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Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

We have isolated clones representing at least three nuclear genes for mitochondrial ribosomal proteins from Neurospora crassa by screening a lambda gt11 cDNA library with an antiserum against a mixture of these proteins. The cDNA and genomic DNA sequence for one of these genes, mrp-3, was determined. The MRP3 protein was purified by immune-affinity chromatography, using a monoclonal antibody probe, and subjected to amino acid sequence analysis to identify the mature amino terminus and a prospective mitochondrial-targeting presequence. MRP3 was identified as the largest, least basic protein detected from the small subunit of ribosomes which had been salt-washed and fractionated on sucrose gradients. However, the mRNA and protein products of mrp-3 were found to be present in excess over those of other N. crassa mitoribosomal protein genes. Using a solution hybridization/S1 nuclease assay, we found three-fold- more mRNA for mrp-3 than for another mito-ribosomal protein gene. In addition, a 30- to 50-fold excess of non-ribosomal MRP3 protein was discovered. The additional protein was localized in mitochondrial membrane fractions; none was detected in matrix fractions after removal of the ribosomes. An immunologically related protein was detected in ribosome and membrane fractions of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. The functional significance of this dual localization remains an enigma.

A mitochondrial protein from Neurospora crassa detected both on ribosomes and in membrane fractions. Analysis of the gene, the message, and the protein.

Wir haben Klone, die mindestens drei nukle&#xE4;re Gene f&#xFC;r mitochondriale ribosomale Proteine &#x200B;&#x200B;aus Neurospora crassa durch Screening einer Lambda gt11-cDNA-Bibliothek mit einem Antiserum gegen eine Mischung aus diesen Proteinen isoliert. Die cDNA und genomische DNA-Sequenz f&#xFC;r eines dieser Gene, MRP-3, wurde bestimmt. Die MRP3 Protein wurde durch Immun-Affinit&#xE4;ts-Chromatographie unter Verwendung eines monoklonalen Antik&#xF6;rpers Sonde und einer Aminos&#xE4;uresequenz-Analyse, um das reife Aminoterminus und eine prospektive mitochondrialen Targeting-Pr&#xE4;sequenz identifizieren. MRP3 wurde als die gr&#xF6;&#xDF;te, mindestens basisches Protein aus der kleinen Untereinheit der Ribosomen, die bereits Salz gewaschen und fraktioniert auf Saccharosegradienten hatte aufgesp&#xFC;rt. Jedoch wurden die mRNA-und Protein-Produkte von MRP-3 gefunden, um im &#xDC;berma&#xDF; vorhanden sein gegen&#xFC;ber denen anderer N. crassa mitoribosomal Protein-Gene. Mit einer L&#xF6;sung hybridization/S1 Nuklease-Assay, fanden wir das Dreifache mehr-mRNA f&#xFC;r MRP-3 als f&#xFC;r einen anderen mito-ribosomalen Protein-Gen. Dar&#xFC;ber hinaus wurde eine 30 - bis 50-fachen &#xDC;berschuss an nicht-ribosomalen Proteins MRP3 entdeckt wurde. Das zus&#xE4;tzliche Protein wurde in der mitochondrialen Membran-Fraktionen lokalisiert, keiner wurde in der Matrix Fraktionen nach der Entfernung der Ribosomen erkannt. Eine immunologisch verwandtes Protein wurde im Ribosom und Membranfraktionen von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae nachgewiesen werden. Die funktionelle Bedeutung dieser dualen Lokalisation bleibt ein R&#xE4;tsel.

Eine mitochondriale Protein aus Neurospora crassa erkannt sowohl an Ribosomen und in Membranfraktionen. Analyse des Gens, der Nachricht, und dem Protein.

We have isolated and characterized a Neurospora crassa gene homologous to the yeast CYH2 gene encoding L29, a cycloheximide sensitivity-conferring protein of the cytoplasmic ribosome. The cloned Neurospora gene was isolated by cross-hybridization to CYH2. It was sequenced from both cDNA and genomic clones. The coding region is interrupted by seven intervening sequences. Its deduced amino acid sequence shows 70% homology to that of yeast ribosomal protein L29 and 60% homology to that of mammalian ribosomal protein L27', suggesting that the protein has an important role in ribosomal function. The pattern of codon usage is highly biased, consistent with high translation efficiency. There is a single copy of this gene in N. crassa, and R. Metzenberg and coworkers have mapped its genetic location to the vicinity of the cyh-2 locus.

Isolation and characterization of a Neurospora crassa ribosomal protein gene homologous to CYH2 of yeast.

Wir haben uns isoliert und eine Neurospora crassa Gen charakterisiert homolog zu der Hefe CYH2 kodierenden Gen L29, eine Empfindlichkeit Cycloheximid-Protein verleiht der cytoplasmatischen Ribosomen. Das klonierte Gen Neurospora wurde durch Kreuzhybridisierung zu CYH2 isoliert. Es wurde von beiden cDNA und genomische Klone sequenziert. Die kodierende Region wird von sieben intervenierende Sequenzen unterbrochen. Die abgeleitete Aminos&#xE4;uresequenz zeigt 70% Homologie mit der von Hefe ribosomalen Protein L29 und 60% Homologie mit der von S&#xE4;uger-ribosomalen Protein L27 &#x26;quot;, was darauf hindeutet, dass das Protein eine wichtige Rolle bei der ribosomale Funktion hat. Das Muster der Codon-Nutzung ist stark verzerrt, im Einklang mit hoher &#xDC;bersetzung Effizienz. Es ist eine einzige Kopie dieses Gens in N. crassa, und R. Metzenberg und Mitarbeiter haben ihre genetischen Ort in die N&#xE4;he des CYH-2-Locus kartiert.

Isolierung und Charakterisierung eines Neurospora crassa ribosomalen Protein-Gens homolog zu CYH2 der Hefe.

Because Bacteroides spp. are obligate anaerobes that dominate the human fecal flora, and because some species may live only in the human intestine, these bacteria might be useful to distinguish human from nonhuman sources of fecal pollution. To test this hypothesis, PCR primers specific for 16S rRNA gene sequences of Bacteroides distasonis, B. thetaiotaomicron, and B. vulgatus were designed. Hybridization with species-specific internal probes was used to detect the intended PCR products. Extracts from 66 known Bacteroides strains, representing 10 related species, were used to confirm the specificity of these PCR-hybridization assays. To test for specificity in feces, procedures were developed to prepare DNA of sufficient purity for PCR. Extracts of feces from 9 humans and 70 nonhumans (cats, dogs, cattle, hogs, horses, sheep, goats, and chickens) were each analyzed with and without an internal positive control to verify that PCR amplification was not inhibited by substances in the extract. In addition, serial dilutions from each extract that tested positive were assayed to estimate the relative abundance of target Bacteroides spp. in the sample. Depending on the primer-probe set used, either 78 or 67% of the human fecal extracts tested had high levels of target DNA. On the other hand, only 7 to 11% of the nonhuman extracts tested had similarly high levels of target DNA. An additional 12 to 20% of the nonhuman extracts had levels of target DNA that were 100- to 1,000-fold lower than those found in humans.(ABSTRACT TRUNCATED AT 250 WORDS)

Design and evaluation of Bacteroides DNA probes for the specific detection of human fecal pollution.

Da Bacteroides spp. sind obligate Anaerobier, die die menschliche f&#xE4;kale Flora dominieren, und weil einige Arten nur leben k&#xF6;nnen im menschlichen Darm, diese Bakterien k&#xF6;nnte sinnvoll sein, zu unterscheiden von nichtmenschlichen Quellen der f&#xE4;kale Verschmutzung menschlich. Um diese Hypothese zu testen, wurden PCR-Primer, die spezifisch f&#xFC;r 16S rRNA-Gensequenzen von Bacteroides distasonis, B. thetaiotaomicron, und B. vulgatus gestalten. Die Hybridisierung mit artspezifischen internen Sonden verwendet wurde, um die vorgesehenen PCR-Produkte zu erkennen. Ausz&#xFC;ge aus 66 bekannten Bacteroides-St&#xE4;mmen, was 10 verwandte Arten, wurden verwendet, um die Spezifit&#xE4;t dieser PCR-Hybridisierungsassays best&#xE4;tigen. Um f&#xFC;r die Spezifit&#xE4;t im Kot zu testen, wurden Verfahren entwickelt, um DNA mit ausreichender Reinheit f&#xFC;r die PCR vorbereiten. Ausz&#xFC;ge aus Kot von 9 und 70 Menschen Nichtmenschen (Katzen, Hunde, Rinder, Schweine, Pferde, Schafe, Ziegen und H&#xFC;hner) wurden jeweils mit und ohne interne positive Kontrolle, dass die PCR-Amplifikation zu &#xFC;berpr&#xFC;fen analysiert wurde nicht gehemmt durch Substanzen im Extrakt . Dar&#xFC;ber hinaus wurden serielle Verd&#xFC;nnungen von jedem Extrakt positiv getesteten untersucht, um die relative H&#xE4;ufigkeit von Ziel Bacteroides spp abzusch&#xE4;tzen. in der Probe. Abh&#xE4;ngig von der Primer-Sonden-Set verwendet werden, entweder 78 oder 67% der menschlichen Stuhlextrakten getestet hatte ein hohes Ma&#xDF; an Ziel-DNA. Auf der anderen Seite gab es nur 7 bis 11% der humanen Extrakten getestet &#xE4;hnlich hohen Ziel-DNA. Eine zus&#xE4;tzliche 12 bis 20% der nicht-menschlichen Extrakte hatten Ebenen der Ziel-DNA, die 100 waren -. Zu 1.000-fach geringer als die beim Menschen gefunden (Abstract 250 W&#xF6;rter TRUNCATED)

Gestaltung und Bewertung von Bacteroides DNA-Sonden f&#xFC;r den spezifischen Nachweis von humanem f&#xE4;kale Verschmutzung.

The benefits of adding bovine serum albumin (BSA) or T4 gene 32 protein (gp32) to PCR were evaluated with reaction mixtures containing substances that inhibit amplification. Whereas 10- to 1,000-fold more FeCl3, hemin, fulvic acids, humic acids, tannic acids, or extracts from feces, freshwater, or marine water were accommodated in PCR when either 400 ng of BSA per microl or 150 ng of gp32 per microl was included in the reactions, neither BSA nor gp32 relieved interference significantly when minimum inhibitory levels of bile salts, bilirubin, EDTA, NaCl, sodium dodecyl sulfate, or Triton X-100 were present. Use of BSA and gp32 together offered no more relief of inhibition than either alone at its optimal level, and neither protein had any noticeable effect on amplification in the absence of inhibitors.

Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein.

Relief der Amplifizierungshemmung in der PCR mit Rinderserumalbumin oder T4-Gen 32-Protein.

To evaluate the persistence of PCR-detectable Bacteroides distasonis in surface water, whole human feces were dispersed into water from the Ohio River and incubated in flasks in the laboratory or in diffusion chambers in situ. Duplicate samples were taken daily, and material that pelleted at 16,000 x g was assayed by PCR. Persistence of PCR-detectable DNA from this anaerobe depended upon temperature and predation, two of the factors shown by others to influence the survival of aerobic bacteria detected by culture. B. distasonis was detected by PCR for at least 2 weeks at 4 degrees C but for only 4 to 5 days at 14 degrees C, 1 to 2 days at 24 degrees C, and 1 day at 30 degrees C. In filtered water or in the presence of cycloheximide, a eukaryotic inhibitor, persistence at 24 degrees C was extended by at least a week.

Article	Year
A mitochondrial protein from Neurospora crassa detected both on ribosomes and in membrane fractions. Analysis of the gene, the message, and the protein. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 2521217	1989
Isolation and characterization of a Neurospora crassa ribosomal protein gene homologous to CYH2 of yeast. Nucleic acids research\| PubMed ID: 2960953	1987
Design and evaluation of Bacteroides DNA probes for the specific detection of human fecal pollution. Applied and environmental microbiology\| PubMed ID: 7538270	1995
Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Applied and environmental microbiology\| PubMed ID: 8975603	1996
Persistence of PCR-detectable Bacteroides distasonis from human feces in river water. Applied and environmental microbiology\| PubMed ID: 9758854	1998

Carol Kreader

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