Insert Vektor Klonen f&uuml;hren. Hochmolekulare (HMW) DNA ist entscheidend in funktionale durchgef&uuml;hrte metagenomische Studien, weil gro&szlig;e Fragmente besseren Zugang zu den Genen des Interesses zu pr&auml;sentieren. Hier berichten wir &uuml;ber verbesserte Methoden zur Extraktion von HMW-DNA aus EPS-reiche hypersaliner mikrobielle Matten. Das Protokoll verwendet eine Kombination von mikrobiellen Zellseparation mit mechanischen und chemischen Methoden zur DNA-Extraktion und Reinigung mit anschlie&szlig;ender Ausf&auml;llung mit Polyethylenglykol (PEG). Das Protokoll ergibt &gt; 2 &micro;g DNA HMW (&gt; 48KB) pro Gramm Mat Probe mit A260:280-Verh&auml;ltnissen &gt; 1.7. 16S rRNA-gen-Analyse mit Denaturierung Gradienten Gelelektrophorese und Pyrosequencing zeigte au&szlig;erdem, dass dieses Protokoll von Mat Mikrobengemeinschaften und f&uuml;hrt zu h&ouml;heren insgesamt berechneten Vielfalt Indizes verglichen mit drei anderen standard-Methoden der DNA-Extraktion Vertreter DNA extrahiert. Unsere Ergebnisse zeigen die Bedeutung der Validierung der DNA-Extraktion-Methods in durchgef&uuml;hrte metagenomische Studien zur optimalen Regeneration der mikrobiellen Reichtum zu gew&auml;hrleisten.

Benjamin S. Bey

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