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Quantifying Agonist Activity at G Protein-coupled Receptors

When an agonist activates a population of G protein-coupled receptors (GPCRs), it elicits a signaling pathway that culminates in the response of the cell ...

We examined whether fusion proteins of G protein-coupled receptors with the alpha subunit of G(16) (Galpha(16)) could activate downstream signals. We expressed fusion proteins of G(i)-coupled receptors, i.e. CX(3)C chemokine receptor 1 (CX(3)CR1) and M(2) receptor, in Chinese hamster ovary cells. An agonist for CX(3)CR1 induced greater increases in intracellular Ca(2+) and prostaglandin E(2) generation in cells expressing CX(3)CR1-Galpha(16) fusion protein than in cells expressing CX(3)CR1 alone or both CX(3)CR1 and Galpha(16) separately. Similarly, agonist-induced prostaglandin E(2) generation was greater in cells expressing M(2)-Galpha(16) fusion protein than ones expressing M(2) alone or both M(2) and Galpha(16) separately. In cells expressing fusion proteins with Galpha(16) of G(q)-coupled receptors, i.e. urotensin II receptor and M(1) receptor, the relevant agonists induced similar increases in intracellular Ca(2+) and prostaglandin E(2) generation as in ones expressing the receptor alone. In cells expressing urotensin II receptor-Galpha(16) fusion protein, prostaglandin E(2) generation exhibited a lower EC(50) value than the intracellular Ca(2+) increase. These results indicate that agonist-stimulated receptor-Galpha(16) fusion proteins are coupled to downstream signaling pathways, and suggest that receptor-Galpha(16) fusion proteins may be useful for screening for ligands of orphan G protein-coupled receptors and G(i)-coupled receptors.

Stimulation of increases in intracellular calcium and prostaglandin E2 generation in Chinese hamster ovary cells expressing receptor-Galpha16 fusion proteins.

Die Stimulation der Erh&#xF6;hung des intrazellul&#xE4;ren Calcium und Prostaglandin E2 Generation in der chinesischen Hamster-Eierstock-Zellen, die Rezeptor-Fusionsproteine &#x200B;&#x200B;Galpha16.

G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute one of the largest families of genes in the human genome, and are the largest targets for drug development. Although a large number of GPCR genes have recently been identified, ligands have not yet been identified for many of them. Various assay systems have been employed to identify ligands for orphan GPCRs, but there is still no simple and general method to screen for ligands of such GPCRs, particularly of G(i)-coupled receptors. We have examined whether fusion proteins of GPCRs with G protein alpha subunit (Galpha) could be utilized for ligand screening and showed that the fusion proteins provide an effective method for the purpose. This article focuses on the followings: (1) characterization of GPCR genes and GPCRs, (2) identification of ligands for orphan GPCRs, (3) characterization of GPCR-Galpha fusion proteins, and (4) identification of ligands for orphan GPCRs using GPCR-Galpha fusion proteins.

Ligand screening system using fusion proteins of G protein-coupled receptors with G protein alpha subunits.

G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden eine der gr&ouml;&szlig;ten Familien der Gene im menschlichen Genom und sind die gr&ouml;&szlig;ten Ziele f&uuml;r die Medikamentenentwicklung. Obwohl eine gro&szlig;e Anzahl von GPCR Gene vor kurzem identifiziert wurden, wurden Liganden nicht noch f&uuml;r viele von ihnen identifiziert. Verschiedene Assay-Systeme haben zum Identifizieren von Liganden f&uuml;r Waise GPCRs besch&auml;ftigt gewesen, aber es gibt noch keine einfache und allgemeine Methode zum Bildschirm f&uuml;r die Liganden von solchen GPCRs, insbesondere der G (i)-gekoppelte Rezeptoren. Wir haben untersucht, ob Schmelzverfahrensproteine von GPCR mit G-Protein-alpha-Untereinheit (Galpha) f&uuml;r Ligand Screening eingesetzt und zeigten, dass die Fusionsproteine eine effektive Methode f&uuml;r den Zweck bieten werden k&ouml;nnte. Dieser Artikel konzentriert sich auf die folgenden Elemente sein: (1) Charakterisierung von GPCR-Gene und GPCRs, (2) Identifikation des Liganden f&uuml;r Waise GPCRs, (3) Charakterisierung von GPCR-Galpha Schmelzverfahrensproteine und (4) Identifikation von Liganden f&uuml;r orphan-GPCRs mithilfe von GPCR-Galpha Schmelzverfahrensproteine.

Ligand screening-System mit Schmelzverfahrensproteine von G-Protein-gekoppelter Rezeptoren mit G-Protein-alpha-Untereinheiten.

We explored the interaction of a nitrogen mustard derivative of acetylcholine with the human M(2) muscarinic receptor expressed in Chinese hamster ovary cells using the muscarinic radioligand, [3H]N-methylscopolamine (NMS). Acetylcholine mustard caused a concentration-dependent, first-order loss of [3H]NMS binding at 37 degrees C, with the half-maximal rate constant occurring at 24 microM and a maximal rate constant of 0.16 min(-1). We examined the effects of various ligands on the rate of alkylation of M(2) receptors by acetylcholine mustard. N-methylscopolamine and 4-(trimethylamino)-2-butynyl-(3-chlorophenyl)carbamate (McN-A-343) competitively slowed the rate of alkylation, whereas the inhibition by gallamine reached a plateau at high concentrations, indicating allosteric inhibition. In contrast, 17-beta-hydroxy-17-alpha-ethynyl-5-alpha-androstano[3,2-beta]-pyrimido[1,2-alpha]benzimidazole (WIN 51708) had no effect. We also measured the inhibition of [3H]NMS binding by acetylcholine mustard at 0 degrees C, conditions under which there is little or no detectable covalent binding. In these experiments, the dissociation constant of the aziridinium ion of acetylcholine mustard was estimated to be 12.3 microM. In contrast, the parent mustard and alcoholic hydrolysis product of acetylcholine mustard were without effect. Our results show that measurement of the effects of ligands on the rate of inactivation of the orthosteric site by a small site-directed electrophile is a powerful method for discriminating competitive inhibition from allosterism.

Use of acetylcholine mustard to study allosteric interactions at the M(2) muscarinic receptor.

Wir untersuchten die Interaktion eines Derivats Stickstoff Senf von Acetylcholin mit den menschlichen Muskarinischer m-Rezeptor ausgedr&uuml;ckt in chinesischer Hamster Eierstock Zellen mithilfe der Muskarinischer Radioligand, [3H] N-Methylscopolamine (NMS). Acetylcholin Senf verursacht einen Konzentration abh&auml;ngige, erster Ordnung Verlust der [3H]-NMS-Bindung bei 37 Grad C, mit die H&auml;lfte-maximale Geschwindigkeitskonstante am 24 MicroM und eine maximale Geschwindigkeitskonstante von 0,16 min(-1). Wir untersuchten die Wirkung von verschiedenen Liganden auf die Rate der Alkylierung von m-Rezeptoren durch Acetylcholin-Senf. N-Methylscopolamine und 4-(trimethylamino)-2-butynyl-(3-chlorophenyl)carbamate (McN-A-343) verlangsamt konkurrierend die Rate der Alkylierung, w&auml;hrend die Hemmung von Gallamine ein Plateau in hohen Konzentrationen erreicht, die allosterische Hemmung. 17-Beta-hydroxy-17-alpha-ethynyl-5-alpha-androstano[3,2-beta]-pyrimido[1,2-alpha]benzimidazole (gewinnen 51708) hatte dagegen keine Auswirkung. Wir Ma&szlig; auch die Hemmung der [3H]-NMS-Bindung von Acetylcholin Senf bei 0 Grad C, unter welchen Bedingungen es wenig oder keine nachweisbaren kovalente Bindung. In diesen Experimenten wurde die Dissoziationskonstante von der Aziridinium-Ion Acetylcholin Senf auf 12,3 MicroM werden gesch&auml;tzt. Im Gegensatz dazu waren die &uuml;bergeordneten Senf und alkoholische Hydrolyse-Produkt von Acetylcholin Senf ohne Wirkung. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Messung der Auswirkungen von Liganden auf die Rate der Inaktivierung der Orthosteric-Website durch eine kleine Site-verwiesene Elektrophil ist eine leistungsf&auml;hige Methode f&uuml;r anspruchsvolle kompetitive Hemmung von Allosterism.

Verwendung von Acetylcholin Senf allosterische Interaktionen bei der m-Muskarinischer-Rezeptor zu studieren.

We investigated whether the aziridinium ion formed from a nitrogen mustard derivative (4-[(2-bromoethyl)methyl-amino]-2-butynyl N-(3-chlorophenyl)carbamate; BR384) structurally related to McN-A-343 (4-(trimethyl-amino)-2-butynyl N-(3-chlorophenyl)carbamate) interacts allosterically or orthosterically with the M(2) muscarinic receptor. Chinese hamster ovary cells expressing the human M(2) muscarinic receptor were incubated with the aziridinium ion of BR384 in combination with McN-A-343 or other known orthosteric and allosteric ligands for various incubation times. After removing unreacted ligands, we measured the binding of [(3)H]N-methylscopolamine to residual unalkylated receptors. Affinity constants, rate constants for alkylation, and cooperativity constants were estimated for the interacting ligands using a mathematical model. Receptor alkylation by BR384 was consistent with a two-step process. After rapidly equilibrating with the receptor (step one), the aziridinium ion-receptor complex became covalently linked with a first order rate constant of about 0.95min(-1) (step two). McN-A-343, acetylcholine and N-methylscopolamine competitively protected the M(2) receptor from irreversible alkylation by BR384. In contrast, the allosteric modulators, gallamine and WIN 51,708 (17-beta-hydroxy-17-alpha-ethynyl-5-alpha-androstano[3,2-beta]pyrimido[1,2-alpha]benzimidazole), allosterically inhibited or had no effect on, respectively, receptor alkylation by BR384. There was good agreement between affinity constants estimated from the kinetics of receptor alkylation and by displacement of [(3)H]N-methylscopolamine binding. Our results suggest that BR384 covalently binds to the orthosteric site of the M(2) receptor and that McN-A-343 binds reversibly at the same locus. Our method of analyzing allosteric interactions does not suffer from the limitations of more conventional approaches and can be adapted to detect allosteric interactions at receptors other than the muscarinic subtypes.

Investigating the interaction of McN-A-343 with the M2 muscarinic receptor using its nitrogen mustard derivative.

Wir untersuchten, ob das Aziridinium-Ion von einem Stickstoff Senf-Derivat gebildet (4-[(2-bromoethyl)-Methyl-amino]-2 - Butynyl N - Carbamat (3-chlorphenyl); BR384) strukturell verwandt zu McN-A-343 (4--(trimethyl-amino)-2-Butynyl-N-(3-chlorophenyl)carbamate) interagiert phosphorylierter oder Orthosterically mit den Muskarinischer m-Rezeptor. Chinesischer Hamster Eierstock Zellen zum Ausdruck des menschlichen Muskarinischer m-Rezeptors wurden mit der Aziridinium Ion von BR384 in Kombination mit McN-A-343 oder andere bekannte Orthosteric und allosterische Liganden f&uuml;r verschiedene Inkubationszeiten inkubiert. Nach dem Entfernen von Spurenverunreinigungen Ligands, gemessen wir die Bindung von [(3) H] N-Methylscopolamine, residual unalkylated Rezeptoren. Affinit&auml;t Konstanten, Geschwindigkeitskonstanten f&uuml;r Alkylierung und Kooperativit&auml;t Konstanten wurden f&uuml;r die interagierenden Liganden mit einem mathematisches Modell gesch&auml;tzt. Rezeptor-Alkylierung von BR384 entsprach ein zweistufiger Prozess. Nach schnell betr&uuml;ge mit den Rezeptor (Schritt eins), der Aziridinium wurde Ion-Rezeptor-Komplex mit einem ersten Auftrag Geschwindigkeitskonstante von &uuml;ber 0.95min(-1) (Schritt 2) kovalent verkn&uuml;pft. McN-A-343, Acetylcholin und N-Methylscopolamine konkurrierend den m-Rezeptor vor irreversiblen Alkylierung von BR384 gesch&uuml;tzt. In Kontrast, allosterische Modulatoren, Gallamine und gewinnen 51.708 (17-beta-hydroxy-17-alpha-ethynyl-5-alpha-androstano[3,2-beta]pyrimido[1,2-alpha]benzimidazole), phosphorylierter gehemmt oder hatte keine Wirkung, bzw. Rezeptor Alkylierung von BR384. Es gab gutes Abkommen zwischen Affinit&auml;t Konstanten aus der Kinetik der Rezeptor-Alkylierung und durch Verschiebung der N-Methylscopolamine-Bindung [(3) H] gesch&auml;tzt. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass BR384 kovalent an die Orthosteric-Seite des m-Rezeptor bindet und McN-A-343 reversibel an der gleichen Locus bindet. Unsere Methode der Analyse allosterischer Interaktionen leidet nicht die Grenzen der konventionellen Ans&auml;tze und kann allosterische Interaktionen an Rezeptoren als Muskarinischer Subtypen erkennen angepasst werden.

Untersucht das Zusammenspiel von McN-A-343 mit der Muskarinischer M2-Rezeptor mit Hilfe seiner Stickstoff Senf-Derivat.

Investigating how a test drug alters the reaction of a site-directed electrophile with a receptor is a powerful method for determining whether the drug acts competitively or allosterically, provided that the binding site of the electrophile is known. In this study, therefore, we mutated nucleophilic residues near and within the orthosteric pockets of M(1) and M(2) muscarinic receptors to identify where acetylcholine mustard and 4-[(2-bromoethyl)methyl-amino]-2-butynyl-N-(3-chlorophenyl)carbamate (BR384) bind covalently. BR384 is the nitrogen mustard analog of [4-[[N-(3-chlorophenyl)carbamoyl]oxy]-2-butynyl]trimethylammonium chloride (McN-A-343). Mutation of the highly conserved aspartic acid in M(1) (Asp105) and M(2) (Asp103) receptors to asparagine largely prevented receptor alkylation by acetylcholine mustard, although modest alkylation still occurred at M(2) D103N at high concentrations of the mustard. Receptor alkylation by BR384 was also greatly inhibited in the M(1) D105N mutant, but some alkylation still occurred at high concentrations of the compound. In contrast, BR384 rapidly alkylated the M(2) D103N mutant. Its affinity was reduced to one tenth, however. The alkylation of M(2) D103N by BR384 was competitively inhibited by N-methylscopolamine and allosterically inhibited by gallamine. Mutation of a variety of other nucleophilic residues, some in combination with D103N, had little effect on M(2) receptor alkylation by BR384. Our results suggest that BR384 alkylates at least one residue other than the conserved aspartic acid at the ligand-binding site of M(1) and M(2) receptors. This additional residue seems to be located within or near the orthosteric-binding pocket and is not part of the allosteric site for gallamine.

Mutagenesis of nucleophilic residues near the orthosteric binding pocket of M1 and M2 muscarinic receptors: effect on the binding of nitrogen mustard analogs of acetylcholine and McN-A-343.

Untersuchen, wie eine Test Medikament &auml;ndert die Reaktion von einer Site-verwiesene Elektrophil mit ein Rezeptor ist eine leistungsf&auml;hige Methode zur Feststellung, ob die Droge kompetitiv oder phosphorylierter, wirkt, sofern die Bindungsstelle f&uuml;r das Elektrophil bekannt ist. In dieser Studie mutierten wir daher Nukleophile R&uuml;ckst&auml;nde in der N&auml;he und in die Orthosteric-Taschen der Zusammenlegung und m muskarinische Rezeptoren zu identifizieren, wo Acetylcholin-Senf und 4-[(2-bromoethyl)methyl-amino]-2-butynyl-N-(3-chlorophenyl)carbamate (BR384) kovalent gebunden. BR384 ist die Stickstoff Senf-Analog [4-[[N-(3-chlorophenyl)carbamoyl]oxy]-2-butynyl]trimethylammonium Chlorid (McN-A-343). Mutation des stark konservierten Asparagins&auml;ure Zusammenlegung (Asp105) und m (Asp103)-Rezeptoren an Asparagin verhindert weitgehend Rezeptor-Alkylierung von Acetylcholin Senf, obwohl bescheiden Alkylierung an m D103N in hohen Konzentrationen der Senf noch aufgetreten ist. Rezeptor-Alkylierung von BR384 war auch sehr in der Zusammenlegung D105N Mutant gehemmt, aber einige Alkylierung trat noch in hohen Konzentrationen der Substanz. Im Gegensatz dazu alkylierte BR384 schnell den m-D103N-Mutanten. Seine Affinit&auml;t wurde auf ein Zehntel, jedoch reduziert. Die Alkylierung von m-D103N von BR384 war kompetitiv gehemmt durch N-Methylscopolamine und phosphorylierter durch Gallamine gehemmt. Mutation einer Vielzahl von andere Nukleophile R&uuml;ckst&auml;nde, einige in Kombination mit D103N, hatte wenig Auswirkung auf m-Rezeptor-Alkylierung von BR384. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die BR384 mindestens ein R&uuml;ckstand als die konservierten Asparagins&auml;ure am Standort Ligand-Bindung der Zusammenlegung und m-Rezeptoren alkylates. Diese zus&auml;tzliche R&uuml;ckst&auml;nde scheint sich innerhalb oder nahe der Orthosteric-Bindung-Tasche zu sein und ist nicht Teil der allosterische Website f&uuml;r Gallamine.

Mutagenese Nukleophile R&uuml;ckst&auml;nde in der N&auml;he der Orthosteric-Bindung-Tasche von M1 und M2 muskarinische Rezeptoren: Auswirkungen auf die Bindung von Stickstoff Senf Analoga von Acetylcholin und McN-A-343.

We describe a modification of receptor theory for the estimation of observed affinities (K(obs)) and relative efficacies of orthosteric ligands in functional assays that exhibit constitutive activity. Our theory includes parameters for the fractions of the occupied receptor population in the active (intrinsic efficacy, Îµ) and inactive (Îµ(i)) states and analogous parameters for the fractions of the free receptor population in the active (Îµ(sys)) and inactive (Îµ(i-sys)) states. The total stimulus represents the summation of the active states of the free and occupied receptor populations. A modified operational model is developed that expresses the response as a logistic function of the total stimulus. This function includes the standard parameters related to affinity and efficacy (K(obs) and Ï„) as well as a parameter proportional to the activity of the free receptor complex, Ï„(sys). Two related parameters are proportional to the fraction of the free (Ï„(i-sys)) and occupied (Ï„(i)) receptor populations in the inactive state. We show that the estimates of the affinity constants of orthosteric ligands for the active (K(b)) and inactive (K(a)) states of the receptor are equivalent to Ï„K(obs)/Ï„(sys) and Ï„(i)K(obs)/Ï„(i-sys), respectively. We verify our method with computer simulation techniques and apply it to the analysis of M(2) and M(3) muscarinic receptors. Our method is applicable in the analysis of ligand bias in drug discovery programs.

Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states.

Wir beschreiben eine Modifikation der Rezeptor-Theorie f&uuml;r die Sch&auml;tzung der beobachteten Affinit&auml;ten (K(obs)) und relative Leistungsnachteile Orthosteric Liganden bei funktionelle Assays, die konstitutive Aktivit&auml;t aufweisen. Unsere Theorie enth&auml;lt Parameter f&uuml;r die Teile der Bev&ouml;lkerung besetzten Rezeptor in den aktiven (intrinsische Wirksamkeit, &epsilon;) und inaktive (&epsilon;(i)) Staaten und Analog Parameter f&uuml;r die Br&uuml;che der freien Rezeptor-Bev&ouml;lkerung in den aktiven (&epsilon;(sys)) und inaktiv (&epsilon;(i-sys)) Staaten. Der gesamte Reiz stellt die Summe der aktiven Status der freien und besetzten Rezeptor Bev&ouml;lkerungen. Ein ver&auml;nderter funktionsf&auml;higes Modell entwickelt, das die Antwort als logistische Funktion des gesamten Stimulus ausdr&uuml;ckt. Diese Funktion umfasst die standard-Parameter mit Bezug zu Affinit&auml;t und Wirksamkeit (K(obs) und &tau;) sowie einen Parameter proportional auf die T&auml;tigkeit der freien Rezeptor-Komplex, &tau;(sys). Zwei verwandte Parameter sind proportional zu den Bruch der freien (&tau;(i-sys)) und besetzte (&tau;(i))-Rezeptor-Populationen in den inaktiven Zustand. Wir zeigen, dass die Sch&auml;tzungen der Affinit&auml;t Konstanten der Orthosteric Liganden f&uuml;r das aktive (K(b)) und inaktiv (K(a)) Staaten des Rezeptors entsprechen dem &tau;K(obs)/&tau;(sys) und &tau;(i)K(obs)/&tau;(i-sys), beziehungsweise. Wir &uuml;berpr&uuml;fen unsere Methode mit Computer-Simulation-Techniken und wenden sie die Analyse von m und M(3) muskarinische Rezeptoren. Unsere Methode ist anwendbar bei der Analyse der Ligand Bias in der Droge-Entdeckung-Programme.

Analyse der Agonismus und inverse Agonismus bei funktionelle Assays mit konstitutiven Aktivit&auml;t: Absch&auml;tzung der Orthosteric Ligand Affinit&auml;t Konstanten f&uuml;r aktive und inaktive Rezeptor Staaten.

Wir beschreiben eine Modifikation der Rezeptor-Theorie, die Absch&auml;tzung der relativen Affinit&auml;t-Konstanten f&uuml;r den inaktiven Zustand von ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor erm&ouml;glicht. Unser Ansatz umfasst die traditionelle Parameter der beobachteten Affinit&auml;t (K(obs)) und Wirksamkeit (Bruchteil der Ligand-Rezeptor-Komplex im aktiven Zustand, &epsilon;) und f&uuml;hrt das Konzept der Bruchteil der Ligand-Rezeptor-Komplex in den inaktiven Zustand (intrinsische Inaktivit&auml;t, &epsilon;(i)). Die Beziehung zwischen Rezeptor-Aktivierung und die Liganden-Konzentration ist bekannt als der Reiz und das operative Modell dr&uuml;ckt die Antwort als eine logistische Funktion des Konjunkturpakets. Die letztere Funktion enth&auml;lt K(obs) und die Parameter &tau;, die proportional zur &epsilon;. Wir f&uuml;hren die Parameter &tau;(i), die ist proportional zur &epsilon;(i). Wir haben bereits gezeigt, dass das Produkt, K (Obs) &tau;, der ein Agonist, ausgedr&uuml;ckt im Verh&auml;ltnis zu dem eines anderen (intrinsische relative Aktivit&auml;t, RA(i)), ist ein relatives Ma&szlig; f&uuml;r die Affinit&auml;t Konstante f&uuml;r den aktiven Zustand des Rezeptors. In diesem Bericht zeigen wir, dass das Produkt, K(obs)&tau;(i), der ein Agonist, ausgedr&uuml;ckt im Verh&auml;ltnis zu dem eines anderen (intrinsische relative Inaktivit&auml;t, RI(i)), ist ein relatives Ma&szlig; f&uuml;r die Affinit&auml;t Konstante f&uuml;r den inaktiven Zustand des Rezeptors. Wir verwenden Computer Simulationstechniken &uuml;berpr&uuml;fen unsere Analyse und unsere Methode zur Analyse der ver&ouml;ffentlichten Daten Agonist Aktivit&auml;ten am M(3) Muskarinischer Rezeptor anwenden. Unsere Methode h&auml;tte weit verbreitete Anwendung bei der Analyse der Agonist Voreingenommenheit in Droge-Entdeckung-Programmen und bei der Sch&auml;tzung eine grundlegendere relatives Ma&szlig; der Wirksamkeit (RA(i)/RI(i)).

Analyse von funktionalen Antworten beim G-Protein-gekoppelte Rezeptoren: Absch&auml;tzung der relativen Affinit&auml;t Konstanten f&uuml;r den inaktiven Rezeptor-Status.

We describe a modification of receptor theory that enables the estimation of relative affinity constants for the inactive state of a G protein-coupled receptor. Our approach includes the traditional parameters of observed affinity (K(obs)) and efficacy (fraction of ligand-receptor complex in the active state, Îµ) and introduces the concept of the fraction of the ligand-receptor complex in the inactive state (intrinsic inactivity, Îµ(i)). The relationship between receptor activation and the ligand concentration is known as the stimulus, and the operational model expresses the response as a logistic function of the stimulus. The latter function includes K(obs) and the parameter Ï„, which is proportional to Îµ. We introduce the parameter Ï„(i), which is proportional to Îµ(i). We have previously shown that the product, K(obs)Ï„, of one agonist, expressed relative to that of another (intrinsic relative activity, RA(i)), is a relative measure of the affinity constant for the active state of the receptor. In this report, we show that the product, K(obs)Ï„(i), of one agonist, expressed relative to that of another (intrinsic relative inactivity, RI(i)), is a relative measure of the affinity constant for the inactive state of the receptor. We use computer simulation techniques to verify our analysis and apply our method to the analysis of published data on agonist activity at the M(3) muscarinic receptor. Our method should have widespread application in the analysis of agonist bias in drug discovery programs and in the estimation of a more fundamental relative measure of efficacy (RA(i)/RI(i)).

Article	Year
Stimulation of increases in intracellular calcium and prostaglandin E2 generation in Chinese hamster ovary cells expressing receptor-Galpha16 fusion proteins. Journal of biochemistry\| PubMed ID: 15173199	2004
Ligand screening system using fusion proteins of G protein-coupled receptors with G protein alpha subunits. Neurochemistry international\| PubMed ID: 17659814	2007
Use of acetylcholine mustard to study allosteric interactions at the M(2) muscarinic receptor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics\| PubMed ID: 18682569	2008
Investigating the interaction of McN-A-343 with the M2 muscarinic receptor using its nitrogen mustard derivative. Biochemical pharmacology\| PubMed ID: 19913516	2010
Mutagenesis of nucleophilic residues near the orthosteric binding pocket of M1 and M2 muscarinic receptors: effect on the binding of nitrogen mustard analogs of acetylcholine and McN-A-343. Molecular pharmacology\| PubMed ID: 20643905	2010
Analysis of agonism and inverse agonism in functional assays with constitutive activity: estimation of orthosteric ligand affinity constants for active and inactive receptor states. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics\| PubMed ID: 21576379	2011
Analysis of functional responses at G protein-coupled receptors: estimation of relative affinity constants for the inactive receptor state. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics\| PubMed ID: 21576380	2011

Hinako Suga

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