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Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Replicative senescence of human fibroblasts is a widely used cellular model for human aging. While it is clear that telomere erosion contributes to the development of replicative senescence, it is assumed that additional factors contribute to the senescent phenotype. The free radical theory of aging suggests that oxidative damage is a major cause of aging; furthermore, the expression of activated oncogenes, such as oncogenic Ras, can induce premature senescence in primary cells. The functional relation between the various inducers of senescence is not known. The present study was guided by the hypothesis that constitutive activation of normal, unmutated Ras may contribute to senescence-induced growth arrest in senescent human fibroblasts. When various branches of Ras-dependent signaling were investigated, constitutive activation of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway was not observed. To evaluate the role of oxidative stress for the senescent phenotype, we also investigated stress-related protein kinases. While we found no evidence for alterations in the activity of p38, we could detect an increased activity of Jun kinase in senescent fibroblasts. We also found higher levels of reactive oxygen species (ROS) in senescent fibroblasts compared to their younger counterparts. The accumulation of ROS in senescent cells may be related to the constitutive activation of Jun kinase.

Replicative senescence of human fibroblasts: the role of Ras-dependent signaling and oxidative stress.

Zellalterung der menschlichen Fibroblasten ist ein weit verbreitetes zellul&auml;re Modell f&uuml;r menschliche Altern. W&auml;hrend es frei ist, dass Telomere Erosion zur Entwicklung der Zellalterung beitr&auml;gt, ist davon auszugehen, dass zus&auml;tzliche Faktoren der alternde Ph&auml;notyp beitragen. Die freie Radikale-Theorie des Alterns empfiehlt den oxidativen Sch&auml;den ist eine Hauptursache der Alterung; Dar&uuml;ber hinaus kann der Ausdruck aktivierte Onkogene, z. B. Onkogene Ras, vorzeitiges Altern in Prim&auml;rzellen veranlassen. Die funktionale Beziehung zwischen den verschiedenen Induktoren der Seneszenz ist nicht bekannt. Die vorliegende Studie st&uuml;tzte sich auf die Hypothese, dass konstitutive Aktivierung des normalen unmutated Ras zur Seneszenz induziert Wachstumanhalten in menschlichen Fibroblasten alternde beitragen kann. Als verschiedene Zweige der Ras-abh&auml;ngige Signalisierung untersucht wurden, wurde die konstitutive Aktivierung des Ras/Raf/MEK/ERK Signalweges nicht beobachtet. Um die Rolle des oxidativen Stress f&uuml;r die alternde Ph&auml;notyp zu bewerten, untersuchten wir auch stressbedingten Proteinkinasen. Solange wir keine Hinweise auf Ver&auml;nderungen in der T&auml;tigkeit des p38 gefunden, konnten wir eine erh&ouml;hte Aktivit&auml;t von Jun-Kinase in alternde Fibroblasten erkennen. Wir fanden auch die h&ouml;here Ebenen der reaktive Sauerstoffspezies (ROS) in alternde Fibroblasten im Vergleich zu ihren j&uuml;ngeren Kollegen. Die Anh&auml;ufung von ROS in alternde Zellen kann an die konstitutiven Aktivierung der Jun-Kinase zusammenh&auml;ngen.

Zellalterung der menschlichen Fibroblasten: die Rolle der Ras-abh&auml;ngige Signalisierung und oxidativen Stress.

Replicative senescence of human endothelial cells was analyzed, using primary endothelial cells from the human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) as an experimental model system. We had shown before that senescent HUVEC arrest in the G1 phase of the cell cycle and that a subpopulation of the senescent cells undergoes cell death. We now demonstrate that cell death occurs by apoptosis, characterized by activation of caspase 3. Using the redox-sensitive dye dihydrorhodamine 123, a significant accumulation of reactive oxygen species is detected in senescent but not young endothelial cells. To determine if increased oxidative stress may contribute to the senescent phenotype, cells were treated with tert-butyl hydroperoxide (tBHP), which is known to increase oxidative stress by decreasing the intracellular glutathione levels. We show here that mild tBHP stress induces a phenotype of premature senescence in a subpopulation of the treated cells, which closely resembles the phenotype of naturally senescent HUVEC, including growth arrest, senescence-associated beta-gal activity, and apoptotic cell death. These results establish a model of premature senescence for human endothelial cells, which will be suitable to analyze mechanisms of age-associated cell death.

Senescence-associated cell death of human endothelial cells: the role of oxidative stress.

Zellalterung der menschliche Endothelzellen wurde analysiert, mit prim&auml;re Endothelzellen aus menschlichen Nabel-Vene Endothelzellen (HUVEC) als experimentelles Modellsystem. Wir hatten vor gezeigt, dass alternde HUVEC Verhaftung in der G1-Phase des Zellzyklus und, dass eine Subpopulation der alternde Zellen durchl&auml;uft Tod Zelle. Wir zeigen nun, dass Zelltod durch Apoptose, charakterisiert durch Aktivierung von Caspase 3 auftritt. Verwenden die Redox-Sensitive Farbstoff Dihydrorhodamine 123, ist eine bedeutende Ansammlung von reaktive Sauerstoffspezies in alternde aber nicht jung Endothelzellen erkannt. Um festzustellen, ob die erh&ouml;hter oxidativer Stress der alternde Ph&auml;notyp bedingen kann, wurden Zellen mit Tert-Butyl Cumolhydroperoxid (tBHP), behandelt, die bekannt ist, dass oxidativen Stress zu erh&ouml;hen, durch eine Verringerung der intrazellul&auml;ren Glutathion-Ebenen. Hier zeigen wir, dass milde tBHP Spannung einen Ph&auml;notyp der vorzeitigen Altern in einer Teilgesamtheit der behandelten Zellen, die &auml;hnelt sehr der Ph&auml;notyp der nat&uuml;rlich alternde HUVEC induziert, einschlie&szlig;lich Wachstumanhalten, Altern-verbundene Beta-Gallone-Aktivit&auml;t und Apoptotic Zellentod. Diese Ergebnisse stellen ein Modell der vorzeitigen Altern f&uuml;r menschliche Endothelzellen, die geeignet sind, die Mechanismen der Alters-assoziierten Zelltod analysieren werden.

Altern-verbundene Zellentod menschliche Endothelzellen: die Rolle des oxidativen Stress.

Human aging processes are regulated by many divergent pathways and on many levels. Thus, to understand such a complex system and define conserved mechanisms of aging, the use of cell culture-based models is a widespread practice. An often stated advantage of in vitro aging of primary cells is the high reproducibility compared to the much more intricate aging of organisms. However, the aging process of cultured cells is, like aging of organisms, not only defined by genetic but also by environmental factors, making it difficult to distinguish between cell culture condition-induced artefacts and true aspects of aging. Therefore we investigated aging of HUVEC (human umbilical vascular endothelial cells), a well-known and widely used model system for in vitro aging, with different, already well-established cell culture protocols. Culturing conditions had indeed a strong impact on cell proliferation, the replicative lifespan and apoptosis rates. However, despite these significant differences, we found also various robust markers that define senescent HUVEC: morphological changes, increased senescence-associated beta-galactosidase staining, cell cycle arrest in the G1 phase, lowered mitochondrial membrane potential and increased oxidatively modified proteins were displayed independent of cell culture protocols and could therefore be considered also as markers for in vivo aging.

Identification of cultivation-independent markers of human endothelial cell senescence in vitro.

Menschliche Alterungsprozesse werden von vielen unterschiedlichen Bahnen und auf vielen Ebenen reguliert. Um ein solch komplexes System zu verstehen und konservierte Mechanismen des Alterns zu definieren, ist die Verwendung von Zelle Kultur basierende Modelle so eine weit verbreitete Praxis. Ein oft genannten Vorteil von in-vitro-Alterung von Prim&auml;rzellen ist die hohe Reproduzierbarkeit im Vergleich zu der wesentlich komplexeren Altern der Organismen. Allerdings ist der Alterungsprozess der kultivierten Zellen, wie Alterung der Organismen, definiert nicht nur von genetischen, sondern auch durch Umweltfaktoren erschweren Zelle Kultur Zustand induziert Artefakte und wirklich Aspekte des Alterns zu unterscheiden. Daher haben wir untersucht Alterung der HUVEC (menschlicher Nabelschnur vaskul&auml;ren endothelialen Zellen), eine bekannte und eingesetzte Modellsystem zur in-vitro-Alterung, mit anderen, bereits etablierten Zellkultur-Protokolle. Die Z&uuml;chtung von Bedingungen hatte tats&auml;chlich einen starken Einfluss auf die Zellproliferation, Apoptose-Preise und die replicative Lebensdauer. Jedoch trotz dieser erheblichen Unterschiede fanden wir auch verschiedene robuste Marker, die alternde HUVEC definieren: morphologische Ver&auml;nderungen, verst&auml;rkt Altern-verbundene Beta-Galaktosidase F&auml;rbung, Verhaftung der Zellzyklus in der G1-Phase und gesenkten mitochondrischen Membrane potential und erh&ouml;hte oxidativ modifizierte Proteine wurden angezeigt, unabh&auml;ngig von der Zelle-Protokolle und k&ouml;nnte daher auch als Marker f&uuml;r die in-vivo-Alterung.

Kennung des Anbau-unabh&auml;ngige Marker f&uuml;r menschliche Endothelzellen Altern in-vitro.

According to the 'free radical theory of ageing', the generation and accumulation of reactive oxygen species are key events during ageing of biological systems. Mitochondria are a major source of ROS and prominent targets for ROS-induced damage. Whereas mitochondrial DNA and membranes were shown to be oxidatively modified with ageing, mitochondrial protein oxidation is not well understood. The purpose of this study was an unbiased investigation of age-related changes in mitochondrial proteins and the molecular pathways by which ROS-induced protein oxidation may disturb cellular homeostasis. In a differential comparison of mitochondrial proteins from young and senescent strains of the fungal ageing model Podospora anserina, from brains of young (5 months) vs. older rats (17 and 31 months), and human cells, with normal and chemically accelerated in vitro ageing, we found certain redundant posttranslationally modified isoforms of subunits of ATP synthase affected across all three species. These appear to represent general susceptible hot spot targets for oxidative chemical changes of proteins accumulating during ageing, and potentially initiating various age-related pathologies and processes. This type of modification is discussed using the example of SAM-dependent O-methyltransferase from P. anserina (PaMTH1), which surprisingly was found to be enriched in mitochondrial preparations of senescent cultures.

Differential proteomic profiling of mitochondria from Podospora anserina, rat and human reveals distinct patterns of age-related oxidative changes.

Nach der &quot;freie Radikale-Theorie des Alterns&quot;, die Generierung und Anh&auml;ufung von reaktiven Sauerstoff sind Arten wichtige Ereignisse w&auml;hrend der Alterung von biologischen Systemen. Mitochondrien sind eine wichtige Quelle von ROS und prominente Vorgaben f&uuml;r ROS-induzierten Sch&auml;den. Die mitochondriale DNA und Membranen oxidativ ver&auml;ndert werden, mit zunehmendem Alter verlieren gezeigt wurden, ist die mitochondriale Protein Oxydation nicht gut verstanden. Der Zweck dieser Studie war eine unvoreingenommene Untersuchung altersbedingter Ver&auml;nderungen der mitochondrialen Proteine und die molekularen Bahnen durch die Oxydation der ROS-induzierte Protein zellul&auml;re Hom&ouml;ostase st&ouml;ren kann. In einem differenziellen Vergleich der mitochondrialen Proteine aus jungen und alternde St&auml;mmen von pilzartige &Uuml;beralterung Modell Podospora Anserina, aus Gehirn junger (5 Monate) vs. &auml;ltere Ratten (17 und 31 Monate) und menschliche Zellen, mit normalen und chemisch beschleunigte in-vitro-Alterung fanden wir sicher, dass redundante posttranslational modifiziert Isoformen Untereinheiten des ATP-Synthase, die alle drei Arten betroffen. Diese erscheinen allgemein empf&auml;nglicher Hot-Spot-Ziele f&uuml;r oxidativen chemischen Ver&auml;nderungen von Proteinen, die Anh&auml;ufung w&auml;hrend der Alterung und potenziell initiieren verschiedene altersbedingte Krankheiten und Prozesse darstellen. Diese Art der &Auml;nderung wird erl&auml;utert am Beispiel der SAM-abh&auml;ngige O-Methyltransferase von p. Anserina (PaMTH1), die &uuml;berraschend war in mitochondriale Zubereitungen der alternde Kulturen bereichert werden.

Differenzielle Proteomic profiling von Mitochondrien aus Podospora Anserina, Ratte und Mensch zeigt unterschiedliche Muster von altersbedingten oxidative Ver&auml;nderungen.

The mitochondrial theory of aging predicts that functional alterations in mitochondria leading to reactive oxygen species (ROS) production contribute to the aging process in most if not all species. Using cellular senescence as a model for human aging, we have recently reported partial uncoupling of the respiratory chain in senescent human fibroblasts. In the present communication, we address a potential cause-effect relationship between impaired mitochondrial coupling and premature senescence. Chronic exposure of human fibroblasts to the chemical uncoupler carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) led to a temporary, reversible uncoupling of oxidative phosphorylation. FCCP inhibited cell proliferation in a dose-dependent manner, and a significant proportion of the cells entered premature senescence within 12 days. Unexpectedly, chronic exposure of cells to FCCP led to a significant increase in ROS production, and the inhibitory effect of FCCP on cell proliferation was eliminated by the antioxidant N-acetyl-cysteine. However, antioxidant treatment did not prevent premature senescence, suggesting that a reduction in the level of oxidative phosphorylation contributes to phenotypical changes characteristic of senescent human fibroblasts. To assess whether this mechanism might be conserved in evolution, the influence of mitochondrial uncoupling on replicative life span of yeast cells was also addressed. Similar to our findings in human fibroblasts, partial uncoupling of oxidative phsophorylation in yeast cells led to a substantial decrease in the mother-cell-specific life span and a concomitant incrase in ROS, indicating that life span shortening by mild mitochondrial uncoupling may represent a "public" mechanism of aging.

Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells.

Die mitochondriale Theorie des Alterns prognostiziert, dass funktionelle Ver&auml;nderungen in den Mitochondrien zu reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) f&uuml;hrt zu den Alterungsprozess in die meisten, wenn nicht alle Arten beitragen. Mit zellul&auml;ren Seneszenz als Modell f&uuml;r menschliche Altern, haben wir vor kurzem berichtet, teilweise Entkoppler der Atmungskette in alternde menschliche Fibroblasten. In der vorliegenden Mitteilung wenden wir uns eine m&ouml;gliche Ursache-Wirkung-Beziehung zwischen gest&ouml;rte mitochondriale Kupplung und vorzeitiges Altern. Chronischer Exposition von menschlichen Fibroblasten gegen&uuml;ber der chemischen Entkuppler Carbonylcyanide p-Trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) f&uuml;hrte zu eine tempor&auml;re, reversible Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung. FCCP gehemmt Zellproliferation in einer Dosis-abh&auml;ngigen Weise, und ein erheblicher Anteil der Zellen in vorzeitige Seneszenz innerhalb von 12 Tagen. Unerwartet, chronischer Exposition von Zellen zu FCCP f&uuml;hrte zu einem deutlichen Anstieg der ROS-Produktion und die hemmende Wirkung von FCCP auf Zellproliferation durch das Antioxidans N-Acetyl-Cystein gestrichen wurde. Antioxidative Behandlung verhinderte jedoch nicht vorzeitig altern, was darauf hindeutet, dass eine Senkung des Niveaus der oxidativen Phosphorylierung zu ph&auml;notypische Ver&auml;nderungen charakteristisch f&uuml;r alternde menschlichen Fibroblasten beitr&auml;gt. Um zu beurteilen, ob dieser Mechanismus in der Evolution konserviert werden k&ouml;nnte, ist auch der Einfluss der mitochondrialen Abkopplung auf replicative Lebensdauer von Hefezellen angesprochen worden. &Auml;hnlich wie unsere Erkenntnisse in menschlichen Fibroblasten, partielle Entkopplung der oxidativen Phsophorylation in Hefezellen f&uuml;hrte zu einen erheblichen R&uuml;ckgang der die Mutter-zellspezifische Lebensspanne und einer damit einhergehenden Incrase in ROS, kann angibt, die Verk&uuml;rzung der Lebensdauer durch milde mitochondrialer Entkoppler einen &quot;&ouml;ffentlichen&quot; Mechanismus des Alterns vertreten.

Partielle Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung induziert vorzeitiges Altern in menschlichen Fibroblasten und Mutter Hefezellen.

Mesenchymal stem cells (MSC) are capable of differentiating into bone, fat, cartilage, tendon and other organ progenitor cells. Despite the abundance of MSC within the organism, little is known about their in vivo properties or about their corresponding in vivo niches. We therefore isolated MSC from spongy (cancellous) bone biopsies of healthy adults. When compared with the surrounding marrow, a fourfold higher number of colony-forming units was found within the tight meshwork of trabecular bone surface. At these sites, oxygen concentrations range from 1% to 7%. In MSC cultured at oxygen as low as 3%, rates for cell death and hypoxia-induced gene transcription remained unchanged, while in vitro proliferative lifespan was significantly increased, with about 10 additional population doublings before reaching terminal growth arrest. However, differentiation capacity into adipogenic progeny was diminished and no osteogenic differentiation was detectable at 3% oxygen. In turn, MSC that had previously been cultured at 3% oxygen could subsequently be stimulated to successfully differentiate at 20% oxygen. These data support our preliminary finding that primary MSC are enriched at the surface of spongy bone. Low oxygen levels in this location provide a milieu that extends cellular lifespan and furthermore is instructive for the stemness of MSC allowing proliferation upon stimulation while suppressing differentiation.

Reduced oxygen tension attenuates differentiation capacity of human mesenchymal stem cells and prolongs their lifespan.

Mesenchymaler Stammzellen (MSC) sind in der Lage, in Knochen, Fett, Knorpel, Sehnen und andere Orgel-Vorl&auml;uferzellen zu unterscheiden. Trotz der F&uuml;lle von MSC innerhalb des Organismus ist wenig &uuml;ber ihre in-vivo-Eigenschaften oder ihre entsprechenden in-vivo-Nischen bekannt. Wir daher isoliert MSC aus schwammig (Spongiosa) Biopsien von gesunden Erwachsenen. Im Vergleich zu den umliegenden Knochenmark, eine vierfache h&ouml;here Anzahl von Kolonienbildende Einheiten innerhalb der engen Geflecht der trabekul&auml;ren Knochenoberfl&auml;che gefunden wurde. An diesen Standorten, Sauerstoff-Konzentrationen reichen von 1 % bis 7 %. Im MSC kultiviert an Sauerstoff so niedrig wie 3 % unver&auml;ndert Preise f&uuml;r Zelltod und Hypoxie-induzierten gen-Transkription, w&auml;hrend in-vitro-proliferative Lebensdauer deutlich erh&ouml;ht wurde, mit ca. 10 zus&auml;tzliche Bev&ouml;lkerung Verdoppelungen vor terminal Wachstumanhalten erreichen. Allerdings Differenzierung F&auml;higkeit in Adipogenic Nachkommenschaft gemindert wurde und keine osteogenen Differenzierung war nachweisbar bei 3 % Sauerstoff. Wiederum konnte MSC, die zuvor bei 3 % Sauerstoff kultiviert wurde, hatte anschlie&szlig;end stimuliert werden, um erfolgreich bei 20 % Sauerstoff zu unterscheiden. Diese Daten unterst&uuml;tzen unsere vorl&auml;ufige Feststellung, dass prim&auml;re MSC werden an der Oberfl&auml;che des schwammigen Knochen angereichert. Niedrigen Sauerstoffgehalt in dieser Lage sorgt ein Milieu, das zellul&auml;re Lebensdauer erweitert und au&szlig;erdem ist aufschlussreich f&uuml;r die Stemness des MSC erlaubt Verbreitung auf Anregung w&auml;hrend unterdr&uuml;ckt Differenzierung.

Reduzierte Sauerstoff Spannung d&auml;mpft Differenzierung Kapazit&auml;t menschlicher mesenchymaler Stammzellen und ihre Lebensdauer verl&auml;ngert.

Cellular senescence is now recognized as an important mechanism of tumor suppression, and the accumulation of senescent cells may contribute to the aging of various human tissues. Alterations of the cellular energy metabolism are considered key events in tumorigenesis and are also known to play an important role for aging processes in lower eukaryotic model systems. In this study, we addressed senescence-associated changes in the energy metabolism of human endothelial cells, using the HUVEC model of in vitro senescence. We observed a drastic reduction in cellular ATP levels in senescent endothelial cells. Although consumption of glucose and production of lactate significantly increased in senescent cells, no correlation was found between both metabolite conversion rates, neither in young endothelial cells nor in the senescent cells, which indicates that glycolysis is not the main energy source in HUVEC. On the other hand, glutamine consumption was increased in senescent HUVEC and inhibition of glutaminolysis by DON, a specific inhibitor of glutaminase, led to a significant reduction in the proliferative capacity of both early passage and late passage cells. Moreover, inhibition of glutaminase activity induced a senescent-like phenotype in young HUVEC within two passages. Together, the data indicate that glutaminolysis is an important energy source in endothelial cells and that alterations in this pathway play a role in endothelial cell senescence.

Premature senescence of human endothelial cells induced by inhibition of glutaminase.

Zellul&auml;ren Seneszenz wird jetzt als ein wichtiger Mechanismus der Unterdr&uuml;ckung der Tumor erkannt, und die Ansammlung der alternde Zellen kann dazu beitragen, die Alterung der verschiedenen menschlichen Geweben. Ver&auml;nderungen des zellul&auml;ren Energiestoffwechsels gelten als wichtige Ereignisse in der Tumorentstehung und bekannterma&szlig;en auch eine wichtige Rolle f&uuml;r Alterungsprozesse im unteren eukaryotischen Modellsystemen. In dieser Studie behandelt wir altern-assoziierte Ver&auml;nderungen in den Energiestoffwechsel der menschlichen Endothelzellen, mit dem HUVEC-Modell von in-vitro-Altern. Wir beobachteten eine drastische Reduktion der zellul&auml;ren ATP-Konzentrationen in alternde Endothelzellen. Obwohl der Verbrauch von Glukose und Produktion von Laktat in alternde Zellen deutlich erh&ouml;ht, wurde keine Korrelation zwischen beiden Metabolit Conversion-raten, weder junge Endothelzellen noch die alternde Zellen, das angibt, dass die Glykolyse ist nicht die wichtigste Energiequelle in HUVEC gefunden. Auf der anderen Seite, Glutamin Verbrauch stieg in alternde HUVEC und Hemmung der Glutaminolyse von DON, einen spezifischen Inhibitor der Glutaminase, f&uuml;hrte zu einer erheblichen Verringerung der proliferativen Kapazit&auml;t der fr&uuml;hen Durchgang und sp&auml;ten Durchgang Zellen. Dar&uuml;ber hinaus induzierte Hemmung der Glutaminase Aktivit&auml;t einen alternde-&auml;hnlichen Ph&auml;notyp in jungen HUVEC innerhalb zwei Passagen. Zusammen, zeigen die Daten dieser Glutaminolyse ist eine wichtige Energiequelle in Endothelzellen und dass Ver&auml;nderungen in diesem Weg spielen eine Rolle bei endothelial Zellen Altern.

Vorzeitige Alterung des menschlichen Endothelzellen induziert durch Hemmung der Glutaminase.

From experiments with lower eukaryotes it is known that the metabolic rate and also the rate of aging are tightly controlled by the insulin-like growth factor (IGF)/insulin signal transduction pathway. The mitochondrial theory of aging implies that an increased metabolic rate leads to increased mitochondrial activity; increased production of reactive oxygen species due to these alterations would speed up the aging process. To address the question if mitochondrial activity is influenced by insulin/IGF signaling, we have established an experimental system to determine the influence of IGF-I-dependent signaling on mitochondrial function. We used DU145 prostate cancer cells, known for the intact IGF signal transduction pathway, to address the influence of IGF receptor activation on mitochondrial function by high-resolution respirometry. These experiments revealed that indeed mitochondrial function is regulated by IGF signaling, and up-regulation of respiration seems to require phosphoinositide 3-kinase/AKT signaling, but is independent of IGF effects on cell cycle progression. Collectively these data establish a regulatory cross-talk between insulin/IGF signal transduction and mitochondrial function, two major pathways implicated in controlling the rate of aging.

Insulin-like growth factor-induced signals activate mitochondrial respiration.

Aus Experimenten mit niedrigeren Eukaryoten ist bekannt, dass die metabolische Rate und auch die Rate des Alterns von der Insulin-Like Growth Factor (IGF) streng kontrolliert werden / Insulin signal Transduktion Weg. Die mitochondriale Theorie des Alterns impliziert, dass eine erh&ouml;hte Stoffwechselrate zu erh&ouml;hte mitochondriale Aktivit&auml;t f&uuml;hrt; erh&ouml;hte Produktion von reaktive Sauerstoffspezies durch diese Ver&auml;nderungen w&uuml;rde den Alterungsprozess beschleunigen. Um die Frage zu l&ouml;sen wenn Insulin/IGF Signalisierung mitochondriale Aktivit&auml;t beeinflusst ist, haben wir ein Experimentalsystem um zu bestimmen, den Einfluss von IGF-abh&auml;ngigen Signalisierung auf die mitochondriale Funktion etabliert. Wir haben DU145 Prostatakrebszellen, bekannt f&uuml;r die intakt IGF-Signal-Transduktion Pathway, um den Einfluss von IGF-Rezeptor-Aktivierung auf mitochondriale Funktion durch hochaufl&ouml;sende Respirationstest zu adressieren. Diese Experimente ergaben, dass tats&auml;chlich mitochondriale Funktion wird durch IGF signalisieren, und oben-Regulierung der Atmung Phosphoinositide 3-Kinase/AKT Signalisierung erforderlich scheint, sondern ist unabh&auml;ngig von IGF-Auswirkungen auf die Zellzyklusprogression. Gemeinsam schaffen diese Daten eine regulatorische Nebensprechen zwischen Insulin/IGF-Signaltransduktion und mitochondriale Funktion, zwei wichtige Wege, die Kontrolle des Alterns in Verbindung gebracht.

Insulin-wie Wachstum Faktor-induzierten Signale aktivieren mitochondriale Atmung.

Cellular senescence is known as a potent mechanism of tumor suppression, and cellular senescence in vitro also reflects at least some features of aging in vivo. The Free Radical Theory of aging suggests that reactive oxygen species are important causative agents of aging and cellular senescence. Besides damage of nucleic acids and lipids, also oxidative modifications of proteins have been described as potential causative events in the senescence response. However, the identity of protein targets for post-translational modifications in senescent cells has remained unclear. In the present communication, we analyzed the occurrence of oxidative posttranslational modifications in senescent human endothelial cells and dermal fibroblasts. We found a significant increase in the level of protein carbonyls and AGE modification with senescence in both cell types. Using 2D-Gel electrophoresis and Western Blot we found that heat shock cognate protein 70 is a bona fide target for AGE modification in human fibroblasts.

Identification of Hsc70 as target for AGE modification in senescent human fibroblasts.

Zellul&auml;ren Seneszenz ist bekannt als potenter Mechanismus der Tumor Unterdr&uuml;ckung und in-vitro-zellul&auml;ren Seneszenz spiegelt auch zumindest einige Merkmale des Alterns in-vivo. Die freie Radikale-Theorie des Alterns legt nahe, dass reaktive Sauerstoffspezies wichtige Erreger von Alterungs- und zellul&auml;ren Seneszenz sind. Neben Schaden von Nukleins&auml;uren und Lipiden wurden auch oxidative Modifikationen von Proteinen als m&ouml;gliche urs&auml;chliche Ereignisse in der Seneszenz Antwort beschrieben. Die Identit&auml;t des Protein-Ziele f&uuml;r &Uuml;bersetzungs&auml;nderungen in alternde Zellen blieb jedoch unklar. In der vorliegenden Mitteilung analysierten wir das Eintreten des oxidativen posttranslationale Modifikationen der alternde menschliche Endothelzellen und dermalen Fibroblasten. Wir fanden eine deutliche Steigerung des Niveaus der Protein CARBONYLE und Alter &Auml;nderung mit Altern in beiden Zelltypen. Mit 2D Gelelektrophorese und Western Blot fanden wir, dass Hitze Schock cognate Protein 70 ein gutgl&auml;ubiger Ziel f&uuml;r Alter &Auml;nderung in menschlichen Fibroblasten ist.

Kennung des Hsc70 als Ziel f&uuml;r Alter &Auml;nderung in alternde menschliche Fibroblasten.

The free radical theory of aging proposes that ROS (reactive oxygen species) are major driving forces of aging, and are also critically involved in cellular senescence. Besides the mitochondrial respiratory chain, alternative sources of ROS have been described that might contribute to cellular senescence. Noxs (NADPH oxidases) are well-known sources of superoxide, which contribute to the antimicrobial capabilities of macrophages, a process involving the prototypical member of the family referred to as Nox2. However, in recent years non-phagocytic homologues of Nox2 have been identified that are involved in processes other than the host defence. Superoxide anions produced by these enzymes are believed to play a major role in signalling by MAPKs (mitogen-activated protein kinases) and stress-activated kinases, but could also contribute to cellular senescence, which is known to involve oxygen radicals. In HUVECs (human umbilical vein endothelial cells), Nox4 is predominantly expressed, but its role in replicative senescence of HUVECs remains to be elucidated. Using shRNA (small-hairpin RNA)-mediated knockdown of Nox4, implicating lentiviral vectors, we addressed the question of whether lifelong depletion of Nox4 in HUVECs would influence the senescent phenotype. We found a significant extension of the replicative lifespan of HUVECs upon knockdown of Nox4. Surprisingly, mean telomere length was significantly reduced in Nox4-depleted cells. Nox4 depletion had no discernable influence on the activity of MAPKs and stress-activated kinases, but reduced the degree of oxidative DNA damage. These results suggest that Nox4 activity increases oxidative damage in HUVECs, leading to loss of replicative potential, which is at least partly independent of telomere attrition.

The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells.

Die freie Radikale-Theorie des Alterns wird vorgeschlagen, dass ROS (reaktive Sauerstoffspezies) wichtige sind Triebkr&auml;fte des Alterns und engagieren sich auch kritisch in der zellul&auml;ren Seneszenz. Neben die Mitochondriale Atmungskette, alternative Energiequellen ROS wurden beschrieben k&ouml;nnte, die zur zellul&auml;ren Seneszenz beitragen. NOXS (NADPH Oxidases) sind bekannte Quellen von Superoxid, die auf die antimikrobiellen Funktionen der Makrophagen, ein Prozess, der das prototypische Mitglied der Familie genannt Nox2 beitragen. Jedoch wurden in den letzten Jahren nicht phagozytische Homologen des Nox2 identifiziert, die in Prozessen als Host Verteidigung beteiligt sind. Superoxid-Anionen, die durch diese Enzyme produziert werden geglaubt, um eine wichtige Rolle in der Signalisierung von MAPKs (Mitogen-aktivierte Proteinkinasen) und Spannung aktivierte Kinasen, sondern k&ouml;nnte auch dazu beitragen, zellul&auml;ren Seneszenz, die bekannt ist, Sauerstoff-Radikale zu beteiligen. In HUVECs (menschliche Nabelschnur Venen Endothelzellen) Nox4 wird &uuml;berwiegend ausgedr&uuml;ckt, aber seine Rolle bei der Zellalterung von HUVECs muss noch gekl&auml;rt werden. Mit ShRNA (klein-Haarnadel RNA)-vermittelte Niederschlag von Nox4, zielbewu&szlig;t Lentivirale Vektoren, wir behandelt die Frage, ob lebenslanges Ersch&ouml;pfung der Nox4 in HUVECs der alternde Ph&auml;notyp beeinflussen w&uuml;rde. Wir fanden eine erhebliche Ausweitung der replicative Lebensdauer von HUVECs nach Niederschlag von Nox4. &Uuml;berraschenderweise war mittlere Telomer-L&auml;nge in Nox4-abgereichertem Zellen deutlich reduziert. Nox4 Ersch&ouml;pfung hatte keinen erkennbaren Einfluss auf die Aktivit&auml;t von MAPKs und Druck aktivierte Kinasen, sondern reduziert den Grad der oxidativen DNA-Sch&auml;den. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Nox4 Aktivit&auml;t oxidativen Sch&auml;den in HUVECs steigert, f&uuml;hrt zum Verlust des replicative Potentials, die zumindest teilweise unabh&auml;ngigen Telomer Zerm&uuml;rbungskrieg.

Article	Year
Replicative senescence of human fibroblasts: the role of Ras-dependent signaling and oxidative stress. Experimental gerontology\| PubMed ID: 12470828	2002
Senescence-associated cell death of human endothelial cells: the role of oxidative stress. Experimental gerontology\| PubMed ID: 14580868	2003
Identification of cultivation-independent markers of human endothelial cell senescence in vitro. Biogerontology\| PubMed ID: 17377850	2007
Differential proteomic profiling of mitochondria from Podospora anserina, rat and human reveals distinct patterns of age-related oxidative changes. Experimental gerontology\| PubMed ID: 17689904	2007
Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells. Free radical biology & medicine\| PubMed ID: 17697939	2007
Reduced oxygen tension attenuates differentiation capacity of human mesenchymal stem cells and prolongs their lifespan. Aging cell\| PubMed ID: 17925003	2007
Premature senescence of human endothelial cells induced by inhibition of glutaminase. Biogerontology\| PubMed ID: 18317946	2008
Insulin-like growth factor-induced signals activate mitochondrial respiration. Biotechnology journal\| PubMed ID: 18383021	2008
Identification of Hsc70 as target for AGE modification in senescent human fibroblasts. Biogerontology\| PubMed ID: 19009367	2009
The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. The Biochemical journal\| PubMed ID: 19681754	2009

Hermann Unterluggauer

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