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Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Calcium transients play an important role in the early and later phases of differentiation and maturation of single neurons and neuronal networks. Small-conductance calcium-activated potassium channels of the SK type modulate membrane excitability and are important determinants of the firing properties of central neurons. Increases in the intracellular calcium concentration activate SK channels, leading to a hyperpolarization of the membrane potential, which in turn reduces the calcium inflow into the cell. This feedback mechanism is ideally suited to regulate the spatiotemporal occurrence of calcium transients. However, the role of SK channels in neuronal development has not been addressed so far. We have concentrated on the ontogenesis and function of SK channels in the developing rat cerebellum, focusing particularly on Purkinje neurons. Electrophysiological recordings combined with specific pharmacological tools have revealed for the first time the presence of an afterhyperpolarizing current (I(AHP)) in immature Purkinje cells in rat cerebellar slices. The channel subunits underlying this current were identified as SK2 and localized by in situ hybridization and subunit-specific antibodies. Their expression level was shown to be high at birth and subsequently to decline during the first 3 weeks of postnatal life, both at the mRNA and protein levels. This developmental regulation was tightly correlated with the expression of I(AHP) and the prominent role of SK2 channels in shaping the spontaneous firing pattern in young, but not in adult, Purkinje neurons. These results provide the first evidence of the developmental regulation and function of SK channels in central neurons.

Developmental regulation of small-conductance Ca2+-activated K+ channel expression and function in rat Purkinje neurons.

Developmental Regulierung von kleinen Leitwert Ca2 +-aktivierten K +-Kanal Expression und Funktion bei Ratten Purkinje Neuronen.

How do we smell? Our knowledge of how odor information from the environment is perceived has greatly advanced since the discovery of approximately 1,000 genes for odorant receptors in the mammalian genome. From the combination of molecular-genetic, electrophysiological, and optical imaging studies a better understanding of how we smell is emerging.

Olfaction: from odorant molecules to the olfactory cortex.

Geruchssinn: von Duftmolek&#xFC;le zum olfaktorischen Kortex.

The x-ray structure of the KcsA channel at different [K(+)] and [Rb(+)] provided insight into how K(+) channels might achieve high selectivity and high K(+) transit rates and showed marked differences between the occupancies of the two ions within the ion channel pore. In this study, the binding of kappa-conotoxin PVIIA (kappa-PVIIA) to Shaker K(+) channel in the presence of K(+) and Rb(+) was investigated. It is demonstrated that the complex results obtained were largely rationalized by differences in selectivity filter occupancy of this 6TM channels as predicted from the structural work on KcsA. kappa-PVIIA inhibition of the Shaker K(+) channel differs in the closed and open state. When K(+) is the only permeant ion, increasing extracellular [K(+)] decreases kappa-PVIIA affinity for closed channels by decreasing the "on" binding rate, but has no effect on the block of open channels, which is influenced only by the intracellular [K(+)]. In contrast, extracellular [Rb(+)] affects both closed- and open-channel binding. As extracellular [Rb(+)] increases, (a) binding to the closed channel is slightly destabilized and acquires faster kinetics, and (b) open channel block is also destabilized and the lowest block seems to occur when the pore is likely filled only by Rb(+). These results suggest that the nature of the permeant ions determines both the occupancy and the location of the pore site from which they interact with kappa-PVIIA binding. Thus, our results suggest that the permeant ion(s) within a channel pore can determine its functional and pharmacological properties.

Binding of kappa-conotoxin PVIIA to Shaker K+ channels reveals different K+ and Rb+ occupancies within the ion channel pore.

Die Bindung von kappa-Conotoxin PVIIA Shaker K +-Kan&#xE4;le zeigt verschiedene K + und Rb + Belegungen im Ionenkanal Pore.

The vomeronasal system is involved in the detection of pheromones in many mammals. Vomeronasal sensory neurons encode the behaviorally relevant information into action potentials that are directly transmitted to the accessory olfactory bulb. We developed a model of the electrical activity of mouse basal vomeronasal sensory neurons, which mimics both the voltage-gated current properties and the firing behavior of these neurons in their near-native state, using a minimal number of parameters. Data were obtained by recordings with the whole-cell voltage-clamp or current-clamp techniques from mouse basal vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. The resting potential ranged from -50 to -70 mV, and current injections of less than 2-10 pA induced tonic firing in most neurons. The experimentally determined firing frequency as a function of injected current was well described by a Michaelis-Menten equation and was exactly reproduced by the model, which could be used in combination with future models that will include details of the mouse vomeronasal transduction cascade.

Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations.

Das Vomeronasal System ist die Erkennung von Pheromonen bei vielen S&auml;ugetieren beteiligt. Vomeronasal sensorische Neuronen codieren behaviorally relevante Informationen in Aktionspotentiale, die direkt an das Zubeh&ouml;r Riechkolben &uuml;bertragen werden. Wir entwickelten ein Modell f&uuml;r die elektrische Aktivit&auml;t der Maus basale Vomeronasal sensorische Neuronen, die die Spannung-Gating aktuellen Eigenschaften und das Verhalten ausl&ouml;sen dieser Neuronen in ihrem fast Native imitiert, mit einer minimalen Anzahl von Parametern. Daten wurden durch Aufnahmen mit dem ganz-Zell-Spannung-Klemme oder Klemm-aktuelle Techniken von Maus basale Vomeronasal sensorische Neuronen in akuten Segment Zubereitungen erzielt. Die ruhenden Potential reichte von-50 bis-70 mV sowie aktuelle Injektionen von weniger als 2-10 pA induzierte St&auml;rkungsmittel in den meisten Neuronen feuern. Die experimentell bestimmte feuern-Frequenz als Funktion der aktuellen injiziert wurde auch von einer Michaelis-Menten-Gleichung beschrieben und wurde genau reproduziert, indem das Modell, das in Kombination mit zuk&uuml;nftigen Modellen verwendet werden k&ouml;nnte, die Details der Maus Vomeronasal Transduktion Kaskade enthalten wird.

Elektrophysiologische Eigenschaften und Modellierung von murinen Vomeronasal sensorische Neuronen in akuten Segment Zubereitungen.

Cyclic nucleotide-gated (CNG) channels, directly activated by the binding of cyclic nucleotides, were first discovered in retinal rods, cones and olfactory sensory neurons. In the visual and olfactory systems, CNG channels mediate sensory transduction by conducting cationic currents carried primarily by sodium and calcium ions. In olfactory transduction, calcium in combination with calmodulin exerts a negative feedback on CNG channels that is the main molecular mechanism responsible for fast adaptation in olfactory sensory neurons. Six mammalian CNG channel genes are known and some human visual disorders are caused by mutations in retinal rod or cone CNG genes.

Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction.

Zyklische Nukleotid-Gating (CNG) Kan&auml;le, direkt durch die Bindung der zyklischen Nukleotide, aktiviert wurden erstmals in Netzhaut St&auml;bchen, Zapfen und olfaktorischen sensorischen Neuronen entdeckt. In die visuelle und olfaktorische Systeme vermitteln CNG-Kan&auml;le sensorische Transduktion durch die Durchf&uuml;hrung von kationischer Str&ouml;mungen getragen vor allem von Natrium- und Calcium-Ionen. In olfaktorische Signaltransduktion &uuml;bt Kalzium in Kombination mit Calmodulin ein negatives Feedback auf CNG-Kan&auml;le, die die wichtigsten molekularen Mechanismen, die f&uuml;r schnelle Anpassung im olfaktorischen sensorischen Neuronen verantwortlich ist. Sechs S&auml;ugetier-CNG-Kanal-Gene sind bekannt, und einige menschlichen Sehst&ouml;rungen sind verursacht durch Mutationen in Netzhaut Stab- oder Kegel-CNG-Genen.

Zyklische Nukleotid-Gating Ionenkan&auml;le in sensorischen Transduktion.

Vertebrate olfactory sensory neurons rapidly adapt to repetitive odorant stimuli. Previous studies have shown that the principal molecular mechanisms for odorant adaptation take place after the odorant-induced production of cAMP, and that one important mechanism is the negative feedback modulation by Ca2+-calmodulin (Ca2+-CaM) of the cyclic nucleotide-gated (CNG) channel. However, the physiological role of the Ca2+-dependent activity of phosphodiesterase (PDE) in adaptation has not been investigated yet. We used the whole-cell voltage-clamp technique to record currents in mouse olfactory sensory neurons elicited by photorelease of 8-Br-cAMP, an analogue of cAMP commonly used as a hydrolysis-resistant compound and known to be a potent agonist of the olfactory CNG channel. We measured currents in response to repetitive photoreleases of cAMP or of 8-Br-cAMP and we observed similar adaptation in response to the second stimulus. Control experiments were conducted in the presence of the PDE inhibitor IBMX, confirming that an increase in PDE activity was not involved in the response decrease. Since the total current activated by 8-Br-cAMP, as well as that physiologically induced by odorants, is composed not only of current carried by Na+ and Ca2+ through CNG channels, but also by a Ca2+-activated Cl- current, we performed control experiments in which the reversal potential of Cl- was set, by ion substitution, at the same value of the holding potential, -50 mV. Adaptation was measured also in these conditions of diminished Ca2+-activated Cl- current. Furthermore, by producing repetitive increases of ciliary's Ca2+ with flash photolysis of caged Ca2+, we showed that Ca2+-activated Cl- channels do not adapt and that there is no Cl- depletion in the cilia. All together, these results indicate that the activity of ciliary PDE is not required for fast adaptation to repetitive stimuli in mouse olfactory sensory neurons.

Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase.

Vertebrate olfaktorische sensorische Neuronen passen sich schnell an sich wiederholende Odoriermittel Reize. Fr&uuml;here Studien haben gezeigt, dass die wichtigsten molekularen Mechanismen Odoriermittel Anpassung nach der Odorant-induzierte Produktion des Lagers stattfinden, und dass ein wichtige Mechanismus die Negative R&uuml;ckkopplung-Modulation von Ca2 ist +-Calmodulin (Ca2 +-CaM) die zyklische Nukleotid-Gating (CNG)-Kanals. Jedoch die physiologische Rolle des Ca2 +-abh&auml;ngige Aktivit&auml;t der Phosphodiesterase (PDE) in Adaption wurde noch nicht untersucht. Wir nutzen die ganze Zelle Spannung Klemm-Technik Rekord Str&ouml;mungen in Maus olfaktorischen sensorischen Neuronen hervorgerufen durch Photorelease des 8-Br-cAMP, ein Analogon des Lagers h&auml;ufig als ein hydrolysebest&auml;ndiges Verbindung verwendet und bezeichnet ein potenter Agonist des olfaktorischen CNG-Kanals zu sein. Wir gemessen Str&ouml;mungen als Reaktion auf sich wiederholende Photoreleases des Lagers oder der 8-Br-cAMP und wir beobachteten &auml;hnliche Anpassung in Reaktion auf den zweiten Reiz. Regelungs-Experimente wurden durchgef&uuml;hrt, in Anwesenheit der PDE-Hemmer IBMX, best&auml;tigt, dass eine Zunahme der PDE-Aktivit&auml;t in der Antwort-R&uuml;ckgang nicht beteiligt war. Da der Summenstrom aktiviert durch 8-Br-cAMP, ebenso wie die physiologisch induziert durch Geruchsstoffe, nicht nur der Strom von Na + und Ca2 + durch die CNG-Kan&auml;le, sondern auch durch eine Ca2 besteht +-aktiviert Cl-Strom, f&uuml;hrten wir Regelungs-Experimente, in denen das Umkehr-Potenzial der Cl -, durch Ionen-Substitution auf den gleichen Wert f&uuml;r das Betriebs-Potenzial festgelegt,-50 mV. Anpassung wurde auch gemessen, unter diesen Bedingungen der verminderte Ca2 +-Cl-Strom aktiviert. Dar&uuml;ber hinaus durch die Herstellung von sich wiederholenden Erh&ouml;hungen der Zilien &#39;s Ca2 + mit Flash Photolyse von K&auml;fig Ca2 +, wir zeigten, dass Ca2 +-aktivierten Cl-Kan&auml;le passen nicht an und dass es keine Cl-Ersch&ouml;pfung in die Flimmerh&auml;rchen. Alle zusammen, zeigen diese Ergebnisse, dass die Aktivit&auml;t der Zilien PDE f&uuml;r schnelle Anpassung an sich wiederholende Reize in Maus olfaktorischen sensorischen Neuronen nicht ben&ouml;tigt.

Schnelle Anpassung in Maus olfaktorischen sensorischen Neuronen erfordert nicht die Aktivit&auml;t der Phosphodiesterase.

Ca-activated Cl channels are an important component of olfactory transduction. Odor binding to olfactory receptors in the cilia of olfactory sensory neurons (OSNs) leads to an increase of intraciliary Ca concentration by Ca entry through cyclic nucleotide-gated (CNG) channels. Ca activates a Cl channel that leads to an efflux of Cl from the cilia, contributing to the amplification of the OSN depolarization. The molecular identity of this Cl channel remains elusive. Recent evidence has indicated that bestrophins are able to form Ca-activated Cl channels in heterologous systems. Here we have analyzed the expression of bestrophins in the mouse olfactory epithelium and demonstrated that only mouse bestrophin-2 (mBest2) was expressed. Single-cell RT-PCR showed that mBest2 was expressed in OSNs but not in supporting cells. Immunohistochemistry revealed that mBest2 was expressed on the cilia of OSNs, the site of olfactory transduction, and colocalized with the main CNGA2 channel subunit. Electrophysiological properties of Ca-activated Cl currents from native channels in dendritic knob/cilia of mouse OSNs were compared with those induced by the expression of mBest2 in HEK-293 cells. We found the same anion permeability sequence, small estimated single-channel conductances, a Ca sensitivity difference of one order of magnitude, and the same side-specific blockage of the two Cl channel blockers commonly used to inhibit the odorant-induced Ca-activated Cl current in OSNs, niflumic acid, and 4-acetamido-4'-isothiocyanato-stilben-2,2'-disulfonate (SITS). Therefore, our data suggest that mBest2 is a good candidate for being a molecular component of the olfactory Ca-activated Cl channel.

Bestrophin-2 is a candidate calcium-activated chloride channel involved in olfactory transduction.

Ca aktivierte Cl-Kan&auml;le sind ein wichtiger Bestandteil des olfaktorischen Signaltransduktion. Geruch Bindung an olfaktorischen Rezeptoren in die Flimmerh&auml;rchen der olfaktorischen sensorischen Neuronen (OSNs) f&uuml;hrt zu einer Erh&ouml;hung der intraciliary Ca-Konzentration von Ca-Eintrag durch zyklische Nukleotid-Gating (CNG) Kan&auml;le. Ca aktiviert einen Cl-Kanal, der f&uuml;hrt zu einer Efflux von Cl aus der Zilien, einen Beitrag zu der Verst&auml;rkung der die OSN Depolarisierung. Die molekulare Identit&auml;t dieses Cl-Kanals bleibt. Neuere Belege hat darauf hingewiesen, dass Bestrophins Ca aktiviert Cl-Kan&auml;le in heterologen Systemen bilden k&ouml;nnen. Hier haben wir den Ausdruck des Bestrophins in der Maus olfaktorischen Epithel analysiert und nachgewiesen, dass einzige Maus Bestrophin-2 (mBest2) wurde zum Ausdruck gebracht. Einzeller-RT-PCR zeigte, dass dieser mBest2 in OSNs aber nicht bei der Unterst&uuml;tzung der Zellen zum Ausdruck kam. Immunhistochemie ergab, dass mBest2 war auf die Flimmerh&auml;rchen OSNs, Ortsbild des olfaktorischen Signaltransduktion, ausgedr&uuml;ckt und colocalized mit den wichtigsten CNGA2-Kanal-Untereinheit. Elektrophysiologische Eigenschaften des aktivierten Ca Cl Bemessungsstr&ouml;me von systemeigenen Kan&auml;le in dendritischen Regler/Zilien der Maus OSNs wurden mit denen von den Ausdruck des mBest2 in den HEK-293-Zellen induziert verglichen. Wir fanden Anion Durchl&auml;ssigkeit Reihenfolge, kleine gesch&auml;tzte Einkanal-Conductances, Ca Empfindlichkeit Unterschied eine Gr&ouml;&szlig;enordnung und derselben Seite-spezifische verhinderte die zwei Cl-Kanal-Blocker, h&auml;ufig verwendet, um die Odoriermittel induziert Ca aktivierte Cl aktuelle in OSNs, Niflumic S&auml;ure und 4-acetamido-4&#39;-isothiocyanato-stilben-2,2&#39;-disulfonate hemmen (sitzt). Daher deuten unsere Daten, dass mBest2 ein guter Kandidat f&uuml;r Molekulare Komponente des olfaktorischen Ca aktivierte Cl-Kanals.

Bestrophin-2 ist ein Kandidat-aktivierte Kalzium-Chlorid-Kanal olfaktorischen Signaltransduktion beteiligt.

A Ca(2+)-activated Cl(-) current constitutes a large part of the transduction current in olfactory sensory neurons. The binding of odorants to olfactory receptors in the cilia produces an increase in cAMP concentration; Ca(2+) enters into the cilia through CNG channels and activates a Cl(-) current. In intact mouse olfactory sensory neurons little is known about the kinetics of the Ca(2+)-activated Cl(-) current. Here, we directly activated CNG channels by flash photolysis of caged cAMP or 8-Br-cAMP and measured the current response with the whole cell voltage-clamp technique in mouse neurons. We measured multiphasic currents in the rising phase of the response at -50 mV. The current rising phase became monophasic in the absence of extracellular Ca(2+), at +50 mV, or when most of the intracellular Cl(-) was replaced by gluconate to shift the equilibrium potential for Cl(-) to -50 mV. These results show that the second phase of the current in mouse intact neurons is attributed to a Cl(-) current activated by Ca(2+), similarly to previous results on isolated frog cilia. The percentage of the total saturating current carried by Cl(-) was estimated in two ways: 1) by measuring the maximum secondary current and 2) by blocking the Cl(-) channel with niflumic acid. We estimated that in the presence of 1 mM extracellular Ca(2+) and in symmetrical Cl(-) concentrations the Cl(-) component can constitute up to 90% of the total current response. These data show how to unravel the CNG and Ca(2+)-activated Cl(-) component of the current rising phase.

Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons.

Eine aktuelle Ca(2+) aktivierte Cl(-) bildet einen gro&szlig;en Teil der Signaltransduktion im olfaktorischen sensorischen Neuronen. Das Binden von Ger&uuml;chen zu olfaktorischen Rezeptoren in die Flimmerh&auml;rchen erzeugt einen Anstieg der cAMP-Konzentration; Ca(2+) tritt in die Flimmerh&auml;rchen durch CNG-Kan&auml;le und eine aktuelle Cl(-) aktiviert. In intakten Maus olfaktorischen sensorischen Neuronen ist wenig &uuml;ber die Kinetik der Ca(2+) aktivierte Cl(-) aktuelle bekannt. Hier wir direkt aktiviert CNG-Kan&auml;le mit Flash-Photolyse von K&auml;fig cAMP oder 8-Br-cAMP und die aktuelle Antwort mit der ganzen Zelle Spannung Klemm-Technik in Maus-Neuronen gemessen. Wir Ma&szlig;en Multiphasic Str&ouml;mungen in der steigenden Phase der Reaktion bei-50 mV. Die aktuelle steigende Phase wurde monophasisch in Ermangelung extrazellul&auml;re Ca(2+), bei + 50 mV, oder wann die meisten der intrazellul&auml;ren Cl(-) wurde durch Gluconat Verlagerung das potenziellen Gleichgewicht f&uuml;r Cl(-) auf-50 mV. Diese Ergebnisse zeigen, dass die zweite Phase des aktuellen in Maus intakten Neuronen eine Cl(-) aktuelle aktiviert durch Ca(2+), &auml;hnlich zu fr&uuml;heren Ergebnissen auf isolierte Frosch Zilien zugerechnet wird. Der Prozentsatz der Summe S&auml;ttigung Strom von Cl(-) getragen wurde gesch&auml;tzt auf zwei Arten: 1) durch Messung der maximalen Sekund&auml;rstrom und 2) durch Blockierung des Cl(-) Kanals mit Niflumic S&auml;ure. Wir gesch&auml;tzt, dass in Gegenwart von 1 mM extrazellul&auml;re Ca(2+) und symmetrische Cl(-) Konzentrationen der Cl(-) Komponente bis zu 90 % der gesamten aktuellen Antwort darstellen kann. Diese Daten zeigen, wie die CNG und Cl(-) Ca(2+) aktivierte Komponente der aktuellen steigende Phase zu entwirren.

Zeitliche Entwicklung der zyklische Nukleotid-Gating und Ca2 +-Cl-Str&ouml;mungen in isolierten Maus olfaktorischen sensorischen Neuronen aktiviert.

Bestrophins are a recently discovered family of Cl(-) channels, for which no structural information is available. Some family members are activated by increased intracellular Ca2+ concentration. Bestrophins feature a well conserved Asp-rich tract in their COOH terminus (Asp-rich domain), which is homologous to Ca2+-binding motifs in human thrombospondins and in human big-conductance Ca2+- and voltage-gated K+ channels (BK(Ca)). Consequently, the Asp-rich domain is also a candidate for Ca2+ binding in bestrophins. Based on these considerations, we constructed homology models of human bestrophin-1 (Best1) Asp-rich domain using human thrombospondin-1 X-ray structure as a template. Molecular dynamics simulations were used to identify Asp and Glu residues binding Ca2+ and to predict the effects of their mutations to alanine. We then proceeded to test selected mutations in the Asp-rich domain of the highly homologous mouse bestrophin-2. The mutants expressed in HEK-293 cells were investigated by electrophysiological experiments using the whole-cell voltage-clamp technique. Based on our molecular modeling results, we predicted that Asp-rich domain has two defined binding sites and that D301A and D304A mutations may impact the binding of the metal ions. The experiments confirmed that these mutations do actually affect the function of the protein causing a large decrease in the Ca2+-activated Cl(-) current, fully consistent with our predictions. In addition, other studied mutations (E306A, D312A) did not decrease Ca2+-activated Cl(-) current in agreement with modeling results.

Regulation of bestrophins by Ca2+: a theoretical and experimental study.

Bestrophins sind einer vor kurzem entdeckten Familie Cl(-) Kan&auml;le, f&uuml;r die keine strukturelle Informationen verf&uuml;gbar ist. Einige Familienmitglieder werden durch erh&ouml;hten intrazellul&auml;ren Ca2 + Konzentration aktiviert. Bestrophins verf&uuml;gen &uuml;ber ein gut erhaltene Asp-Reich-Darm-Trakt in ihre COOH-Endstation (Asp-reiche Dom&auml;ne), das homologe zu Ca2 +-bindende Motive im menschlichen Thrombospondine und in menschlichen gro&szlig;en Leitwert Ca2 +- und Spannung-Gating K +-Kan&auml;le (BK(Ca)). Folglich ist die Asp-Reich-Domain auch ein Kandidat f&uuml;r Ca2 +-Bindung in Bestrophins. Auf der Grundlage dieser &Uuml;berlegungen, errichteten wir Homologie Modelle der menschlichen Bestrophin-1 (Best1) Asp-reiche Dom&auml;ne menschlichen Thrombospondin-1-x-ray-Struktur als Vorlage verwenden. Molekulardynamik-Simulationen wurden verwendet, um Asp und Glu R&uuml;ckst&auml;nde Binden von Ca2 + zu identifizieren und die Auswirkungen ihrer Mutationen zu Alanin. Wir fuhr dann fort, ausgew&auml;hlte Mutationen im Bereich Asp-Reich der hochgradig homologe Maus Bestrophin-2 zu testen. Die Mutanten, ausgedr&uuml;ckt in HEK-293-Zellen wurden von elektrophysiologischen Experimenten mit der ganz-Zell-Spannung-Clamp-Technik untersucht. Auf der Grundlage der Modellierungsergebnisse unserer Molekulare, voraus wir, dass Asp-reiche Dom&auml;ne verf&uuml;gt &uuml;ber zwei definierten Bindungsstellen und D301A und D304A Mutationen, die Bindung der Metallionen auswirken k&ouml;nnen. Die Experimente best&auml;tigt, dass diese Mutationen tats&auml;chlich beeintr&auml;chtigen die Funktion des Proteins verursacht einen gro&szlig;en R&uuml;ckgang der Ca2 +-aktivierten Cl(-) Strom, vollst&auml;ndig im Einklang mit unseren Vorhersagen. Dar&uuml;ber hinaus andere untersuchten Mutationen (E306A, D312A) nicht verringern Ca2 +-aktiviert Cl(-) aktuelle im Einvernehmen mit der Modellierung der Ergebnisse.

Regulierung des Bestrophins von Ca2 +: eine theoretische und experimentelle Studie.

Olfactory sensory neurons use a chloride-based signal amplification mechanism to detect odorants. The binding of odorants to receptors in the cilia of olfactory sensory neurons activates a transduction cascade that involves the opening of cyclic nucleotide-gated channels and the entry of Ca(2+) into the cilia. Ca(2+) activates a Cl(-) current that produces an efflux of Cl(-) ions and amplifies the depolarization. The molecular identity of Ca(2+)-activated Cl(-) channels is still elusive, although some bestrophins have been shown to function as Ca(2+)-activated Cl(-) channels when expressed in heterologous systems. In the olfactory epithelium, bestrophin-2 (Best2) has been indicated as a candidate for being a molecular component of the olfactory Ca(2+)-activated Cl(-) channel. In this study, we have analysed mice lacking Best2. We compared the electrophysiological responses of the olfactory epithelium to odorant stimulation, as well as the properties of Ca(2+)-activated Cl(-) currents in wild-type (WT) and knockout (KO) mice for Best2. Our results confirm that Best2 is expressed in the cilia of olfactory sensory neurons, while odorant responses and Ca(2+)-activated Cl(-) currents were not significantly different between WT and KO mice. Thus, Best2 does not appear to be the main molecular component of the olfactory channel. Further studies are required to determine the function of Best2 in the cilia of olfactory sensory neurons.

Calcium-activated chloride currents in olfactory sensory neurons from mice lacking bestrophin-2.

Olfaktorische sensorische Neuronen verwenden ein Verst&auml;rkungsmechanismus Chlorid basierenden Signal um Geruchsstoffe zu erkennen. Das Binden von Ger&uuml;chen an Rezeptoren in die Flimmerh&auml;rchen der olfaktorischen sensorischen Neuronen aktiviert eine Transduktion-Kaskade, bei der die &Ouml;ffnung der zyklische Nukleotid-Gating-Kan&auml;le und das Inkrafttreten des Ca(2+) die Flimmerh&auml;rchen. Ca(2+) wird eine aktuelle Cl(-), die ein Efflux Cl(-) Ionen produziert und verst&auml;rkt die Depolarisierung aktiviert. Die molekulare Identit&auml;t Cl(-) Ca(2+) aktivierte Kan&auml;le ist noch nicht abzusehen, obwohl einige Bestrophins gezeigt worden sind, die Funktion als Ca(2+) aktivierte Cl(-) Kan&auml;le in heterologen Systemen ausgedr&uuml;ckt. F&uuml;r Molekulare Komponente des olfaktorischen Ca(2+) aktivierte Cl(-) Kanals hat in der olfaktorischen Epithel Bestrophin-2 (Best2) als Kandidat aufgezeigt worden. In dieser Studie haben wir mit M&auml;usen fehlt Best2 analysiert. Wir verglichen die elektrophysiologischen Reaktionen von den olfaktorischen Epithel Odoriermittel Stimulation sowie die Eigenschaften des Ca(2+) aktivierte Cl(-) Str&ouml;mungen in Wildtyp (WT) und Knockout (KO)-M&auml;use f&uuml;r Best2. Unsere Ergebnisse best&auml;tigen, dass die Best2 in die Flimmerh&auml;rchen olfaktorischen sensorischen Neuronen, ausgedr&uuml;ckt wird, w&auml;hrend Odoriermittel Antworten und Ca(2+) aktivierte Cl(-) Str&ouml;mungen nicht signifikant verschieden zwischen WT und KO-M&auml;usen waren. So scheint Best2 nicht die molekulare Hauptkomponente des olfaktorischen Kanals werden. Weitere Studien sind erforderlich, um die Funktion des Best2 in die Flimmerh&auml;rchen der olfaktorischen sensorischen Neuronen zu bestimmen.

Kalzium aktivierte Chlorid Str&ouml;mungen im olfaktorischen sensorischen Neuronen von M&auml;usen fehlt Bestrophin-2.

Ca(2+)-activated Cl(-) channels play relevant roles in several physiological processes, including olfactory transduction, but their molecular identity is still unclear. Recent evidence suggests that members of the transmembrane 16 (TMEM16, also named anoctamin) family form Ca(2+)-activated Cl(-) channels in several cell types. In vertebrate olfactory transduction, TMEM16b/anoctamin2 has been proposed as the major molecular component of Ca(2+)-activated Cl(-) channels. However, a comparison of the functional properties in the whole-cell configuration between the native and the candidate channel has not yet been performed. In this study, we have used the whole-cell voltage-clamp technique to measure functional properties of the native channel in mouse isolated olfactory sensory neurons and compare them with those of mouse TMEM16b/anoctamin2 expressed in HEK 293T cells. We directly activated channels by rapid and reproducible intracellular Ca(2+) concentration jumps obtained from photorelease of caged Ca(2+) and determined extracellular blocking properties and anion selectivity of the channels. We found that the Cl(-) channel blockers niflumic acid, 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino)benzoic acid (NPPB) and DIDS applied at the extracellular side of the membrane caused a similar inhibition of the two currents. Anion selectivity measured exchanging external ions and revealed that, in both types of currents, the reversal potential for some anions was time dependent. Furthermore, we confirmed by immunohistochemistry that TMEM16b/anoctamin2 largely co-localized with adenylyl cyclase III at the surface of the olfactory epithelium. Therefore, we conclude that the measured electrophysiological properties in the whole-cell configuration are largely similar, and further indicate that TMEM16b/anoctamin2 is likely to be a major subunit of the native olfactory Ca(2+)-activated Cl(-) current.

Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16b-transfected HEK 293T cells.

Ca(2+) aktivierte Cl(-) Kan&auml;le relevante Rollen in verschiedene physiologische Prozesse, einschlie&szlig;lich olfaktorischen Signaltransduktion, spielen, aber ihre molekulare Identit&auml;t ist noch unklar. J&uuml;ngste Hinweise, dass Mitglieder der Transmembran 16 (TMEM16, auch ANO1 genannt) Familie Form Cl(-) Ca(2+) aktivierte Kan&auml;le in mehreren-Typen Handy. In vertebrate olfaktorischen Signaltransduktion wurde TMEM16b/anoctamin2 als molekulare Hauptkomponente der Cl(-) Ca(2+) aktivierte Kan&auml;le vorgeschlagen. Jedoch hat ein Vergleich der funktionellen Eigenschaften in der ganz-Zell Konfiguration zwischen systemeigenen und dem Kandidaten-Kanal noch nicht durchgef&uuml;hrt wurde. In dieser Studie haben wir die ganze Zelle Spannung Klemm-Technik verwendet, um funktionelle Eigenschaften des nativen Kanals in Maus isoliert olfaktorischen sensorischen Neuronen zu messen und vergleichen Sie sie mit der Maus TMEM16b/anoctamin2 in HEK 293T Zellen ausgedr&uuml;ckt. Wir aktiviert direkt Kan&auml;le durch schnelle und reproduzierbare intrazellul&auml;re Ca(2+) Konzentration Spr&uuml;nge aus Photorelease der K&auml;fig Ca(2+) und extrazellul&auml;re blockierende Eigenschaften und Anion Selektivit&auml;t der Kan&auml;le bestimmt. Wir fanden, dass die Cl(-) Kanal Blocker Niflumic S&auml;ure, 5-Nitro - 2-(3-Phenylpropylamino) Benzoes&auml;ure (NPPB) und did angewendet an der extrazellul&auml;ren Seite der Membran verursacht eine &auml;hnliche Hemmung der zwei Str&ouml;me. Anion Selektivit&auml;t Austausch von externe Ionen gemessen und ergab, dass beide Arten von Str&ouml;mungen, die Umkehrung Potenzial f&uuml;r einige Anionen zeitabh&auml;ngig war. Dar&uuml;ber hinaus best&auml;tigt wir durch Immunhistochemie, dass TMEM16b/anoctamin2 mit Fehlfunktion Guanylatcyclase III an der Oberfl&auml;che des olfaktorischen Epithel weitgehend co-localized. Daher schlie&szlig;en wir, dass die gemessenen elektrophysiologischen Eigenschaften in der ganz-Zell Konfiguration weitgehend &auml;hnlich sind, und weiter darauf hinweisen, dass TMEM16b/anoctamin2 eine gro&szlig;e Untereinheit des die native olfaktorischen Ca(2+) aktivierte Cl(-) aktuelle sein d&uuml;rfte.

Kalzium-Konzentration-Spr&uuml;nge zeigen dynamische Ion Selektivit&auml;t aktivierte Kalzium-Chlorid Str&ouml;mungen in Maus olfaktorischen sensorischen Neuronen und TMEM16b transfected HEK 293T Zellen.

Article	Year
Developmental regulation of small-conductance Ca2+-activated K+ channel expression and function in rat Purkinje neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience\| PubMed ID: 12040053	2002
Olfaction: from odorant molecules to the olfactory cortex. News in physiological sciences : an international journal of physiology produced jointly by the International Union of Physiological Sciences and the American Physiological Society\| PubMed ID: 15143202	2004
Binding of kappa-conotoxin PVIIA to Shaker K+ channels reveals different K+ and Rb+ occupancies within the ion channel pore. The Journal of general physiology\| PubMed ID: 15226365	2004
Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chemical senses\| PubMed ID: 16547196	2006
Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS letters\| PubMed ID: 16631748	2006
Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. The Journal of general physiology\| PubMed ID: 16880265	2006
Bestrophin-2 is a candidate calcium-activated chloride channel involved in olfactory transduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 16912113	2006
Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. Journal of neurophysiology\| PubMed ID: 17460108	2007
Regulation of bestrophins by Ca2+: a theoretical and experimental study. PloS one\| PubMed ID: 19262692	2009
Calcium-activated chloride currents in olfactory sensory neurons from mice lacking bestrophin-2. The Journal of physiology\| PubMed ID: 19622610	2009
Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16b-transfected HEK 293T cells. The Journal of physiology\| PubMed ID: 20837642	2010

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