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Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

Mono- and dicistronic poliovirus replicons were constructed to express the influenza virus hemagglutinin, retaining its signal peptide and transmembrane region. Picornavirus genomes do not normally encode glycoproteins, and only the dicistronic replicon, in which the foreign and poliovirus sequences were separated by the encephalomyocarditis virus internal ribosomal entry site, replicated and expressed glycosylated hemagglutinin.

Expression of a membrane-anchored glycoprotein, the influenza virus hemagglutinin, by dicistronic replicons derived from the poliovirus genome.

Die Expression eines Membran-verankertes Glycoprotein, das Influenzavirus-H&#xE4;magglutinin von dicistronischen Replikons vom Poliovirus-Genom abgeleitet.

Positive strand RNA virus populations are a collection of similar but genetically different viruses. They exist as viral quasispecies due to the high mutation rates of the low fidelity viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). It is thought that this genomic heterogeneity is advantageous to the population, allowing for adaptation to rapidly changing environments that present varying types and degrees of selective pressure. However, one consequence of this extensive diversity is the susceptibility to mutagens that further increase sequence variation. Since RNA viruses live at the edge of maximal variability, an increase in the mutation rate is likely to force the virus beyond the tolerable mutation frequency into 'error catastrophe'. One such mutagen, ribavirin, is an antiviral nucleoside analog that is mutagenic to several RNA viruses. Ribavirin is incorporated into the viral genome causing lethal mutagenesis and a subsequent decrease in the specific infectivity. Even so, passaging poliovirus in the presence of low to intermediate concentrations of the drug leads to the emergence of a viral population resistant to the effects of ribavirin. These viruses have a point mutation in the RdRp that increases the overall polymerase fidelity. Interestingly, as predicted by the quasispecies theory, ribavirin resistant viruses are less adaptable, as they are more susceptible to other non-mutagenic antiviral drugs and are highly attenuated in vivo. Here, we review the mechanism of action of ribavirin on poliovirus and other RNA viruses, the possibility for escape via increased fidelity of the viral polymerase, the consequences of this response on viral population dynamics, and the biological implications for the therapeutic use of mutagenic antiviral agents.

Ribavirin and lethal mutagenesis of poliovirus: molecular mechanisms, resistance and biological implications.

Ribavirin und t&#xF6;dliche Mutagenese des Poliovirus: molekulare Mechanismen, Best&#xE4;ndigkeit und biologische Auswirkungen.

The kinetic, thermodynamic, and structural basis for fidelity of nucleic acid polymerases remains controversial. An understanding of viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) fidelity has become a topic of considerable interest as a result of recent experiments that show that a 2-fold increase in fidelity attenuates viral pathogenesis and a 2-fold decrease in fidelity reduces viral fitness. Here we show that a conformational change step preceding phosphoryl transfer is a key fidelity checkpoint for the poliovirus RdRp (3Dpol). We provide evidence that this conformational change step is orientation of the triphosphate into a conformation suitable for catalysis, suggesting a kinetic and structural model for RdRp fidelity that can be extrapolated to other classes of nucleic acid polymerases. Finally, we show that a site remote from the catalytic center can control this checkpoint, which occurs at the active site. Importantly, similar connections between a remote site and the active site exist in a wide variety of viral RdRps. The capacity for sites remote from the catalytic center to alter fidelity suggests new possibilities for targeting the viral RdRp for antiviral drug development.

Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase.

Remote-Ort-Steuerung eines aktiven Zentrums Treue Kontrollpunkt in einem viralen RNA-abh&#xE4;ngigen RNA-Polymerase.

An RNA virus population does not consist of a single genotype; rather, it is an ensemble of related sequences, termed quasispecies. Quasispecies arise from rapid genomic evolution powered by the high mutation rate of RNA viral replication. Although a high mutation rate is dangerous for a virus because it results in nonviable individuals, it has been hypothesized that high mutation rates create a 'cloud' of potentially beneficial mutations at the population level, which afford the viral quasispecies a greater probability to evolve and adapt to new environments and challenges during infection. Mathematical models predict that viral quasispecies are not simply a collection of diverse mutants but a group of interactive variants, which together contribute to the characteristics of the population. According to this view, viral populations, rather than individual variants, are the target of evolutionary selection. Here we test this hypothesis by examining the consequences of limiting genomic diversity on viral populations. We find that poliovirus carrying a high-fidelity polymerase replicates at wild-type levels but generates less genomic diversity and is unable to adapt to adverse growth conditions. In infected animals, the reduced viral diversity leads to loss of neurotropism and an attenuated pathogenic phenotype. Notably, using chemical mutagenesis to expand quasispecies diversity of the high-fidelity virus before infection restores neurotropism and pathogenesis. Analysis of viruses isolated from brain provides direct evidence for complementation between members in the quasispecies, indicating that selection indeed occurs at the population level rather than on individual variants. Our study provides direct evidence for a fundamental prediction of the quasispecies theory and establishes a link between mutation rate, population dynamics and pathogenesis.

Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population.

Eine RNA-Virus-Bev&ouml;lkerung besteht nicht aus einem einzigen Genotyp; Es ist vielmehr ein Ensemble von verwandte Sequenzen, Quasispezies genannt. Quasispezies entstehen aus rasche genomische Evolution angetrieben durch die hohe Mutationsrate der viralen RNA-Replikation. Obwohl eine hohe Mutationsrate f&uuml;r ein Virus gef&auml;hrlich ist, weil es nicht lebensf&auml;higes Einzelpersonen f&uuml;hrt, hat wurde vermutet, dass hohe Mutation Preise eine &#39;Wolke&#39; potentiell vorteilhafte Mutationen auf Bev&ouml;lkerungsebene, die leisten die viraler Quasispezies einer gr&ouml;&szlig;eren Wahrscheinlichkeit erstellen zu entwickeln und zur Anpassung an neue Umgebungen und Herausforderungen w&auml;hrend der Infektion. Mathematische Modelle sagen voraus, dass viraler Quasispezies sind nicht einfach eine Sammlung von verschiedenen Mutanten sondern eine Gruppe von interaktiven Varianten, die zusammen auf die Merkmale der Bev&ouml;lkerung beitragen. Nach dieser sind Ansicht, viralen Populationen, anstatt die einzelnen Varianten, das Ziel der evolution&auml;ren Selektion. Hier testen wir diese Hypothese durch untersuchen die Folgen der genomischen Vielfalt auf viralen Populationen zu begrenzen. Wir finden, Polioviren, die Durchf&uuml;hrung einer High Fidelity Polymerase repliziert Wildtyp Ebenen aber weniger genomische Vielfalt generiert und kann keine Anpassung an ung&uuml;nstige Wachstumsbedingungen. Bei infizierten Tieren f&uuml;hrt die reduzierte virale Vielfalt zum Verlust des Neurotropismus und eine abgeschw&auml;chte Krankheitserreger Ph&auml;notyp. Insbesondere mithilfe chemische Mutagenese um Quasispezies Vielfalt des High-Fidelity-Virus zu erweitern, bevor die Infektion Neurotropismus und Pathogenese wird wiederhergestellt. Analyse von Viren, die vom Gehirn isoliert kann direkte Beweise f&uuml;r Erg&auml;nzung zwischen den Mitgliedern in der Quasispezies darauf hinweist, dass die Auswahl in der Tat nicht auf einzelne Varianten, sondern auf Bev&ouml;lkerungsebene stattfindet. Unsere Studie liefert direkte Beweise f&uuml;r eine grundlegende Vorhersage der Theorie Quasispezies und stellt eine Verkn&uuml;pfung zwischen Mutationsrate, Populationsdynamik und Pathogenese.

Quasispezies Vielfalt bestimmt Pathogenese durch kooperative Interaktionen in einer viralen Population.

The genome diversity of RNA viruses allows for rapid adaptation to a wide variety of adverse conditions. Accordingly, viruses can escape inhibition by most antiviral compounds targeting either viral or host factors. Here we exploited the capacity of RNA viruses for rapid adaptation to explore the evolutionary constraints of chaperone-mediated protein folding. We hypothesized that inhibiting a host molecular chaperone required for folding of a viral protein would force the virus to evolve an alternate folding strategy. We identified the chaperone Hsp90 as an essential factor for folding and maturation of picornavirus capsid proteins. Pharmacological inhibition of Hsp90 impaired the replication of poliovirus, rhinovirus, and coxsackievirus in cell culture. Strikingly, anti-Hsp90 treatment did not yield drug-resistant viruses, suggesting that the complexity of capsid folding precludes the emergence of alternate folding pathways. These results reveal tight evolutionary constraints on chaperone-mediated protein folding, which may be exploited for viral inhibition in vivo. Indeed, Hsp90 inhibitors drastically reduced poliovirus replication in infected animals without the emergence of drug-resistant escape mutants. We propose that targeting folding of viral proteins may provide a general antiviral strategy that is refractory to development of drug resistance.

Evolutionary constraints on chaperone-mediated folding provide an antiviral approach refractory to development of drug resistance.

Die Genom-Vielfalt der RNA-Viren erm&ouml;glicht die rasche Anpassung an eine Vielzahl von widrigen Bedingungen. Dementsprechend k&ouml;nnen Viren Hemmung entgehen, indem die meisten antiviralen Substanzen gezielt entweder viralen oder Faktoren zu hosten. Hier nutzte wir die Kapazit&auml;t der RNA-Viren f&uuml;r die schnelle Anpassung an die evolution&auml;re Zw&auml;nge Chaperon-vermittelte Proteinfaltung zu erkunden. Wir die Hypothese, dass die Hemmung ein Host molekularen Chaperon erforderlich f&uuml;r ein virales Protein Falte das Virus zu eine Alternative Klapp-Strategie entwickeln zwingen w&uuml;rde. Wir identifizieren die Chaperon Hsp90 als wesentlichen Faktor f&uuml;r Falt- und Reifung der Picornaviridae Kapsid-Proteine. Pharmakologische Hemmung der Hsp90 beeintr&auml;chtigt die Replikation von Polioviren, Rhinovirus und Coxsackievirus in der Zellkultur. Auff&auml;llig ist, Anti-Hsp90 Behandlung nicht nachgeben Medikamenten-resistente Viren, was darauf hindeutet, dass die Komplexit&auml;t der Kapsid Faltung das Entstehen alternativer Faltreifen Pathways ausschlie&szlig;t. Diese Ergebnisse zeigen enge evolution&auml;re Einschr&auml;nkungen f&uuml;r Chaperon-vermittelte Proteinfaltung, die virale Hemmung in vivo ausgenutzt werden k&ouml;nnen. In der Tat reduziert Hsp90-Inhibitoren drastisch, Polioviren Replikation bei infizierten Tieren ohne die Entstehung von Medikamenten-resistenten Escape-Mutanten. Schlagen wir gezielt virale Proteine falten eine allgemeine antivirale Strategie liefern kann, die auf die Entwicklung von Resistenzen ist.

Evolution&auml;re Einschr&auml;nkungen f&uuml;r faltbare Chaperon-vermittelte bieten einen antiviralen Ansatz, die Entwicklung von Resistenzen feuerfest.

Long-lasting protection against viral infection is best achieved by vaccination with attenuated viruses. Obtaining stably attenuated vaccine strains has traditionally been an empirical process, which greatly restricts the number of effective vaccines for viral diseases. Here we describe a rational approach for engineering stably attenuated viruses that can serve as safe and effective vaccines. Our approach exploits the observation that restricting viral population diversity by increasing replication fidelity greatly reduces viral tissue tropism and pathogenicity. We show that poliovirus variants with reduced genetic diversity elicit a protective immune response in an animal model of infection. Indeed, these novel vaccine candidates are comparable in efficacy to the currently available Sabin type 1 vaccine strain, but have the added advantage of being more stable, as their increased replication fidelity prevents reversion to the pathogenic wild-type phenotype. We propose that restricting viral quasispecies diversity provides a general approach for the rational design of stable, attenuated vaccines for a wide variety of viruses.

Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity.

Dauerhaften Schutz gegen virale Infektion wird am besten durch Impfung mit attenuierten Viren erreicht. Einholung von stabil abgeschw&auml;chte Impfst&auml;mme ist ein empirischer Prozess, traditionell, der stark, die Anzahl der wirksame Impfstoffe f&uuml;r Viruserkrankungen einschr&auml;nkt. Hier beschreiben wir eine rationale Ann&auml;herung f&uuml;r technische stabil abgeschw&auml;chte Viren, die als sichere und wirksame Impfstoffe dienen kann. Unser Ansatz nutzt die Beobachtung, dass die Beschr&auml;nkung von viralen Bev&ouml;lkerung Vielfalt durch Replikation Treue stark erh&ouml;hen viral Gewebe Tropismus und Pathogenit&auml;t reduziert. Wir zeigen, dass Polioviren Varianten mit reduzierter genetische Vielfalt eine sch&uuml;tzende Immunreaktion in einem Tiermodell der Infektion hervorrufen. In der Tat, diese neuartigen Impfstoff Kandidaten sind derzeit verf&uuml;gbaren Sabin Typ 1 Vakzinstammes in der Wirksamkeit vergleichbar, aber haben den zus&auml;tzlichen Vorteil des Seins stabiler, da ihre Treue erh&ouml;hte Replikation R&uuml;ckfall in der pathogenen Wildtyp Ph&auml;notyp verhindert. Wir schlagen Beschr&auml;nkung viraler Quasispezies Vielfalt bietet ein allgemeines Konzept f&uuml;r das rationale Design von stabilen, abgeschw&auml;chte Impfstoffe f&uuml;r eine Vielzahl von Viren.

Ingenieur abgeschw&auml;cht Virus-Impfstoffe durch die Kontrolle der Replikation Treue.

Hepatocellular carcinoma is a deadly cancer with growing incidence for which immunotherapy is one of the most promising therapeutic approach. Peptide-based vaccines designed to induce strong, sustained CD8+ T cell responses are effective in animal models and cancer patients. We demonstrated the efficacy of curative peptide-based immunisation against a unique epitope of SV40 tumour antigen, through the induction of a strong CD8+ T cell-specific response, in our liver tumour model. However, as in human clinical trials, most tumour antigen epitopes did not induce a therapeutic effect, despite inducing strong CD8+ T cell responses. We therefore modified the tumour environment to enhance peptide-based vaccine efficacy by delivering mengovirus (MV)-derived RNA autoreplicating sequences (MV-RNA replicons) into the liver. The injection of replication-competent RNA replicons into the liver converted partial tumour regression into tumour eradication, whereas non-replicating RNA had no such effect. Replicating RNA replicon injection induced local recruitment of innate immunity effectors (NK and NKT) to the tumour and did not affect specific CD8+ T cell populations or other myelolymphoid subsets. The local delivery of such RNA replicons into tumour stroma is therefore a promising strategy complementary to the use of peripheral peptide-based vaccines for treating liver tumours.

Delivery of mengovirus-derived RNA replicons into tumoural liver enhances the anti-tumour efficacy of a peripheral peptide-based vaccine.

Hepatozellul&auml;res Karzinom ist ein t&ouml;dlichen Krebs mit zunehmender Inzidenz f&uuml;r die Immuntherapie eines der vielversprechendsten therapeutischen Ansatz ist. Peptid-basierte Impfstoffe entwickelt, um starke, anhaltende CD8 + T Zelle Antworten induzieren sind wirksam in Tiermodellen und Krebspatienten. Wir bewiesen die Wirksamkeit von heilsamen Peptid-basierte Immunisierung gegen eine einzigartige Epitop des SV40 Tumor Antigens, durch die Induktion einer starken CD8 + T-Zell-spezifische Antwort, in unser Leber-Tumor-Modell. Jedoch die meisten Tumor Antigen Epitopes wie menschliche klinische Studien, keine therapeutische Wirkung, trotz starke CD8 + T Zelle Antworten induzieren induzieren. Wir haben deshalb ver&auml;ndert die Tumor-Umgebung um die Peptid-basierten Impfstoff Wirksamkeit zu verbessern durch die Bereitstellung von Mengovirus (MV)-abgeleitet von RNA-Replikation-Sequenzen (MV-RNA Replicons) in der Leber. Die Injektion von Replikations-zust&auml;ndigen RNA Replicons in der Leber wird Tumor Tilgung, teilweise Tumor-Regression umgebaut, w&auml;hrend nicht replizierende RNA keine solche Wirkung hatte. Replizieren von RNS Replikon Injektion induziert lokale Rekrutierung der angeborenen Immunit&auml;t Effektoren (NK und NKT) auf den Tumor und hatte keine Auswirkungen auf spezifische CD8 + T Zelle Bev&ouml;lkerungen oder andere Myelolymphoid Teilmengen. Die lokale Anlieferung der solche RNA-Replicons in Tumor-Stroma ist daher eine vielversprechende Strategie erg&auml;nzt die Verwendung von peripheren Peptid-basierte Impfstoffe zur Behandlung von Lebertumoren.

Lieferung von Mengovirus abgeleiteten RNA Replicons in tumoural Leber verbessert die zur antitumoralen Wirksamkeit von peripheren Peptid-basierten Impfstoff.

Live attenuated vaccines remain the safest, most cost-effective intervention against viral infections. Because live vaccine strains are generated empirically and the basis for attenuation is usually ill defined, many important viruses lack an efficient live vaccine. Here, we present a general strategy for the rational design of safe and effective live vaccines that harnesses the microRNA-based gene-silencing machinery to control viral replication. Using poliovirus as a model, we demonstrate that insertion of small miRNA homology sequences into a viral genome can restrict its tissue tropism, thereby preventing pathogenicity and yielding an attenuated viral strain. Poliovirus strains engineered to become targets of neuronal-specific miRNAs lost their ability to replicate in the central nervous system, leading to significant attenuation of neurovirulence in infected animals. Importantly, these viruses retained the ability to replicate in nonneuronal tissues. As a result, these engineered miRNA-regulated viruses elicited strong protective immunity in mice without producing disease.

Harnessing endogenous miRNAs to control virus tissue tropism as a strategy for developing attenuated virus vaccines.

Lebende abgeschw&auml;chte Impfstoffe bleiben die sicherste und kosteng&uuml;nstigste Intervention gegen virale Infektionen. Weil Leben Impfst&auml;mme werden empirisch generiert und die Grundlage f&uuml;r die D&auml;mpfung ist in der Regel krank definiert, fehlen viele wichtige Viren eine effiziente Lebendimpfstoff. Hier pr&auml;sentieren wir eine allgemeine Strategie f&uuml;r die rationale Gestaltung von sicheren und wirksamen lebende Impfstoffe, die die MicroRNA-basierte gen-silencing Maschinen zum Steuern der viralen Replikation nutzbar macht. Mit Polioviren als Modell, zeigen wir, dass Einf&uuml;gung von kleinen MiRNA Homologie Sequenzen in das virale Genom seine Tropismus Gewebe einschr&auml;nken kann dadurch Pathogenit&auml;t zu verhindern und eine abgeschw&auml;chte virale Belastung nachgeben. Polioviren St&auml;mme entwickelt zur Zielscheibe der neuronalen-spezifische MiRNAs verloren ihre F&auml;higkeit zur Replikation in das zentrale Nervensystem, was zu erheblichen D&auml;mpfung des Neurovirulence bei infizierten Tieren werden. Wichtig ist, behielt diese Viren in nonneuronal Geweben zu replizieren. Infolgedessen entwickelt diese MiRNA-regulierten Viren noch starke sch&uuml;tzende Immunit&auml;t bei M&auml;usen ohne Krankheit zu erstellen.

Nutzung der endogenen MiRNAs Virus Gewebe Tropismus als Strategie f&uuml;r die Entwicklung steuern ged&auml;mpft Virus-Impfstoffe.

The mechanisms by which RNA arboviruses, including chikungunya virus (CHIKV), evolve and maintain the ability to infect vertebrate and invertebrate hosts are poorly understood. To understand how host specificity shapes arbovirus populations, we studied CHIKV populations passaged alternately between invertebrate and vertebrate cells (invertebrate â†” vertebrate) to simulate natural alternation and contrasted the results with those for populations that were artificially released from cycling by passage in single cell types. These CHIKV populations were characterized by measuring genetic diversity, changes in fitness, and adaptability to novel selective pressures. The greatest fitness increases were observed in alternately passaged CHIKV, without drastic changes in population diversity. The greatest increases in genetic diversity were observed after serial passage and correlated with greater adaptability. These results suggest an evolutionary trade-off between maintaining fitness for invertebrate â†” vertebrate cell cycling, where maximum adaptability is possible only via enhanced population diversity and extensive exploration of sequence space.

Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures.

Die Mechanismen, durch die RNA-Arboviruses, einschlie&szlig;lich Chikungunya-Virus (CHIKV), entwickeln und pflegen die F&auml;higkeit, vertebrate und Wirbellosen Hosts zu infizieren, sind oft missverstanden. Um zu verstehen wie die Wirtsspezifit&auml;t ARBO-Viren Populationen Formen, wir untersuchte CHIKV Bev&ouml;lkerung passaged abwechselnd zwischen Wirbellosen und Wirbeltieren Zellen (Wirbellosen &harr; Wirbeltiere), nat&uuml;rliche Wechsel zu simulieren und kontrastiert die Ergebnisse mit denen f&uuml;r die Bev&ouml;lkerung, die vom Radfahren k&uuml;nstlich ver&ouml;ffentlicht wurden, durch die Passage in einzelne Zelltypen. Diese Populationen CHIKV zeichneten sich durch Messung der genetischen Vielfalt, &Auml;nderungen im Fitness und Anpassungsf&auml;higkeit an neuartige selektive Druck. Die gr&ouml;&szlig;te Fitness in abwechselnd passaged CHIKV, ohne drastische Ver&auml;nderungen in der Bev&ouml;lkerung Vielfalt Anstiege. Der gr&ouml;&szlig;te Anstieg der genetischen Vielfalt wurden nach seriellen Durchgang beobachtet und mit Anpassungsf&auml;higkeit. Diese Resultate schlagen einen evolution&auml;ren Kompromiss zwischen Erhaltung Eignung f&uuml;r wirbellosen &harr; vertebrate Zelle Radfahren, wo maximale Anpassungsf&auml;higkeit nur &uuml;ber verbesserte Bev&ouml;lkerung Vielfalt und umfassende Erforschung der Folgenraum m&ouml;glich ist.

Host-Wechsel von Chikungunya-Virus erh&ouml;ht Eignung w&auml;hrend gleichzeitig der Bev&ouml;lkerung Vielfalt und Anpassungsf&auml;higkeit auf neuartige selektive Druck.

In a screen for RNA mutagen resistance, we isolated a high fidelity RNA dependent RNA polymerase (RdRp) variant of Coxsackie virus B3 (CVB3). Curiously, this variant A372V is also resistant to amiloride. We hypothesize that amiloride has a previously undescribed mutagenic activity. Indeed, amiloride compounds increase the mutation frequencies of CVB3 and poliovirus and high fidelity variants of both viruses are more resistant to this effect. We hypothesize that this mutagenic activity is mediated through alterations in intracellular ions such as MgÂ²+ and MnÂ²+, which in turn increase virus mutation frequency by affecting RdRp fidelity. Furthermore, we show that another amiloride-resistant RdRp variant, S299T, is completely resistant to this mutagenic activity and unaffected by changes in ion concentrations. We show that RdRp variants resist the mutagenic activity of amiloride via two different mechanisms: 1) increased fidelity that generates virus populations presenting lower basal mutation frequencies or 2) resisting changes in divalent cation concentrations that affect polymerase fidelity. Our results uncover a new antiviral approach based on mutagenesis.

Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds.

In einem Bildschirm f&uuml;r RNA Mutagen Widerstand isoliert wir eine High-Fidelity RNA-abh&auml;ngige RNA-Polymerase (RdRp)-Variante des Coxsackie-Virus B3 (CVB3). Merkw&uuml;rdigerweise ist diese Variante A372V auch resistent gegen Amilorids. Wir vermuten, dass Amilorids verf&uuml;gt &uuml;ber eine bisher unbeschriebene mutagene Aktivit&auml;t. In der Tat Amilorids Verbindungen erh&ouml;hen die Mutation-Frequenzen der CVB3 und Polioviren und High-Fidelity-Varianten beide Viren sind widerstandsf&auml;higer gegen diesen Effekt. Wir vermuten, die diese mutagene Aktivit&auml;t, durch &Auml;nderungen im intrazellul&auml;ren Ionen wie Mg&sup2; + und Mn&sup2; +, die wiederum Virus-Mutation-Frequenz erh&ouml;hen vermittelt wird, durch Einwirkung auf die RdRp Treue. Dar&uuml;ber hinaus zeigen wir, dass eine andere Amilorids-resistenten RdRp Variante, S299T, ist v&ouml;llig resistent gegen diese mutagene Aktivit&auml;t und unbeeinflusst von &Auml;nderungen in Ionen-Konzentrationen. Wir zeigen, dass die RdRp Varianten widerstehen, die mutagene Aktivit&auml;t des Amilorids &uuml;ber zwei verschiedene Mechanismen: 1) erh&ouml;ht der Treue, die Virus-Populationen pr&auml;sentieren Niederfrequenz basale Mutation oder 2) widerstehen &auml;ndert im bivalente kationen Konzentrationen erzeugt, die Polymerase Treue zu beeinflussen. Unsere Ergebnisse entdecken Sie einen neuen antiviralen Ansatz basierend auf Mutagenese.

Wiedergabetreue Varianten von RNA-abh&auml;ngige RNA-Polymerasen entdecken Sie eine indirekte, mutagene Aktivit&auml;t Amilorids Verbindungen.

The error rate of RNA-dependent RNA polymerases (RdRp) affects the mutation frequency in a population of viral RNAs. Using chikungunya virus (CHIKV), we describe a unique arbovirus fidelity variant with a single C483Y amino acid change in the nsP4 RdRp that increases replication fidelity and generates populations with reduced genetic diversity. In mosquitoes, high fidelity CHIKV presents lower infection and dissemination titers than wild type. In newborn mice, high fidelity CHIKV produces truncated viremias and lower organ titers. These results indicate that increased replication fidelity and reduced genetic diversity negatively impact arbovirus fitness in invertebrate and vertebrate hosts.

Arbovirus high fidelity variant loses fitness in mosquitoes and mice.

Die Fehlerquote der RNA-abh&auml;ngige RNA-Polymerasen (RdRp) betrifft die Mutation-Frequenz bei einer Gesamtbev&ouml;lkerung von viralen RNAs. Chikungunya-Virus (CHIKV) verwenden, beschreiben wir eine einzigartige ARBO-Viren Treue-Variante mit einer einzigen C483Y Aminos&auml;ure &Auml;nderung in der nsP4-RdRp, die Replikation Treue erh&ouml;ht und erzeugt Populationen mit reduzierten genetische Vielfalt. High-Fidelity CHIKV pr&auml;sentiert in M&uuml;cken niedrigere Infektion und Verbreitung Titer als Wildtyp. Von Neugeborenen abgeschnitten High-Fidelity, den CHIKV produziert Viremias und niedriger Titer der Orgel. Diese Ergebnisse zeigen, dass erh&ouml;hte Replikation Treue und geringere genetische Vielfalt ARBO-Viren Fitness von Wirbellosen und Wirbeltieren Hosts beeintr&auml;chtigen.

ARBO-Viren High-Fidelity Variante verliert Fitness von M&uuml;cken und M&auml;use.

The ability to extinguish a viral population of fixed reproductive capacity by causing small changes in the mutation rate is referred to as lethal mutagenesis and is a corollary of population genetics theory. Here we show that coxsackievirus B3 (CVB3) exhibits reduced mutational robustness relative to poliovirus, manifesting in enhanced sensitivity of CVB3 to lethal mutagens that is dependent on the size of the viral population. We suggest that mutational robustness may be a useful measure of the sensitivity of a virus to lethal mutagenesis.

Mutational robustness of an RNA virus influences sensitivity to lethal mutagenesis.

Die F&auml;higkeit, eine virale Population von festen Fortpflanzungsf&auml;higkeit auszul&ouml;schen, durch kleine &Auml;nderungen in die Mutationsrate verursacht wird als t&ouml;dliche Mutagenese bezeichnet und ist eine logische Folge der Populationsgenetik Theorie. Hier zeigen wir, dass Coxsackievirus B3 (CVB3) Ausstellungsst&uuml;cke reduziert teilhabende Robustheit gegen&uuml;ber Polioviren, manifestiert sich in verbesserte Empfindlichkeit der CVB3 auf t&ouml;dliche Mutagene, die die virale Bev&ouml;lkerungsgr&ouml;&szlig;e abh&auml;ngig ist. Wir schlagen vor, da&szlig; Mutationszucht Robustheit eine n&uuml;tzliche Ma&szlig;nahme der Empfindlichkeit eines Virus zu t&ouml;dlichen Mutagenese sein kann.

Article	Year
Expression of a membrane-anchored glycoprotein, the influenza virus hemagglutinin, by dicistronic replicons derived from the poliovirus genome. Journal of virology\| PubMed ID: 11967344	2002
Ribavirin and lethal mutagenesis of poliovirus: molecular mechanisms, resistance and biological implications. Virus research\| PubMed ID: 15649563	2005
Remote site control of an active site fidelity checkpoint in a viral RNA-dependent RNA polymerase. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 15878882	2005
Quasispecies diversity determines pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. Nature\| PubMed ID: 16327776	2006
Evolutionary constraints on chaperone-mediated folding provide an antiviral approach refractory to development of drug resistance. Genes & development\| PubMed ID: 17234885	2007
Engineering attenuated virus vaccines by controlling replication fidelity. Nature medicine\| PubMed ID: 18246077	2008
Delivery of mengovirus-derived RNA replicons into tumoural liver enhances the anti-tumour efficacy of a peripheral peptide-based vaccine. Cancer immunology, immunotherapy : CII\| PubMed ID: 18256833	2008
Harnessing endogenous miRNAs to control virus tissue tropism as a strategy for developing attenuated virus vaccines. Cell host & microbe\| PubMed ID: 18779050	2008
Host alternation of chikungunya virus increases fitness while restricting population diversity and adaptability to novel selective pressures. Journal of virology\| PubMed ID: 21047966	2011
Fidelity variants of RNA dependent RNA polymerases uncover an indirect, mutagenic activity of amiloride compounds. PLoS pathogens\| PubMed ID: 21060812	2010
Arbovirus high fidelity variant loses fitness in mosquitoes and mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 21896755	2011
Mutational robustness of an RNA virus influences sensitivity to lethal mutagenesis. Journal of virology\| PubMed ID: 22190724	2012

Marco Vignuzzi

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