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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Invasive candidiasis is an increasing problem in neonatal intensive care units worldwide and is an important cause of morbidity, mortality and prolongation of hospital stay. Despite administration of amphotericin B, invasive candidiasis in neonates is sometimes complicated by persistent fungemia and refractory invasive candidiasis. The problem has been augmented by the increasing prevalence of non-albicans species that often are resistant to fluconazole and to amphotericin B.

Caspofungin therapy of neonates with invasive candidiasis.

Caspofungin-Therapie von Neugeborenen mit invasiver Candidiasis.

Poor immune status, the use of a vascular access different from an AV fistula, and intravenous drug use (IDU) may favor increased rates of vascular access infections among HIV infected patients on hemodialysis. Staphylococcus spp. and Streptococcus spp. are the main cause of these infections, but Gram-negative rods and fungi have been found as well. Using an AV fistula when possible, and eliciting a history of IVDU on every visit may prevent this type of infection. When infections are present, coverage for both Gram-positive and negative organisms is recommended. Additional studies specifically addressing the issue of vascular access infection in HIV infected patients are required.

Vascular access-related infections in HIV patients undergoing hemodialysis: case description and literature review.

Schlechter Immunstatus, Verwendung von einem ZVK anders als eine AV-Fistel und intraven&ouml;sen Drogenkonsum (IDU) k&ouml;nnen erh&ouml;ht Preise Gef&auml;&szlig;zugang Infektionen bei HIV-infizierten Patienten unter H&auml;modialyse beg&uuml;nstigen. Staphylococcus spp. und Streptococcus spp. sind die Hauptursache f&uuml;r diese Infektionen, aber Gramnegative St&auml;bchen und Pilze wurden auch gefunden. Mit einer AV-Fistel, wenn m&ouml;glich und l&ouml;st dadurch eine Geschichte der IVDU bei jedem Besuch k&ouml;nnen diese Art der Infektion verhindern. Wenn Infektionen vorhanden sind, wird die Abdeckung f&uuml;r sowohl Gram-positive als auch negative Organismen empfohlen. Zus&auml;tzliche Untersuchungen, die speziell mit der Frage der Gef&auml;&szlig;zugang Infektionen bei HIV-infizierten Patienten sind erforderlich.

Vaskul&auml;ren Zugang im Zusammenhang mit Infektionen bei HIV Patienten H&auml;modialyse: case Beschreibung und Literatur-Review.

Thymus-derived lymphocytes protect mammalian hosts against virus- or cancer-related cellular alterations through immune surveillance, eliminating diseased cells. In this process, T cell receptors (TCRs) mediate both recognition and T cell activation via their dimeric alphabeta, CD3 epsilon gamma, CD3 epsilon delta, and CD3 zeta zeta subunits using an unknown structural mechanism. Here, site-specific binding topology of anti-CD3 monoclonal antibodies (mAbs) and dynamic TCR quaternary change provide key clues. Agonist mAbs footprint to the membrane distal CD3 epsilon lobe that they approach diagonally, adjacent to the lever-like C beta FG loop that facilitates antigen (pMHC)-triggered activation. In contrast, a non-agonist mAb binds to the cleft between CD3 epsilon and CD3 gamma in a perpendicular mode and is stimulatory only subsequent to an external tangential but not a normal force ( approximately 50 piconewtons) applied via optical tweezers. Specific pMHC but not irrelevant pMHC activates a T cell upon application of a similar force. These findings suggest that the TCR is an anisotropic mechanosensor, converting mechanical energy into a biochemical signal upon specific pMHC ligation during immune surveillance. Activating anti-CD3 mAbs mimic this force via their intrinsic binding mode. A common TCR quaternary change rather than conformational alterations can better facilitate structural signal initiation, given the vast array of TCRs and their specific pMHC ligands.

The alphabeta T cell receptor is an anisotropic mechanosensor.

Thymus abgeleitete Lymphozyten sch&uuml;tzen S&auml;ugetier-Rechner gegen Viren oder krebsbedingte zellul&auml;re Ver&auml;nderungen durch immun-&Uuml;berwachung, Beseitigung von kranke Zellen. Dabei vermitteln die T-Zell-Rezeptoren (TCRs) Anerkennung und T-Zell-Aktivierung &uuml;ber ihre dimeren Alphabeta CD3 Epsilon Gamma, CD3 Epsilon Delta und CD3-Zeta-Zeta-Untereinheiten mit einem unbekannten strukturellen Mechanismus. Hier, standortspezifische Bindung Topologie Anti-CD3 monoklonaler Antik&ouml;rper (mAbs) und dynamische TCR quart&auml;re &Auml;nderung geben wichtige Hinweise. Agonist mAbs Pr&auml;senz, um die Membran distale CD3 Epsilon Lappen, dass sie diagonal, angrenzend an die Hebel-wie C Beta FG Schleife Ansatz, das Antigen (pMHC) erleichtert-Aktivierung ausgel&ouml;st. Im Gegensatz dazu einen nicht-Agonist-mAb bindet an den Spalt zwischen CD3-Epsilon und CD3 Gamma in einem senkrecht Modus und ist nur im Anschluss an eine externe tangential, aber keine normale Kraft (ca. 50 Piconewtons) &uuml;ber optische Pinzette angewendet belebend. Bestimmte pMHC aber nicht unerheblich pMHC aktiviert eine T-Zelle auf Antrag eine &auml;hnliche Kraft. Diese Ergebnisse deuten auf TCR eine anisotrope Mechanosensor, Umwandlung von mechanischen Energie in eine biochemische Signal auf bestimmte pMHC Verbindung w&auml;hrend immun Observation. Aktivierende Anti-CD3-mAbs imitieren diese Kraft &uuml;ber ihre systeminterne Bindungsmodus. Eine gemeinsame TCR-Quatern&auml;re &auml;ndern, anstatt Konformations&auml;nderungen Ver&auml;nderungen besser strukturelle Signal Einleitung, angesichts die Vielzahl von TCRs und ihrer spezifischen pMHC-Liganden erleichtern k&ouml;nnen.

Der Alphabeta-T-Zell-Rezeptor ist eine anisotrope Mechanosensor.

Amyloid fibrils are important in diverse cellular functions, feature in many human diseases and have potential applications in nanotechnology. Here we describe methods that combine optical trapping and fluorescent imaging to characterize the forces that govern the integrity of amyloid fibrils formed by a yeast prion protein. A crucial advance was to use the self-templating properties of amyloidogenic proteins to tether prion fibrils, enabling their manipulation in the optical trap. At normal pulling forces the fibrils were impervious to disruption. At much higher forces (up to 250 pN), discontinuities occurred in force-extension traces before fibril rupture. Experiments with selective amyloid-disrupting agents and mutations demonstrated that such discontinuities were caused by the unfolding of individual subdomains. Thus, our results reveal unusually strong noncovalent intermolecular contacts that maintain fibril integrity even when individual monomers partially unfold and extend fibril length.

Optical trapping with high forces reveals unexpected behaviors of prion fibrils.

Amyloid-Fibrillen sind in diverse Zellfunktionen, Funktion in vielen menschlichen Krankheiten wichtig und haben potentielle Anwendungen in der Nanotechnologie. Hier beschreiben wir Methoden, die optische Trapping und Fluoreszenz imaging um die Kr&auml;fte zu charakterisieren, die die Integrit&auml;t des Amyloid-Fibrillen gebildet, indem ein Hefe Prion-Protein Regeln zu kombinieren. Ein entscheidender Fortschritt war die selbst-Template-Eigenschaft von Amyloidogenic Proteinen verwendet zum Prion-Fibrillen, aktivieren ihre Manipulation in der optischen Falle zu begrenzen. Zu ziehende Normalkr&auml;fte waren die Fibrillen unempfindlich gegen St&ouml;rungen. Bei viel h&ouml;here Kr&auml;fte (bis zu 250 pN) Diskontinuit&auml;ten in Kraft-Verl&auml;ngerung Spuren vor Fibrille Bruch aufgetreten. Experimente mit selektiven Amyloid-Unterbrechung des Agenten und Mutationen nachgewiesen, dass solche Diskontinuit&auml;ten verursacht wurden, durch die Entfaltung des einzelnen Subdom&auml;nen. So zeigen unsere Ergebnisse ungew&ouml;hnlich starken noncovalent intermolekulare Kontakte, die Fibrille Integrit&auml;t zu bewahren, auch wenn einzelne Monomere teilweise entfalten und Fibrille L&auml;nge zu verl&auml;ngern.

Optische &Uuml;berf&uuml;llung mit hohen Kr&auml;ften offenbart unerwartete Verhaltensweisen Prion-Fibrillen.

The application of live cell imaging allows direct visualization of the dynamic interactions between cells of the immune system. Some preliminary observations challenge long-held beliefs about immune responses to microorganisms; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. This paper outlines a method that advances live cell imaging by integrating a spinning disk confocal microscope with an optical trap, also known as an optical tweezer, in order to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms and place them in proximity to host cells, as determined by the operator. Polymeric beads and live, pathogenic organisms (Candida albicans and Aspergillus fumigatus) were optically trapped using non-destructive forces and moved adjacent to living cells, which subsequently phagocytosed the trapped particle. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability of this method to immunological studies, anti-CD3 polymeric beads were also trapped and manipulated to form synapses with T cells in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions.

Die Anwendung von live Cell Imaging erm&ouml;glicht direkte Visualisierung der dynamischen Wechselwirkungen zwischen Zellen des Immunsystems. Einige Vorbemerkungen fordern lang gehegte &Uuml;berzeugungen &uuml;ber Immunantworten zu Mikroorganismen; Allerdings hat die mangelnde r&auml;umliche und zeitliche Kontrolle zwischen dem phagozytische Zelle und Mikrobe gezielte Beobachtungen in die ersten Interaktionen der Wirtsantwort gegen Krankheitserreger schwierig gerendert. Dieses Papier legt eine Methode, dass Fortschritte Zelle Darstellung Leben durch die Integration eines drehenden Scheibe Konfokales Mikroskops mit einer optischen Falle, auch eine optische Pinzette, um exquisite r&auml;umliche und zeitliche Steuerung der pathogenen Organismen und legen Sie sie in der N&auml;he Wirtszellen, wie vom Betreiber bestimmt. Polymer Perlen und live, pathogenen Organismen (Candida Albicans und Aspergillus Fumigatus) wurden optisch gefangen, mittels nicht-destruktive Kr&auml;fte und angrenzend an lebenden Zellen, die anschlie&szlig;end das aufgefangene Partikel phagozytierte verschoben. Hohe Aufl&ouml;sung, &uuml;bertrug Licht und Fluoreszenz basierenden Filmen etabliert die F&auml;higkeit, Fr&uuml;he Veranstaltungen der Phagozytose in lebenden Zellen beobachten. Um die breite Anwendbarkeit dieser Methode auf immunologische Studien zu demonstrieren, wurden Anti-CD3 Polymer Perlen auch gefangen in Form Synapsen mit T-Zellen in vivo manipuliert und Zeitraffer Bildgebung Synapse-Formation wurde auch erhalten. Durch die Bereitstellung einer Methode, um feine Kontrolle Leben Krankheitserreger in Bezug auf Immunzellen, zellul&auml;re Interaktionen durch Fluoreszenzmikroskopie mit minimaler St&ouml;rung auf Zellen erfasst werden k&ouml;nnen und leistungsf&auml;hige Einblick in fr&uuml;hen Antworten der angeborenen und erworbenen Immunit&auml;t ergeben k&ouml;nnen.

Kontrolle und Manipulation von Krankheitserregern mit einer optischen Falle f&uuml;r live Cell Imaging interzellul&auml;re Wechselwirkungen.

A variety of polymerization methods for the assembly of elongated nanoribbons from rectangular DNA origami structures are investigated. The most efficient method utilizes single-stranded DNA oligonucleotides to bridge an intermolecular scaffold seam between origami monomers. This approach allows the fabrication of origami ribbons with lengths of several micrometers, which can be used for long-range ordered arrangement of proteins. It is quantitatively shown that the length distribution of origami ribbons obtained with this technique follows the theoretical prediction for a simple linear polymerization reaction. The design of flat single layer origami structures with constant crossover spacing inevitably results in local underwinding of the DNA helix, which leads to a global twist of the origami structures that also translates to the nanoribbons.

DNA origami-based nanoribbons: assembly, length distribution, and twist.

Eine Vielzahl von Polymerisierung Methoden f&uuml;r die Montage des l&auml;nglichen Nanoribbons von rechteckigen DNA Origami Strukturen untersucht werden. Die effizienteste Methode nutzt einzelstr&auml;ngige DNA Oligonukleotide um eine intermolekulare Ger&uuml;st Naht zwischen Origami Monomere zu &uuml;berbr&uuml;cken. Dieser Ansatz erm&ouml;glicht die Herstellung von Origami-B&auml;nder mit L&auml;ngen von mehreren Mikrometern, die f&uuml;r Langstrecken bestellte Anordnung der Proteine verwendet werden kann. Quantitativ wird gezeigt, dass die Verteilung der L&auml;nge der Origami-B&auml;nder, die mit dieser Technik die theoretische Vorhersage f&uuml;r eine einfache lineare Polymerisierung Reaktion folgt. Die Gestaltung der Wohnung einlagige Origami Strukturen mit konstanter Frequenzweiche Abstand f&uuml;hrt unweigerlich zu lokalen Underwinding der DNA-Helix, f&uuml;hrt zu einem globalen Twist der Origami-Strukturen, die auch in die Nanoribbons &uuml;bersetzt.

DNA Origami-basierte Nanoribbons: Assembly, L&auml;nge Verteilung und Torsion.

Amyloid fibers play important roles in many human diseases and natural biological processes and have immense potential as novel nanomaterials. We explore the physical properties of polymorphic amyloid fibers formed by yeast prion protein Sup35. Amyloid fibers that conferred distinct prion phenotypes ([PSI(+)]), strong (S) versus weak (W) nonsense suppression, displayed different physical properties. Both S[PSI(+)] and W[PSI(+)] fibers contained structural inhomogeneities, specifically local regions of static curvature in S[PSI(+)] fibers and kinks and self-cross-linking in W[PSI(+)] fibers. Force-extension experiments with optical tweezers revealed persistence lengths of 1.5 Î¼m and 3.3 Î¼m and axial stiffness of 5600 pN and 9100 pN for S[PSI(+)] and W[PSI(+)] fibers, respectively. Thermal fluctuation analysis confirmed the twofold difference in persistence length between S[PSI(+)] and W[PSI(+)] fibers and revealed a torsional stiffness of kinks and cross-links of ~100-200 pNÂ·nm/rad.

Physical properties of polymorphic yeast prion amyloid fibers.

Amyloid Fasern spielen eine wichtige Rolle in vielen menschlichen Krankheiten und nat&uuml;rlichen biologischen Prozessen und verf&uuml;gen &uuml;ber immenses Potenzial als neuartige Nanomaterialien. Wir erforschen die physikalischen Eigenschaften des polymorphen Amyloid Fasern, die durch Hefe Prionproteins Sup35 gebildet. Amyloid Fasern, die unterschiedliche Prion Ph&auml;notypen &uuml;bertragenen ([PSI(+)]), starke (S) gegen&uuml;ber schwachen (W)-Unsinn-Unterdr&uuml;ckung, angezeigt unterschiedliche physikalische Eigenschaften. Beide S[PSI(+)] und W[PSI(+)] Fasern enthaltenen strukturelle Inhomogenit&auml;ten, speziell lokale Regionen der statischen Kr&uuml;mmung in S[PSI(+)] Fasern und Knicke und self-cross-linking in W[PSI(+)] Fasern. Kraft-Verl&auml;ngerung Experimente mit optischen Pinzette ergab Persistenz L&auml;ngen von 1,5 &mu;m und 3.3 &mu;m und Axiale Steifigkeit von 5600 pN und 9100 pN f&uuml;r S[PSI(+)] und W[PSI(+)] Fasern, beziehungsweise. Thermische Fluktuation Analyse best&auml;tigte den zweifache Unterschied Persistenz L&auml;nge zwischen S[PSI(+)] und W[PSI(+)] Fasern und offenbart eine Torsionssteifigkeit der Knicke und Querverbindungen von ~ 100-200 pN&middot;nm/rad.

Article	Year
Caspofungin therapy of neonates with invasive candidiasis. The Pediatric infectious disease journal\| PubMed ID: 15626944	2004
Vascular access-related infections in HIV patients undergoing hemodialysis: case description and literature review. The Brazilian journal of infectious diseases : an official publication of the Brazilian Society of Infectious Diseases\| PubMed ID: 19287844	2008
The alphabeta T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 19755427	2009
Optical trapping with high forces reveals unexpected behaviors of prion fibrils. Nature structural & molecular biology\| PubMed ID: 21113168	2010
Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PloS one\| PubMed ID: 21217821	2010
DNA origami-based nanoribbons: assembly, length distribution, and twist. Nanotechnology\| PubMed ID: 21597145	2011
Physical properties of polymorphic yeast prion amyloid fibers. Biophysical journal\| PubMed ID: 21767497	2011

Carlos E. Castro

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