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Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy

Major advances in high-throughput, high-resolution, 3D microscopy techniques have enabled the acquisition of large volumes of neuroanatomical data at ...

Thread-like structures are becoming more common in modern volumetric data sets as our ability to image vascular and neural tissue at higher resolutions improves. The thread-like structures of neurons and micro-vessels pose a unique problem in visualization since they tend to be densely packed in small volumes of tissue. This makes it difficult for an observer to interpret useful patterns from the data or trace individual fibers. In this paper we describe several methods for dealing with large amounts of thread-like data, such as data sets collected using Knife-Edge Scanning Microscopy (KESM) and Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM). These methods allow us to collect volumetric data from embedded samples of whole-brain tissue. The neuronal and microvascular data that we acquire consists of thin, branching structures extending over very large regions. Traditional visualization schemes are not sufficient to make sense of the large, dense, complex structures encountered. In this paper, we address three methods to allow a user to explore a fiber network effectively. We describe interactive techniques for rendering large sets of neurons using self-orienting surfaces implemented on the GPU. We also present techniques for rendering fiber networks in a way that provides useful information about flow and orientation. Third, a global illumination framework is used to create high-quality visualizations that emphasize the underlying fiber structure. Implementation details, performance, and advantages and disadvantages of each approach are discussed.

Visualization of fibrous and thread-like data.

Thread-Strukturen werden immer h&auml;ufiger in modernen volumetrischen Datens&auml;tzen als unsere F&auml;higkeit, gef&Atilde; &curren; Bild und Nervengewebe verbunden mit h&ouml;heren Aufl&ouml;sungen verbessert. Die Thread-Strukturen von Neuronen und Mikro-Schiffe stellen ein einzigartiges Problem in der Visualisierung, da sie neigen dazu, in kleinen Mengen von Gewebe dicht gepackt werden. Dies erschwert es f&uuml;r einen Beobachter, n&uuml;tzliche Muster aus einzelnen Fasern Daten oder Trace zu interpretieren. In diesem Beitrag beschreiben wir verschiedene Methoden f&uuml;r den Umgang mit gro&szlig;en Datenmengen faden&auml;hnliche, wie Datens&auml;tze zusammengestellt mit Messerschneiden-Scanning-Mikroskopie (KESM) und serielle Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM). Diese Methoden erm&ouml;glichen uns eingebetteten Proben des gesamten Gehirngewebes Volumetrische Daten erfassen. Die neuronalen und mikrovaskul&auml;re Daten, die wir erwerben besteht aus d&uuml;nnen, verzweigte Strukturen, die &uuml;ber sehr gro&szlig;e Regionen. Traditionelle Visualisierung Regelungen reichen nicht aus, um Sinn der gro&szlig;en, dichten, komplexen Strukturen gefunden. In diesem Papier wenden wir uns drei Methoden, um einem Benutzer erlauben, eine Glasfaser-Netzwerk effektiv zu erkunden. Wir beschreiben die interaktive Techniken f&uuml;r das Rendern von gro&szlig;er Gruppen von Neuronen mit self-orienting Oberfl&auml;chen auf der GPU implementiert. Wir pr&auml;sentieren auch Techniken f&uuml;r das Rendern von Glasfaser-Netzwerken in einer Weise, die n&uuml;tzliche Informationen &uuml;ber Fluss und Orientierung bietet. Drittens ist ein globale Illumination-Framework verwendet, um qualitativ hochwertige Visualisierungen erstellen, die die zugrunde liegende Struktur der Faser zu betonen. Implementierungsdetails, Leistung, und vor- und Nachteile der einzelnen Konzepte werden diskutiert.

Visualisierung von faserigen und Thread-wie Daten.

Understanding the structure of microvasculature structures and their relationship to cells in biological tissue is an important and complex problem. Brain microvasculature in particular is known to play an important role in chronic diseases. However, these networks are only visible at the microscopic level and can span large volumes of tissue. Due to recent advances in microscopy, large volumes of data can be imaged at the resolution necessary to reconstruct these structures. Due to the dense and complex nature of microscopy data sets, it is important to limit the amount of information displayed. In this paper, we describe methods for encoding the unique structure of microvascular data, allowing researchers to selectively explore microvascular anatomy. We also identify the queries most useful to researchers studying microvascular and cellular relationships. By associating cellular structures with our microvascular framework, we allow researchers to explore interesting anatomical relationships in dense and complex data sets.

Visualization of cellular and microvascular relationships.

Grundlegendes zur Struktur von Microvasculature Strukturen und deren Beziehung zu Zellen in biologischen Geweben ist ein wichtiges und komplexes Problem. Gehirn Microvasculature ist insbesondere bekannt, dass bei chronischen Krankheiten eine wichtige Rolle spielen. Jedoch diese Netze sind nur auf der mikroskopischen Ebene sichtbar und k&ouml;nnen gro&szlig;e Mengen von Gewebe erstrecken. Aufgrund der j&uuml;ngsten Fortschritte in der Mikroskopie k&ouml;nnen gro&szlig;e Datenmengen bei der Aufl&ouml;sung notwendig, diese Strukturen zu rekonstruieren abgebildet werden. Aufgrund der dichten und komplexen Natur der Mikroskopie-Datens&auml;tze ist es wichtig, die Menge der angezeigten Informationen begrenzen. In diesem Beitrag beschreiben wir Methoden f&uuml;r das Codieren der einzigartigen Struktur der mikrovaskul&auml;re Daten erlauben Forschern, mikrovaskul&auml;re Anatomie selektiv zu erkunden. Wir erkennen auch die n&uuml;tzlichsten Forscher studieren mikrovaskul&auml;re und zellul&auml;re Beziehungen Abfragen. Durch unser mikrovaskul&auml;re Framework zellul&auml;re Strukturen zuordnen, gestatten wir Forscher, interessante anatomische Beziehungen in dichten und komplexen Datens&auml;tzen zu erkunden.

Visualisierung der zellul&auml;ren und mikrovaskul&auml;re Beziehungen.

We present a framework for segmenting and storing filament networks from scalar volume data. Filament networks are encountered more and more commonly in biomedical imaging due to advances in high-throughput microscopy. These data sets are characterized by a complex volumetric network of thin filaments embedded in a scalar volume field. High-throughput microscopy volumes are also difficult to manage since they can require several terabytes of storage, even though the total volume of the embedded structure is much smaller. Filaments in microscopy data sets are difficult to segment because their diameter is often near the sampling resolution of the microscope, yet these networks can span large regions of the data set. We describe a novel method to trace filaments through scalar volume data sets that is robust to both noisy and undersampled data. We use graphics hardware to accelerate the tracing algorithm, making it more useful for large data sets. After the initial network is traced, we use an efficient encoding scheme to store volumetric data pertaining to the network.

Hardware accelerated segmentation of complex volumetric filament networks.

Wir pr&auml;sentieren Ihnen einen Rahmen f&uuml;r die Segmentierung und Speicherung Filament-Netzwerken von skalaren Volume-Daten. Filament-Netzwerke sind mehr und mehr allgemein in biomedizinische Bildgebung aufgrund der Fortschritte im Hochdurchsatz-Mikroskopie gefunden. Diese Daten-Sets zeichnen sich durch ein komplexes Volumetrische Netzwerk d&uuml;nner Filamente in einem skalaren Band Feld eingebettet. Hochdurchsatz-Mikroskopie-Volumes sind auch schwierig zu handhaben, da sie mehrere Terabyte an Speicher, erfordern k&ouml;nnen, obwohl das Gesamtvolumen der eingebetteten Struktur viel kleiner ist. Filamente in Mikroskopie-Datens&auml;tzen sind schwer zu Segment, weil ihr Durchmesser oft in der N&auml;he der Sampling-Aufl&ouml;sung des Mikroskops ist, doch diese Netzwerke k&ouml;nnen gro&szlig;e Regionen des Datasets erstrecken. Wir beschreiben eine neuartige Methode zur Ablaufverfolgung Filamente durch skalare Volume-Daten-Sets, die sowohl laut als auch undersampled Daten robust ist. Wir verwenden die Grafikhardware, um den Ablaufverfolgung-Algorithmus zu beschleunigen, so dass es mehr n&uuml;tzlich f&uuml;r gro&szlig;e Datenmengen. Nachdem das erste Netzwerk verfolgt wird, verwenden wir ein effizientes Codierungsschema, um Volumetrische Daten in Bezug auf das Netzwerk zu speichern.

Hardware-beschleunigte Segmentierung und komplexe Volumetrische Filament-Netzwerke.

We present an inference-based surface reconstruction algorithm that is capable of identifying objects of interest amongst a cluttered scene, and reconstructing solid model representations even in the presence of occluded surfaces. Our proposed approach incorporates a predictive modeling framework that uses a set of user provided models for prior knowledge, and applies this knowledge to the iterative identification and construction process. Our approach uses a local to global construction process guided by rules for fitting high quality surface patches obtained from these prior models. We demonstrate the application of this algorithm on several example datasets containing heavy clutter and occlusion.

Inference-Based Surface Reconstruction of Cluttered Environments.

Wir pr&auml;sentieren einen Inferenz-basierte Oberfl&auml;chenrekonstruktion-Algorithmus, der Identifikation von Objekten Interesse einer durcheinandergeworfenen Szene und Volumenmodell Vertretungen auch in Gegenwart von verschlossenen Oberfl&auml;chen zu rekonstruieren kann. Unsere vorgeschlagene Konzept beinhaltet ein Vorhersagemodellierung-Rahmenwerk, verwendet der Benutzer bereitgestellten Modelle f&uuml;r Vorkenntnisse und gilt dieses Wissen f&uuml;r die iterative Ermittlung und Bauprozess. Unser Ansatz verwendet einen lokalen zum globalen Bauprozess, geleitet von Regeln f&uuml;r den Einbau von hochwertigen Oberfl&auml;chen Flecken aus diesen fr&uuml;heren Modellen gewonnen. Wir demonstrieren die Anwendung dieses Algorithmus auf mehrere Beispiel-Datens&auml;tze, die mit schweren Unordnung und Okklusion.

Inferenz-basierte Oberfl&auml;chenrekonstruktion un&uuml;bersichtlich-Umgebungen.

Accurate microvascular morphometric information has significant implications in several fields, including the quantification of angiogenesis in cancer research, understanding the immune response for neural prosthetics, and predicting the nature of blood flow as it relates to stroke. We report imaging of the whole mouse brain microvascular system at resolutions sufficient to perform accurate morphometry. Imaging was performed using Knife-Edge Scanning Microscopy (KESM) and is the first example of this technique that can be directly applied to clinical research. We are able to achieve â‰ˆ 0.7Î¼m resolution laterally with 1Î¼m depth resolution using serial sectioning. No alignment was necessary and contrast was sufficient to allow segmentation and measurement of vessels.

Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM.

Genaue mikrovaskul&auml;re morphometrischer Informationen hat gravierende Auswirkungen auf verschiedenen Gebieten, einschlie&szlig;lich der Quantifizierung von Angiogenesis in der Krebsforschung, verstehen die Immunantwort f&uuml;r Neuroprothesen und Vorhersage der Natur des Blutflusses, bez&uuml;glich der Schlaganfall. Wir berichten Bildgebung des Gehirns ganze Maus mikrovaskul&auml;re Systems bei Aufl&ouml;sungen ausreichend genaue Morphometrie durchf&uuml;hren. Imaging wurde mithilfe von Messerschneiden-Scanning-Mikroskopie (KESM) durchgef&uuml;hrt und ist das erste Beispiel dieser Technik, die klinische Forschung direkt angewendet werden k&ouml;nnen. Wir sind in der Lage zu erreichen &asymp; 0.7&mu;m Aufl&ouml;sung seitlich mit 1&mu;m Tiefe Aufl&ouml;sung mit seriellen schneiden. Keine Ausrichtung war notwendig und Kontrast Segmentierung und Messung der Schiffe zu erm&ouml;glichen.

Schnelle Makro-Ma&szlig;stab &Uuml;bertragung Bildgebung mikrovaskul&auml;re Netzwerke mithilfe von KESM.

Connectomics is the study of the full connection matrix of the brain. Recent advances in high-throughput, high-resolution 3D microscopy methods have enabled the imaging of whole small animal brains at a sub-micrometer resolution, potentially opening the road to full-blown connectomics research. One of the first such instruments to achieve whole-brain-scale imaging at sub-micrometer resolution is the Knife-Edge Scanning Microscope (KESM). KESM whole-brain data sets now include Golgi (neuronal circuits), Nissl (soma distribution), and India ink (vascular networks). KESM data can contribute greatly to connectomics research, since they fill the gap between lower resolution, large volume imaging methods (such as diffusion MRI) and higher resolution, small volume methods (e.g., serial sectioning electron microscopy). Furthermore, KESM data are by their nature multiscale, ranging from the subcellular to the whole organ scale. Due to this, visualization alone is a huge challenge, before we even start worrying about quantitative connectivity analysis. To solve this issue, we developed a web-based neuroinformatics framework for efficient visualization and analysis of the multiscale KESM data sets. In this paper, we will first provide an overview of KESM, then discuss in detail the KESM data sets and the web-based neuroinformatics framework, which is called the KESM brain atlas (KESMBA). Finally, we will discuss the relevance of the KESMBA to connectomics research, and identify challenges and future directions.

Multiscale exploration of mouse brain microstructures using the knife-edge scanning microscope brain atlas.

Connectomics ist die Studie der vollst&auml;ndige Verbindung Matrix des Gehirns. J&uuml;ngsten Fortschritte in hohem Durchsatz, hochaufl&ouml;sende 3D Mikroskopie-Methoden die Bildgebung von ganz kleinen tierischen Gehirnen mit Sub-micrometer Aufl&ouml;sung, potenziell &ouml;ffnen den Weg zum ausgewachsenen Connectomics Forschung aktiviert haben. Einer der ersten solcher Instrumente ganz-Gehirn-Ma&szlig;stab Bildgebung bei Sub-micrometer Aufl&ouml;sung zu erreichen ist die Messerschneiden-Scanning-Mikroskop (KESM). KESM ganze-Gehirn-Datens&auml;tze enthalten jetzt Golgi (neuronale Schaltkreise), Nissl (Soma-Verteilung) und Tusche (vaskul&auml;re Netze). KESM Daten k&ouml;nnen erheblich zur Connectomics Forschung, beitragen, da sie die L&uuml;cke zwischen niedrigere Aufl&ouml;sung, gro&szlig;volumige bildgebenden Verfahren (z. B. Diffusion MRI) und h&ouml;here Aufl&ouml;sung, kleinvolumigen Methoden (z. B. serielle Schneide-Elektronenmikroskopie). Dar&uuml;ber hinaus sind KESM Daten durch ihre Natur Multiscale, von der subzellul&auml;ren bis hin zu der gesamten Orgel-Skala. Aus diesem Grund ist die Visualisierung allein eine gro&szlig;e Herausforderung, bevor wir selbst sorgen &uuml;ber quantitative Konnektivit&auml;t Analyse. Um dieses Problem zu l&ouml;sen, haben wir einen webbasierten Neuroinformatik Rahmen f&uuml;r effiziente Visualisierung und Analyse der Multiskalen KESM Datens&auml;tze entwickelt. In diesem Papier werden wir zuerst geben einen &Uuml;berblick &uuml;ber KESM dann im Detail zu diskutieren, die KESM-Datens&auml;tze und die webbasierte Neuroinformatik-Framework, das den KESM Gehirn-Atlas (KESMBA) aufgerufen wird. Schlie&szlig;lich wird die Relevanz der die KESMBA f&uuml;r Connectomics Forschung zu diskutieren, und Herausforderungen und Zukunftsperspektiven zu identifizieren.

Article	Year
Visualization of fibrous and thread-like data. IEEE transactions on visualization and computer graphics\| PubMed ID: 17080848	2006
Visualization of cellular and microvascular relationships. IEEE transactions on visualization and computer graphics\| PubMed ID: 18989017	2008
Hardware accelerated segmentation of complex volumetric filament networks. IEEE transactions on visualization and computer graphics\| PubMed ID: 19423890	2009
Inference-Based Surface Reconstruction of Cluttered Environments. IEEE transactions on visualization and computer graphics\| PubMed ID: 21968935	2011
Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomedical optics express\| PubMed ID: 22091443	2011
Multiscale exploration of mouse brain microstructures using the knife-edge scanning microscope brain atlas. Frontiers in neuroinformatics\| PubMed ID: 22275895	2011

John Keyser

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