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Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

In the past fifteen years the notion that cell membranes are not homogenous and rely on microdomains to exert their functions has become widely accepted. ...

The novel, functionalized heteropolymolybdate [(O(2)CCH(2)PO(3))(2)Mo(5)O(15)](6-) (1) has been synthesized and characterized by IR and (31)P NMR spectroscopy and elemental analysis. Single-crystal X-ray analysis was carried out on Rb(4)KNa[(O(2)CCH(2)PO(3))(2)Mo(5)O(15)].H(2)O, which crystallizes in the monoclinic system, space group P2(1)/n, with a = 10.146(2) A, b = 13.704(3) A, c = 20.577(4) A, beta = 94.88(3) degrees, and Z = 4. The title polyanion consists of a ring of five MoO(6) octahedra with four edge junctions and one corner junction. This nonplanar arrangement is stabilized by two phosphonocarboxylate groups that are bound via their phosphonate functionalities on opposite sides of the ring. As a result the two dangling arms with their terminal carboxylate groups protrude away from the molybdenum-oxo framework in diametrically opposed directions. The solid-state structure of 1 is preserved in solution on the basis of NMR. We also report on the synthesis and characterization of the isostructural derivative [(O(2)CC(2)H(4)PO(3))(2)Mo(5)O(15)](6-) (2).

Polyoxomolybdates functionalized with phosphonocarboxylates.

Polyoxomolybdaten mit Phosphonocarboxylate funktionalisiert.

Monoiodinated, Met35-oxidized muscarinic toxin 7 (MT7ox) was synthesized, and its affinity constants for free or N-methyl scopolamine (NMS)-occupied hM1 receptor were measured directly by equilibrium and kinetic binding experiments. Identical values were obtained with the two types of assay methods, 14 pM and 0.9 nM in free or NMS-liganded receptor states, respectively, highlighting a strong negative cooperativity between this allosteric toxin and NMS. Identical results were obtained with indirect binding experiments with [3H]NMS using the ternary complex model, clearly demonstrating the reciprocal nature of this cooperativity. Furthermore, the effects of various orthosteric and allosteric agents on the dissociation kinetic of 125I-MT7ox were measured and show that, except for the MT1 toxin, all of the ligands studied [NMS, atropine, gallamine, brucine, tacrine, staurosporine, and (9S,10S,12R)-2,3,9,10,11-hexahydro-10-hydroxy-9-methyl-1-oxo-9,12-epoxy-1H-diindolo[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]pyrrolo[3,4-i][1,6]benzodiazocine-10-carboxylic acid hexyl ester (KT5720)] interact allosterically with muscarinic toxin 7. Equilibrium binding experiments with 125I-MT7ox and [3H]NMS were conducted to reveal the effects of these ligands on the free receptor, and affinity constants (pKx values) were calculated using the allosteric ternary complex model. Our results suggest that MT7 toxin interacts with hM1 receptor at a specific allosteric site, which may partially overlap those identified previously for "classic" or "atypical" allosteric agents and highlight the potential of this new allosteric tracer in studying allosterism at muscarinic receptors.

Identification of various allosteric interaction sites on M1 muscarinic receptor using 125I-Met35-oxidized muscarinic toxin 7.

Monoiodinated, Met35-oxidiert Muskarinischer Toxin 7 (MT7ox) wurde synthetisiert, und deren Affinit&auml;t-Konstanten f&uuml;r freie oder N-Methyl-Scopolamin (NMS)-besetzten hM1-Rezeptor direkt von Gleichgewicht und kinetische Bindung Experimenten gemessen wurden. Identische Werte wurden erzielt mit den zwei Arten von Testverfahren, 14 Uhr und 0,9 nM im Freien oder NMS-liganded Rezeptor Staaten bzw. Hervorhebung einer starken negativen Kooperativit&auml;t zwischen diese allosterischer Toxin und NMS. Identische Ergebnisse wurden mit indirekten Bindung Experimente mit [3H] NMS anhand des tern&auml;ren komplexes klar demonstriert die wechselseitige Natur dieser Kooperativit&auml;t erzielt. Dar&uuml;ber hinaus die Auswirkungen der verschiedenen Orthosteric und allosterische Agenten auf der kinetischen Dissoziation der 125I-MT7ox wurden gemessen und zeigen, dass, mit Ausnahme der MT1-Toxin, alle die Liganden studierte [NMS, Atropin, Gallamine, Brucin, Tacrine, Staurosporine und (9S,10S,12R)-2,3,9,10,11-hexahydro-10-hydroxy-9-methyl-1-oxo-9,12-epoxy-1H-diindolo[1,2,3-fg:3&#39;,2&#39;,1&#39;-kl]pyrrolo[3,4-i][1,6]benzodiazocine-10-carboxylic S&auml;ure Hexyl Ester (KT5720)] mit Muskarinischer Toxin 7 phosphorylierter interagieren. Gleichgewicht Bindung Experimente mit 125I-MT7ox und [3H] NMS wurden durchgef&uuml;hrt, um die Auswirkungen dieser Liganden auf den freien Rezeptor zu offenbaren, und Affinit&auml;t Konstanten (pKx Werte) wurden mit das allosterische tern&auml;re komplexe Modell berechnet. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass dieses Toxin MT7 mit hM1-Rezeptor an einem bestimmten allosterischer Standort interagiert, die teilweise &uuml;berschneiden sich die &quot;klassischen&quot; oder &quot;atypischen&quot; allosterischer Agenten zuvor identifiziert und markieren Sie das Potenzial dieser neuen allosterischer Tracer Allosterism an muskarinische Rezeptoren zu studieren k&ouml;nnen.

Identifizierung der verschiedenen allosterischer Interaktion Seiten muskarinische M1-Rezeptor mit 125I-Met35-oxidiert Muskarinischer Toxin 7.

Three-finger-fold toxins, isolated from various snake venoms, are recognized by high affinity and various specificities by different nicotinic and muscarinic acetylcholine receptors (nAChRs and mAChRs, respectively) present in peripheral, as well as central, nervous systems (Karlsson et al., 2000; Servent and MÃ©nez, 2001; Nirthanan and Gwee, 2004). The goal of our studies is (1) to identify, at the molecular level, the functional determinants involved in the various interaction profiles of nicotinic or muscarinic toxins on their respective receptors subtypes, (2) to model some of these toxin-receptor complexes using distance constraints obtained from cycle-mutant experiments, and (3) to understand how a unique scaffold (the three-finger fold) is able to support these different functional profiles and how molecular determinants have been selected during the evolution process to create these different specific properties. Finally, these structure/function analyses should be exploited to engineer non-natural peptides with new binding and functional properties useful as pharmacological tools or therapeutic agents.

How three-finger-fold toxins interact with various cholinergic receptors.

Drei-Finger-Fold-Toxine, die von verschiedenen Schlange Venena, isoliert werden durch hohe Affinit&auml;t und verschiedenen Besonderheiten von verschiedenen nikotinische und muskarinische Acetylcholin-Rezeptoren erkannt (nAChRs und mAChRs, beziehungsweise) im peripheren als auch zentral, Nervensystem (Karlsson Et Al., 2000; Servent und M&eacute;nez, 2001; Nirthanan und Gwee, 2004). Das Ziel unserer Studien ist (1), erkennen einige dieser Toxin-Rezeptor-Komplexe mit Entfernungsbeschr&auml;nkungen vom Zyklus-Mutant-Experimente, sowie (3) zu verstehen, wie eine einzigartige Ger&uuml;st (die drei-Finger-Klappe) diese verschiedenen funktionalen Profile unterst&uuml;tzen kann und wie Molekulare Determinanten w&auml;hrend des Entwicklung Prozesses ausgew&auml;hlt wurden, um diese zu erstellen, auf molekularer Ebene, die funktionalen Determinanten, die Beteiligten in den verschiedenen Interaktion-Profilen der nikotinische oder muskarinische Toxine auf ihre jeweiligen Rezeptoren Subtypen, (2) Modell verschiedene spezifische Eigenschaften. Schlie&szlig;lich sollte diese Struktur/Funktions-Analysen genutzt werden, um nicht-nat&uuml;rliche Peptide mit neuen Bindung und funktionellen Eigenschaften n&uuml;tzlich als pharmakologische Werkzeuge oder Therapeutika Ingenieur.

Wie drei-Finger-Fold Toxine mit verschiedenen cholinerge Rezeptoren interagieren.

Muscarinic MT7 toxin is a highly selective and potent antagonist of the M(1) subtype of muscarinic receptor and acts by binding to an allosteric site. To identify the molecular determinants by which MT7 toxin interacts with this receptor in its free and NMS-occupied states, the effect on toxin potency of alanine substitution was evaluated in equilibrium and kinetic binding experiments as well as in functional assays. The determination of the crystallographic structure of an MT7-derivative (MT7-diiodoTyr51) allowed the selection of candidate residues that are accessible and present on both faces of the three toxin loops. The equilibrium binding data are consistent with negative cooperativity between N-methylscopolamine (NMS) and wild-type or modified MT7 and highlight the critical role of the tip of the central loop of the toxin (Arg34, Met35 Tyr36) in its interaction with the unoccupied receptor. Examination of the potency of wild-type and modified toxins to allosterically decrease the dissociation rate of [(3)H]NMS allowed the identification of the MT7 residues involved in its interaction with the NMS-occupied receptor. In contrast to the results with the unoccupied receptor, the most important residue for this interaction was Tyr36 in loop II, assisted by Trp10 in loop I and Arg52 in loop III. The critical role of the tips of the MT7 loops was also confirmed in functional experiments. The high specificity of the MT7-M(1) receptor interaction exploits several MT7-specific residues and reveals a different mode of interaction of the toxin with the free and NMS-occupied states of the receptor.

Different interactions between MT7 toxin and the human muscarinic M1 receptor in its free and N-methylscopolamine-occupied states.

Muskarinische MT7 Toxin ist ein hoch selektive und potenter Antagonist des Subtyps Zusammenlegung des Muskarinischer-Rezeptors und wirkt durch Bindung an ein allosterischer Website. Um die molekularen Determinanten identifizieren, durch welche, die mt7 Toxin mit diesem Rezeptor in seiner freien und NMS besetzten Staaten interagiert, war die Wirkung auf Toxin Potenz der Alanin-Substitution im Gleichgewicht und kinetische Bindung Experimente ebenso wie funktionale Assays ausgewertet. Die Bestimmung der kristallographische Struktur ein MT7-Derivat (MT7-diiodoTyr51) erlaubt die Auswahl der Kandidaten R&uuml;ckst&auml;nde, die zug&auml;nglich und auf beiden Seiten der drei Toxin Schleifen vorhanden sind. Die Gleichgewicht-Bindung Daten stehen im Einklang mit negativer Kooperativit&auml;t zwischen N-Methylscopolamine (NMS) und Wildtyp oder ge&auml;nderte MT7 und H&ouml;hepunkt die entscheidende Rolle der Spitze der zentrale Schleife des Toxins (Arg34, Met35 Tyr36) in der Interaktion mit den unbesetzten-Rezeptor. Pr&uuml;fung der Potenz der Wildtyp und modifizierte Toxine phosphorylierter verringern die Dissoziation-Rate von [(3) H] NMS erlaubt die Identifizierung der MT7 R&uuml;ckst&auml;nde in ihrer Interaktion mit den NMS besetzte Rezeptor beteiligt. Im Gegensatz zu den Ergebnissen mit den unbesetzten-Rezeptor, der wichtigste R&uuml;ckstand f&uuml;r diese Interaktion war Tyr36 in Schleife II, unterst&uuml;tzt von Trp10 in Schleife ich und Arg52 in Schleife III. Funktionelle Experimente best&auml;tigte auch die entscheidende Rolle der Tipps der MT7 Schleifen. Die hohe Spezifit&auml;t der MT7-M(1)-Rezeptor-Interaktion nutzt mehrere MT7-spezifische R&uuml;ckst&auml;nde und offenbart einen anderen Modus der Interaktion des Toxins mit dem kostenlosen und NMS besetzten Staaten des Rezeptors.

Verschiedene Interaktionen zwischen MT7 Toxin und der menschlichen muskarinische M1-Rezeptor in seinem freien N-Methylscopolamine besetzten Staaten.

Die Idee, dass GPCR (G-Protein-gekoppelter Rezeptoren) als Homo oder Hetero-Oligomere vorhanden ist, obwohl noch umstritten ist, ist inzwischen weithin anerkannt. Dennoch die Funktionsrollen Oligomerisierung sind noch unklar und gr&ouml;&szlig;eren Einblick in die Mechanismen zugrunde liegt die Dynamik von GPCR-Versammlung und, insbesondere Beurteilung der Auswirkungen von Liganden bei diesem Prozess scheint wichtig. Wir w&auml;hlten unsere vorliegenden Studie &uuml;ber die Auswirkungen der MT7 zu konzentrieren (muskarinische Toxin 7), eine hochselektive allosterischer Peptid-Ligand auf Oligomerisierung Bundesland der hM1 (menschliche M1 muskarinische Acetylcholin-Rezeptor-Subtyp).

Einfluss der MT7 Toxin auf den Oligomerisierung von den muskarinische M1-Rezeptor.

The idea that GPCRs (G-protein-coupled receptors) may exist as homo- or hetero-oligomers, although still controversial, is now widely accepted. Nevertheless, the functional roles of oligomerization are still unclear and gaining greater insight into the mechanisms underlying the dynamics of GPCR assembly and, in particular, assessing the effect of ligands on this process seems important. We chose to focus our present study on the effect of MT7 (muscarinic toxin 7), a highly selective allosteric peptide ligand, on the oligomerization state of the hM1 (human M1 muscarinic acetylcholine receptor subtype).

Influence of MT7 toxin on the oligomerization state of the M1 muscarinic receptor.

An increasing number of results implicating cholesterol metabolism in the pathophysiology of Alzheimer's disease (AD) suggest cholesterol as a target for treatment. Research in genetics, pathology, epidemiology, biochemistry, and cell biology, as well as in animal models, suggests that cholesterol, its transporter in the brain, apolipoprotein E, amyloid precursor protein, and amyloid-beta all interact in AD pathogenesis. Surprisingly, key questions remain unanswered due to the lack of sensitive and specific methods for assessing cholesterol levels in the brain at subcellular resolution. The aims of this review are not only to discuss the various methods for measuring cholesterol and its metabolites and to catalog results obtained from AD patients but also to discuss some new data linking high plasma membrane cholesterol with modifications of the endocytic compartments. These studies are particularly relevant to AD pathology, since enlarged endosomes are believed to be the first morphological change observed in AD brains, in both sporadic cases and Down syndrome.

Cholesterol changes in Alzheimer's disease: methods of analysis and impact on the formation of enlarged endosomes.

Eine wachsende Zahl von Ergebnisse Nicht&uuml;bernahme Cholesterin-Stoffwechsel in der Pathophysiologie der Alzheimer-Krankheit (AD) schlagen Cholesterin als Ziel f&uuml;r die Behandlung. Forschung in der Genetik, Pathologie, Epidemiologie, Biochemie und Zellbiologie sowie in Tiermodellen, legt nahe, dass Cholesterin, seine Transporter im Gehirn, Apolipoprotein E, Amyloid-Vorl&auml;uferprotein, und Amyloid-Beta, die alle in AD-Pathogenese zu interagieren. &Uuml;berraschend, bleiben wichtige Fragen unbeantwortet aufgrund des Fehlens von sensitiven und spezifischen Methoden zur Beurteilung der Cholesterinspiegel im Gehirn bei subzellulare Aufl&ouml;sung. Die Ziele dieser &Uuml;berpr&uuml;fung sind nicht nur die verschiedenen Methoden zur Messung von Cholesterin und seine Metaboliten und Katalog-Ergebnisse aus AD-Patienten zu diskutieren, sondern auch einige neue Datenverkn&uuml;pfung hohe Plasmamembran Cholesterin mit Modifikationen der endocytic Abteilungen zu diskutieren. Diese Studien sind f&uuml;r AD-Pathologie, besonders relevant, da erweiterte Endosomen geglaubt werden, um die erste morphologische &Auml;nderung im AD Gehirne in sporadischen F&auml;llen und Down-Syndrom beobachtet werden.

Cholesterin-Ver&auml;nderungen bei Alzheimer-Krankheit: Methoden der Analyse und Auswirkungen auf die Bildung von erweiterten Endosomen.

Several lines of evidence support a strong relationship between cholesterol and Alzheimer's disease pathogenesis. Membrane cholesterol is known to modulate amyloid precursor protein (APP) endocytosis and amyloid-beta (Abeta) secretion. Here we show in a human cell line model of endocytosis (HEK293 cells) that cholesterol exerts these effects in a dose-dependent and linear manner, over a wide range of concentrations (-40% to +40% variations of plasma membrane cholesterol induced by methyl-beta-cyclodextrin (MBCD) and MBCD-cholesterol complex respectively). We found that the gradual effect of cholesterol is inhibited by small interference RNA-mediated downregulation of clathrin. Modulation of clathrin-mediated APP endocytosis by cholesterol was further demonstrated using mutants of proteins involved in the formation of early endosomes (dynamin2, Eps15 and Rab5). Importantly we show that membrane proteins other than APP are not affected by cholesterol to the same extent. Indeed clathrin-dependent endocytosis of transferrin and cannabinoid1 receptors as well as internalization of surface proteins labelled with a biotin derivative (sulfo-NHS-SS-biotin) were not sensitive to variations of plasma membrane cholesterol from -40% to 40%. In conclusion clathrin-dependent APP endocytosis appears to be very sensitive to the levels of membrane cholesterol. These results suggest that cholesterol increase in AD could be responsible for the enhanced internalization of clathrin-, dynamin2-, Eps15- and Rab5-dependent endocytosis of APP and the ensuing overproduction of Abeta.

Clathrin-dependent APP endocytosis and Abeta secretion are highly sensitive to the level of plasma membrane cholesterol.

Mehrere Zeilen Beweise unterst&uuml;tzen eine starke Beziehung zwischen Cholesterin und Pathogenese der Alzheimer-Krankheit. Membran-Cholesterin ist bekannt, dass Amyloid-Vorl&auml;ufer-Protein (APP)-Endozytose und Amyloid-Beta (Abeta) Sekretion zu modulieren. Hier zeigen wir in einer menschlichen Zelle-Line-Modell der Endozytose (HEK293 Zellen), dass Cholesterin diese Effekte eine dosisabh&auml;ngige und lineare Weise, &uuml;ber einer breiten Strecke der Konzentrationen &uuml;bt (-40 % bis + 40 % Variationen der Plasmamembran Cholesterin induziert durch Methyl-Beta-Cyclodextrin (MBCD) und MBCD-Cholesterin-Komplex bzw.). Wir fanden, dass die allm&auml;hliche Einwirkung von Cholesterin durch kleiner Eingriff RNA-vermittelte Heraufregulation des Clathrin gehemmt wird. Modulation der Clathrin-vermittelte APP Endozytose von Cholesterin war zeigte ein weiteres Mal mit Mutanten-Proteine bei der Bildung der fr&uuml;hen Endosomen (dynamin2, Eps15 und Rab5). Vor allem zeigen wir, dass die Membranproteine als APP nicht von Cholesterin in gleichem Ma&szlig;e betroffen sind. In der Tat Clathrin-abh&auml;ngige Endozytose von Transferrin und cannabinoid1-Rezeptoren sowie Internalisierung der Oberfl&auml;che Proteine, gekennzeichnet mit einem Biotin-Derivat (Sulfo-NHS-SS-Biotin) waren nicht empfindlich auf Ver&auml;nderungen der Plasmamembran Cholesterin von-40 % auf 40 %. Abschlie&szlig;end erscheint Clathrin-abh&auml;ngige APP Endozytose sehr empfindlich auf die Ebenen der Membran Cholesterin. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Cholesterin-Anstieg AD f&uuml;r die verbesserte Internalisierung der Clathrin, dynamin2, Eps15 und Rab5-abh&auml;ngige Endozytose App und die anschlie&szlig;ende &Uuml;berproduktion von Abeta verantwortlich sein k&ouml;nnte.

Clathrin-abh&auml;ngige APP Endozytose und Abeta-Sekretion sind sehr empfindlich auf das Niveau des Cholesterins Plasmamembran.

Amyloid peptide (AÎ²) is generated by sequential cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by Î²-secretase (Bace1) and Î³-secretase. AÎ² production increases after plasma membrane cholesterol loading through unknown mechanisms. To determine how APP-Bace1 proximity affects this phenomenon, we developed a fluorescence lifetime imaging microscopy-FÃ¶rster resonance energy transfer (FLIM-FRET) technique for visualization of these molecules either by epifluorescence or at the plasma membrane only using total internal reflection fluorescence. Further, we used fluorescence correlation spectroscopy to determine the lipid rafts partition of APP-yellow fluorescent protein (YFP) and Bace1-green fluorescent protein (GFP) molecules at the plasma membrane of neurons. We show that less than 10 min after cholesterol exposure, Bace1-GFP/APP-mCherry proximity increases selectively at the membrane and APP relocalizes to raft domains, preceded by rapid endocytosis. After longer cholesterol exposures, APP and Bace1 are found in proximity intracellularly. We demonstrate that cholesterol loading does not increase AÎ² production by having a direct impact on Bace1 catalytic activity but rather by altering the accessibility of Bace1 to its substrate, APP. This change in accessibility is mediated by clustering in lipid rafts, followed by rapid endocytosis.

Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis.

Amyloid-Peptid (A&beta;) wird durch fortlaufende Spaltung des Amyloid-Vorl&auml;ufer-Proteins (APP) von &beta;-Sekretase (Bace1) und &gamma;-Sekretase generiert. A&beta;-Produktion steigt nach Plasmamembran Cholesterin laden durch unbekannte Mechanismen. Um festzustellen, wie APP-Bace1 N&auml;he dieses Ph&auml;nomen beeinflusst, entwickelten wir ein Fluoreszenz Lebensdauer bildgebendes Mikroskopie-F&ouml;rster Resonanz Energie Transfer (FLIM-FRET) Verfahren zur Visualisierung dieser Molek&uuml;le durch Epifluoreszenz oder an der Plasmamembran, die nur mit Totalreflexion Fluoreszenz. Dar&uuml;ber hinaus bestimmt wir Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie, die Lipid-Fl&ouml;&szlig;e-Partition APP-gelb fluoreszierende Protein (YFP) und Bace1-gr&uuml;n fluoreszierendes Protein (GFP) Molek&uuml;le an die Plasmamembran von Neuronen. Wir zeigen, dass weniger als 10 min nach der Cholesterin-Exposition, Bace1-GFP/APP-mCherry N&auml;he erh&ouml;ht selektiv an der Membran und APP relocalizes um raft Dom&auml;nen, schnelle Endozytose vorangestellt. Nach l&auml;ngeren Cholesterin Forderungen APP und Bace1 in N&auml;he intrazellul&auml;r befinden. Wir zeigen, dass Cholesterin laden A&beta;-Produktion nicht durch, einen unmittelbaren Einfluss auf Bace1 katalytische Aktivit&auml;t, sondern durch &Auml;ndern der Zug&auml;nglichkeit von Bace1 auf seine Substrat, APP erh&ouml;ht. Diese &Auml;nderung im Bereich der Zug&auml;nglichkeit ist durch clustering in Lipid Rafts, gefolgt von schnellen Endozytose vermittelt.

Erh&ouml;hung der lokalen Cholesterin l&ouml;st Amyloid Precursor Protein-Bace1 Clusterbildung in Lipid Rafts und schnelle Endozytose.

The snake toxin MT7 is a potent and specific allosteric modulator of the human M1 muscarinic receptor (hM1). We previously characterized by mutagenesis experiments the functional determinants of the MT7-hM1 receptor interaction (Fruchart-Gaillard, C., Mourier, G., Marquer, C., Stura, E., Birdsall, N. J., and Servent, D. (2008) Mol. Pharmacol. 74, 1554-1563) and more recently collected evidence indicating that MT7 may bind to a dimeric form of hM1 (Marquer, C., Fruchart-Gaillard, C., Mourier, G., Grandjean, O., Girard, E., le Maire, M., Brown, S., and Servent, D. (2010) Biol. Cell 102, 409-420). To structurally characterize the MT7-hM1 complex, we adopted a strategy combining double mutant cycle experiments and molecular modeling calculations. First, thirty-three ligand-receptor proximities were identified from the analysis of sixty-one double mutant binding affinities. Several toxin residues that are more than 25 â„« apart still contact the same residues on the receptor. As a consequence, attempts to satisfy all the restraints by docking the toxin onto a single receptor failed. The toxin was then positioned onto two receptors during five independent flexible docking simulations. The different possible ligand and receptor extracellular loop conformations were described by performing simulations in explicit solvent. All the docking calculations converged to the same conformation of the MT7-hM1 dimer complex, satisfying the experimental restraints and in which (i) the toxin interacts with the extracellular side of the receptor, (ii) the tips of MT7 loops II and III contact one hM1 protomer, whereas the tip of loop I binds to the other protomer, and (iii) the hM1 dimeric interface involves the transmembrane helices TM6 and TM7. These results structurally support the high affinity and selectivity of the MT7-hM1 interaction and highlight the atypical mode of interaction of this allosteric ligand on its G protein-coupled receptor target.

Structural model of ligand-G protein-coupled receptor (GPCR) complex based on experimental double mutant cycle data: MT7 snake toxin bound to dimeric hM1 muscarinic receptor.

Das Gift der Schlange MT7 ist ein potenter und spezifische allosterischer Modulator der menschlichen muskarinische M1-Rezeptor (hM1). Wir zuvor gepr&auml;gt Mutagenese Experimente die funktionalen Determinanten der MT7-hM1-Rezeptor-Interaktion (Fruchart-Gaillard, C., Mourier, G., Marquer, C., Stura, E., Birdsall, N. J. und Servent, D. (2008) mg Pharmacol. 74, 1554 &ndash; 1563) und mehr k&uuml;rzlich gesammelten Beweise darauf hinweist, dass MT7 einer dimeren Form der hM1 binden kann (Marquer, C., Fruchart-Gaillard, C., Mourier, G., Grandjean, O., Girard, E., le MaireM., Braun, S., und Servent, D. (2010) Biol. Handy-102, 409-420). Um die MT7-hM1 strukturell charakterisieren Komplex, haben wir eine Strategie, die die doppelte mutant Zyklus Experimente und Molekulare Modellierung Berechnungen. Erstens dreiunddrei&szlig;ig-Ligand-Rezeptor-n&auml;hen wurden aus der Analyse der Sixty-One Doppel mutant verbindliche Affinit&auml;ten identifiziert. Mehrere Toxin-R&uuml;ckst&auml;nde, die mehr als 25 &Aring; auseinander sind Kontakt noch dieselben R&uuml;ckst&auml;nde auf den Rezeptor. Infolgedessen fehlgeschlagene Versuche, die Fesseln zu befriedigen, indem das Toxin auf ein einzelnes Rezeptor andocken. Das Toxin wurde dann auf zwei Rezeptoren w&auml;hrend f&uuml;nf unabh&auml;ngige flexible docking-Simulationen positioniert. Die verschiedenen m&ouml;glichen Ligand und Rezeptor extrazellul&auml;re Schleife Konformationen wurden mithilfe von Simulationen in explizite L&ouml;sungsmittel beschrieben. Alle docking Berechnungen konvergiert zu den gleichen Konformation der MT7-hM1 Dimer Komplex, Befriedigung der experimentellen Fesseln und in denen der extrazellul&auml;ren Seite des Rezeptors, (Ii) die Spitzen der MT7 Schleifen II und III Kontakt ein hM1 Protomer, (i) das Toxin interagiert, w&auml;hrend der Spitze der Schleife ich die anderen Protomer gebunden wird, und (Iii) die Dimere hM1-Schnittstelle beinhaltet die Transmembran Helices TM6 und TM7. Diese Ergebnisse unterst&uuml;tzen die hohe Affinit&auml;t und Selektivit&auml;t der MT7-hM1 Interaktion strukturell und markieren den atypischen Modus der Wechselwirkung der diese allosterischer Ligand ihrer G-Protein-gekoppelter Rezeptor-Zielgruppe.

Strukturmodell der Ligand-G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) komplexe basierend auf experimentellen Doppel mutant Zyklusdaten: MT7 Schlange Toxin an dimeren hM1 muskarinische Rezeptoren gebunden.

Muscarinic toxins isolated from the venom of Dendroaspis snakes may interact with a high affinity, large selectivity and various functional properties with muscarinic receptors. Therefore, these toxins are invaluable tools for studying the physiological role, molecular functioning and structural organization of the five subtypes of these G-Protein Coupled Receptors. We review the data on the most relevant results dealing with the isolation/identification, mode of action, structure/function and exploitation of these toxins and finally highlight the unresolved issues related to their pharmacological studies.

Muscarinic toxins.

Muskarinische Gifte isoliert aus dem Gift der Dendroaspis Schlangen k&ouml;nnen mit eine hohe Affinit&auml;t, gro&szlig;e Selektivit&auml;t und verschiedenen funktionellen Eigenschaften mit muskarinische Rezeptoren interagieren. Diese Toxine sind daher wertvolle Werkzeuge f&uuml;r das Studium der physiologischen Rolle, molekulare funktionieren und strukturellen Organisation der f&uuml;nf Subtypen dieser G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Wir &uuml;berpr&uuml;fen Sie die Daten auf die relevantesten Ergebnisse Umgang mit Isolierung/Ermittlung, Wirkung, Struktur/Funktion und Ausbeutung dieser Toxine und schlie&szlig;lich die ungel&ouml;sten Fragen im Zusammenhang mit ihrer pharmakologischen Studien zu markieren.

Article	Year
Polyoxomolybdates functionalized with phosphonocarboxylates. Inorganic chemistry\| PubMed ID: 12588152	2003
Identification of various allosteric interaction sites on M1 muscarinic receptor using 125I-Met35-oxidized muscarinic toxin 7. Molecular pharmacology\| PubMed ID: 16439611	2006
How three-finger-fold toxins interact with various cholinergic receptors. Journal of molecular neuroscience : MN\| PubMed ID: 17192604	2006
Different interactions between MT7 toxin and the human muscarinic M1 receptor in its free and N-methylscopolamine-occupied states. Molecular pharmacology\| PubMed ID: 18784346	2008
Influence of MT7 toxin on the oligomerization state of the M1 muscarinic receptor. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization\| PubMed ID: 20170475	2010
Cholesterol changes in Alzheimer's disease: methods of analysis and impact on the formation of enlarged endosomes. Biochimica et biophysica acta\| PubMed ID: 20348021	2010
Clathrin-dependent APP endocytosis and Abeta secretion are highly sensitive to the level of plasma membrane cholesterol. Biochimica et biophysica acta\| PubMed ID: 20580937	2010
Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology\| PubMed ID: 21257714	2011
Structural model of ligand-G protein-coupled receptor (GPCR) complex based on experimental double mutant cycle data: MT7 snake toxin bound to dimeric hM1 muscarinic receptor. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 21685390	2011
Muscarinic toxins. Toxicon : official journal of the International Society on Toxinology\| PubMed ID: 21906611	2011

Catherine Marquer

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