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Modeling and Imaging 3-Dimensional Collective Cell Invasion

A defining characteristic of cancer malignancy is invasion and metastasis 1. In some cancers (e.g. glioma 2), local invasion into surrounding healthy ...

RNA-Polymerase III-Transkription kann durch Onkogene oder Mutationen, die Kompromiss p53-Funktion in Tumoren und Li-Fraumeni-Syndrom dereprimiert werden.

RNA polymerase (pol) III synthesizes essential small RNAs, including tRNA and 5S rRNA. Wild-type p53 can repress pol III transcription both in vitro and in vivo. Many tumours carry substitutions in p53 which have selective effects on its functions. We identify tumour-derived mutations that compromise the ability of p53 to regulate pol III transcription. Furthermore, substitution R175H, the most common mutation in cancers, converts p53 from a repressor to an activator of pol III. Oncoproteins neutralize p53 in some tumours; we show that human papillomavirus E6 and cellular hdm2 can both release pol III from repression by p53. These data suggest that the restraining influence of p53 on pol III will be lost in many tumours. In addition to these features of sporadic cancers, some individuals inherit mutant forms of p53 and consequently suffer from Li-Fraumeni syndrome, showing genetic predisposition to certain malignancies. We find that pol III transcriptional activity is often highly elevated in primary fibroblasts from Li-Fraumeni patients, especially if the germline p53 mutation is followed by loss of the remaining allele. Our data suggest that p53 status can have a profound effect upon pol III transcription and hence on the biosynthetic capacity of cells.

RNA polymerase III transcription can be derepressed by oncogenes or mutations that compromise p53 function in tumours and Li-Fraumeni syndrome.

The tumour suppressor p53 has been shown to regulate RNA polymerase (pol) III transcription both in vitro and in vivo. We have characterized the regions of p53 that contribute to this effect. Repression of pol III transcription in vivo does not require residues 13-19 near the N-terminus of p53 that are highly conserved through evolution. However, amino acids 22 and 23 in the adjacent transactivation domain do contribute to the inhibition of pol III activity. Deletions within the central DNA-binding core domain (residues 102-292) of p53 can entirely abolish the repression function in these assays, despite the fact that pol III templates contain no recognized p53 binding site. Deletion or substitution within the C-terminal domain of p53 can also compromise its ability to repress pol III activity in vitro and in transfected cells. These observations reveal that repression of pol III transcription is a complex function involving multiple regions of p53 extending throughout much of the protein.

Several regions of p53 are involved in repression of RNA polymerase III transcription.

Mehrere Regionen von p53 in der Unterdr&#xFC;ckung der RNA-Polymerase III Transkription beteiligt.

The tumor suppressor p53 is a transcription factor that controls cellular growth and proliferation. p53 targets include RNA polymerase (pol) III-dependent genes encoding untranslated RNAs such as tRNA and 5S rRNA. These genes are repressed through interaction of p53 with TFIIIB, a TATA-binding protein (TBP)-containing factor. Although many studies have shown that p53 binds to TBP, the significance of this interaction has remained elusive. Here we demonstrate that the TBP-p53 interaction is of functional importance for regulating RNA pol III-transcribed genes. Unlike RNA pol II-dependent promoter repression, overexpressing TBP can reverse inhibition of tRNA gene transcription by p53. p53 does not disrupt the direct interaction between the TFIIIB subunits TBP and Brf1, but prevents the association of Brf1 complexes with TFIIIC2 and RNA pol III. Using chromatin immunoprecipitation assays, we found that TFIIIB occupancy on tRNA genes markedly decreases following p53 induction, whereas binding of TFIIIC2 to these genes is unaffected. Together our results support the idea that p53 represses RNA pol III transcription through direct interactions with TBP, preventing promoter occupancy by TFIIIB.

p53 represses RNA polymerase III transcription by targeting TBP and inhibiting promoter occupancy by TFIIIB.

p53 unterdr&#xFC;ckt RNA-Polymerase III-Transkription durch gezielte Hemmung TBP und Promoter Belegung durch TFIIIB.

Verkn&#xFC;pfen der DNA-Sch&#xE4;den Reaktionen auf Tod von Tumorzellen.

The ability of a tumour cell to evade programmed cell death (apoptosis) is crucial in the development of cancer. The process of apoptosis is complex and involves the careful interplay of a host of signalling molecules. Cellular stresses, such as DNA-damage, can initiate apoptosis through multiple pathways, all of which eventually lead to eradication of damaged cells that may otherwise go on to form a tumour. Moreover, the relevance of this to combating cancer is very strong since several therapeutic agents used to treat malignant disease utilize the cells' apoptotic machinery. The purpose of this review is to provide an insight into what we know about how apoptosis is initiated by DNA-damaging agents, how pro- and anti-apoptotic signals converge in the execution of cell death, and how such mechanisms can be perturbed in cancer.

Splicing DNA-damage responses to tumour cell death.

Inactivation of cell death is a major step in tumor development, and p53, a tumor suppressor frequently mutated in cancer, is a critical mediator of cell death. While a role for p53 in apoptosis is well established, direct links to other pathways controlling cell death are unknown. Here we describe DRAM (damage-regulated autophagy modulator), a p53 target gene encoding a lysosomal protein that induces macroautophagy, as an effector of p53-mediated death. We show that p53 induces autophagy in a DRAM-dependent manner and, while overexpression of DRAM alone causes minimal cell death, DRAM is essential for p53-mediated apoptosis. Moreover, analysis of DRAM in primary tumors revealed frequent decreased expression often accompanied by retention of wild-type p53. Collectively therefore, these studies not only report a stress-induced regulator of autophagy but also highlight the relationship of DRAM and autophagy to p53 function and damage-induced programmed cell death.

DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis.

Inaktivierung des Zelle Todes ist ein wichtiger Schritt in der Entwicklung der Tumor p53, Tumorsuppressor h&auml;ufig mutiert in Krebs, ist ein wichtiger Vermittler von Zelltod W&auml;hrend eine Rolle f&uuml;r p53 in Apoptosis gut etabliert ist, sind direkte Links zu anderen Bahnen, die Steuern Zellentod unbekannt. Hier beschreiben wir DRAM (Schaden reguliert Autophagy Modulator), eine p53-Ziel-gen f&uuml;r eine lysosomal Protein, die Macroautophagy, als ein Effektor p53-vermittelte Tod bedingt. Wir zeigen, dass p53 Autophagy DRAM-abh&auml;ngigen Weise induziert und w&auml;hrend eine &Uuml;berexpression von DRAM allein minimal Zelltod verursacht, DRAM f&uuml;r p53-vermittelter Apoptose essentiell. Dar&uuml;ber hinaus ergab die Analyse DRAM in Prim&auml;rtumoren h&auml;ufig verminderte Ausdruck, oft begleitet von Aufbewahrung von Wildtyp p53. Kollektiv daher diese Studien Berichten nicht nur einen Stress-induced Regulator Autophagy aber markieren Sie auch das Verh&auml;ltnis von DRAM und Autophagy p53-Funktion und Sch&auml;den-induzierten programmierten Zelltod.

DRAM, p53-induzierte Modulator der Autophagy, ist entscheidend f&uuml;r Apoptosis.

It is clear that changes in autophagy and autophagy regulators occur during tumor development and that this can have profound effects in certain tumor settings. The fact that p53, a key tumor suppressor mutated in approximately 50% of human cancers, has now also been shown to induce autophagy, has placed autophagy center stage in the minds of those interested in the development and treatment of malignant disease. p53 is a transcription factor that responds to cellular stress and prevents the propagation of cells which may otherwise form a tumor. The recent discovery, therefore, of DRAM (damage-regulated autophagy modulator) as a new p53 target which modulates autophagy is a major step forward in understanding how p53 controls autophagy and how this relates to tumor suppression. DRAM is a lysosomal protein that is not only critical for the ability of p53 to induce autophagy, but also for p53's ability to induce programmed cell death--a facet of p53 considered central to its tumor-suppressive effects. The fact that DRAM is also inactivated in certain cancers underscores its importance and highlights the possibility that autophagy may have a more profound role in cancer than was first believed.

DRAM links autophagy to p53 and programmed cell death.

Es ist klar, dass &Auml;nderungen im Autophagy und Autophagy Regulatoren w&auml;hrend der Tumor Entwicklung auftreten und dass dies in bestimmten Tumor gro&szlig;e Auswirkungen haben kann. Die Tatsache, dass p53, mutiert bei etwa 50 % der menschlichen Krebserkrankungen, zentrale Tumorsuppressor jetzt auch nachweislich Autophagy, induzieren stellte Autophagy Mittelpunkt in den K&ouml;pfen derer Interesse an der Entwicklung und Behandlung von b&ouml;sartigen Krankheit. p53 ist ein Transkriptionsfaktor, der zellul&auml;ren Stress reagiert und verhindert die Vermehrung von Zellen, die sonst einen Tumor bilden k&ouml;nnen. Die j&uuml;ngste Entdeckung deshalb DRAM (Schaden reguliert Autophagy Modulator) als ein neues p53-Ziel, das Autophagy moduliert ein Meilenstein zum Verst&auml;ndnis wie p53 Autophagy steuert und wie dies bezieht sich auf Tumor-Unterdr&uuml;ckung. DRAM ist ein lysosomal Protein, das ist nicht nur entscheidend f&uuml;r die F&auml;higkeit von p53, Autophagy induzieren, aber auch f&uuml;r p53 die F&auml;higkeit zu programmierten Zelltod--als eine Facette des p53 seine Tumor-unterdr&uuml;ckende Wirkung im Mittelpunkt. Die Tatsache, dass DRAM auch in bestimmten Krebsarten inaktiviert ist unterstreicht seine Bedeutung und hebt die M&ouml;glichkeit, dass diese Autophagy eine tiefer greifende Rolle im Krebs als zun&auml;chst angenommen wurde haben kann.

DRAM verbindet Autophagy, p53 und programmierten Zelltod.

The tumor suppressor p53 is a potent inducer of tumor cell death, and strategies exist to exploit p53 for therapeutic gain. However, because about half of human cancers contain mutant p53, application of these strategies is restricted. p53 family members, in particular p73, are in many ways functional paralogs of p53, but are rarely mutated in cancer. Methods for specific activation of p73, however, remain to be elucidated. We describe here a minimal p53-derived apoptotic peptide that induced death in multiple cell types regardless of p53 status. While unable to activate gene expression directly, this peptide retained the capacity to bind iASPP - a common negative regulator of p53 family members. Concordantly, in p53-null cells, this peptide derepressed p73, causing p73-mediated gene activation and death. Moreover, systemic nanoparticle delivery of a transgene expressing this peptide caused tumor regression in vivo via p73. This study therefore heralds what we believe to be the first strategy to directly and selectively activate p73 therapeutically and may lead to the development of broadly applicable agents for the treatment of malignant disease.

A p53-derived apoptotic peptide derepresses p73 to cause tumor regression in vivo.

Der Tumorsuppressor p53 ist ein potenter Induktor von Tumor Zellentod und gibt es Strategien, um p53 f&uuml;r therapeutische Zwecke zu nutzen. Da etwa die H&auml;lfte der menschlichen Krebserkrankungen mutierten p53 enthalten, ist jedoch die Anwendung dieser Strategien beschr&auml;nkt. p53-Familienmitglieder, in bestimmten p73, sind in vielen funktionalen M&ouml;glichkeiten-Paralogs von p53, aber selten in Krebs mutiert sind. Methoden f&uuml;r spezifische Aktivierung p73, m&uuml;ssen jedoch noch gekl&auml;rt werden. Wir beschreiben hier ein minimaler p53 abgeleitete Apoptotic-Peptid, das Tod mehrerer Zelltypen unabh&auml;ngig von p53 Status induziert. Zwar nicht in der Lage, Genexpression direkt zu aktivieren, erhalten dieses Peptid iASPP - einen gemeinsamen negativen Regulator der p53-Familienmitglieder zu verpflichten. &Uuml;bereinstimmend, derepressed dieses Peptid in p53-Null-Zellen, p73, p73-vermittelte Genaktivierung und Tod verursachen. Dar&uuml;ber hinaus verursacht die systemische Nanopartikel Lieferung eine Transgene Ausdruck dieses Peptid Tumorr&uuml;ckbildung f&uuml;hrt in-vivo &uuml;ber p73. Diese Studie l&auml;utet daher, was wir glauben, dass die erste Strategie, direkt und selektiv p73 therapeutisch zu aktivieren und zu der Entwicklung von allgemein geltenden Agenten f&uuml;r die Behandlung von b&ouml;sartigen Krankheit f&uuml;hren kann.

Ein Peptid p53 abgeleitete Apoptotic derepresses p73 Tumorr&uuml;ckbildung f&uuml;hrt in-vivo verursachen.

The intricate regulation of cell survival and cell death is critical for the existence of both normal and transformed cells. Two factors central to these processes are p53 and NFkappaB, with both factors having ascribed roles in both promoting and repressing cell death. Not surprisingly, a number of studies have previously reported interplay between p53 and NFkappaB. The mechanistic basis behind these observations, however, is currently incomplete. We report here further insights into this interplay using a system where blockade of NFkappaB inhibits cell death from p53, but at the same time sensitizes cells to death by TNFalpha. We found in agreement with a recent report showing that NFkappaB is required for the efficient activation of the BH3-only protein Noxa by the p53 family member p73, that p53's ability to induce Noxa is also impeded by inhibition of NFkappaB. In contrast to the regulation by p73, however, blockade of NFkappaB downstream of p53 decreases Noxa protein levels without effects on Noxa mRNA. Our further analysis of the effects of NFkappaB inhibition on p53 target gene expression revealed that while most target genes analysed where unaffected by blockade of NFkappaB, the p53-mediated induction of the pro-apoptotic gene p53AIP1 was significantly dependent on NFkappaB. These studies therefore add further insight into the complex relationship of p53 and NFkappaB. In addition, since both Noxa and p53AIP1 have been shown to be important components of p53-mediated cell death responses, these findings may also indicate critical points where NFkappaB plays a pro-apoptotic role downstream of p53.

p53-mediated induction of Noxa and p53AIP1 requires NFkappaB.

Die komplizierte Regelung der Zelle &uuml;berleben und Zelltod ist entscheidend f&uuml;r die Existenz von normal- und transformierten Zellen. Zwei Faktoren f&uuml;r diese Prozesse sind p53 und NFkappaB, mit beiden Faktoren haben Rollen in F&ouml;rderung und Unterdr&uuml;ckung Zelltod zugeschrieben. Es &uuml;berrascht nicht, haben eine Reihe von Studien zuvor Wechselspiel zwischen p53 und NFkappaB berichtet. Die mechanistische Grundlage hinter dieser Beobachtungen ist jedoch derzeit unvollst&auml;ndig. Wir berichten hier weitere Einblicke in dieses Zusammenspiel mit einem System wo Blockade der NFkappaB Zelltod von p53 hemmt, aber zur gleichen Zeit sensibilisiert Zellen zum Tode durch TNFalpha. Wir fanden im Einvernehmen mit einem k&uuml;rzlich ver&ouml;ffentlichten Bericht zeigt, dass NFkappaB f&uuml;r die effiziente Aktivierung des BH3-only-Proteins Noxa durch die p53 Familienmitglied p73 erforderlich ist, dass p53 die F&auml;higkeit zu Noxa auch durch Hemmung von NFkappaB behindert wird. Im Gegensatz zu der Verordnung durch p73 verringert jedoch Blockade der NFkappaB stromabw&auml;rts von p53 Noxa Protein-Ebene ohne Auswirkungen auf Noxa mRNA. Unsere weitere Analyse der Auswirkungen von NFkappaB-Hemmung auf Genexpression von p53 Ziel ergab, dass zwar die meisten Zielgene wo unber&uuml;hrt durch Blockade von NFkappaB analysiert, die p53-vermittelte Induktion der Pro-apoptotischen gen p53AIP1 auf NFkappaB angewiesen. Diese Studien daher hinzuf&uuml;gen weitere Einblicke in das komplexe Verh&auml;ltnis von p53 und NFkappaB. Dar&uuml;ber hinaus da Noxa und p53AIP1 erwiesen haben, wichtige Bestandteile der p53-vermittelte Zelle Tod Antworten, k&ouml;nnen diese Befunde auch zeigen kritische Punkte wo NFkappaB eine Pro-apoptotischen Rolle stromabw&auml;rts von p53 spielt.

p53-vermittelte Induktion von Noxa und p53AIP1 erfordert NFkappaB.

Although the transcription factor NF-kappaB is most clearly linked to the inhibition of extrinsic apoptotic signals such as TNFalpha by upregulating known anti-apoptotic genes, NF-kappaB has also been proposed to be required for p53-induced apoptosis in transformed cells. However, the involvement of NF-kappaB in this process is poorly understood. Here we investigate this mechanism and show that in transformed MEFs lacking NF-kappaB (p65-null cells) genotoxin-induced cytochrome c release is compromised. To further address how NF-kappaB contributes to apoptosis, gene profiling by microarray analysis of MEFs was performed, revealing that NF-kappaB is required for expression of Noxa, a pro-apoptotic BH3-only protein that is induced by genotoxins and that triggers cytochrome c release. Moreover, we find that in the absence of NF-kappaB, genotoxin treatment cannot induce Noxa mRNA expression. Noxa expression had been shown to be regulated directly by genes of the p53 family, like p73 and p63, following genotoxin treatment. Here we show that p73 is activated after genotoxin treatment only in the presence of NF-kappaB and that p73 induces Noxa gene expression through the p53 element in the promoter. Together our data provides an explanation for how loss of NF-kappaB abrogates genotoxin-induced apoptosis.

Activation of p73 and induction of Noxa by DNA damage requires NF-kappa B.

Obwohl der Transkriptionsfaktor NF-KappaB am deutlichsten die Hemmung der extrinsischen Apoptotic verkn&uuml;pften durch Heraufregulierung Anti-Apoptotic Gene bekannt wie TNFalpha signalisiert, wurde NF-KappaB ebenso vorgeschlagen f&uuml;r p53-induzierten Apoptose in transformierten Zellen erforderlich sein. Jedoch ist die Beteiligung der NF-KappaB in diesem Prozess oft missverstanden. Hier untersuchen wir dieses Mechanismus und Show, die in umgewandelt MEFs fehlt NF-KappaB (p65-Null-Zellen) Genotoxin-induzierte Cytochrom C Ver&ouml;ffentlichung gef&auml;hrdet wird. Weitere Adresse wie NF-KappaB zu Apoptosis beitr&auml;gt, Gen Profilerstellung von Microarray-Analyse der MEFs durchgef&uuml;hrt wurde, offenbart, dass NF-KappaB f&uuml;r Ausdruck der Noxa, eine Pro-apoptotischen BH3-only-Protein ben&ouml;tigt, die durch Genotoxins hervorgerufen wird und l&ouml;st, die Cytochrom-C-Version. Dar&uuml;ber hinaus finden wir, dass in Ermangelung von NF-KappaB, Genotoxin Behandlung Noxa mRNA Ausdruck ausl&ouml;sen, kann nicht. Noxa Ausdruck hatte nachweislich direkt von Genen der p53-Familie, wie p73 und p63, nach Genotoxin Behandlung reguliert werden. Hier zeigen wir, dass p73 nach Genotoxin Behandlung nur in Anwesenheit von NF-KappaB aktiviert ist und dass p73 Noxa Genexpression durch das p53-Element in der Projekttr&auml;ger induziert. Zusammen stellt unsere Daten eine Erkl&auml;rung daf&uuml;r, wie Verlust von NF-KappaB Genotoxin-induzierten Apoptose hebt.

Aktivierung der p73 und Induktion von Noxa von DNA-Sch&auml;den erfordert NF-Kappa B.

LIM kinases 1 and 2 (LIMK1/2) are centrally positioned regulators of actin cytoskeleton dynamics. Using siRNA-mediated knockdown or a novel small molecule inhibitor, we show LIMK is required for path generation by leading tumor cells and nontumor stromal cells during collective tumor cell invasion. LIMK inhibition lowers cofilin phosphorylation, F-actin levels, serum response factor transcriptional activity and collagen contraction, and reduces invasion in three-dimensional invasion assays. Although motility was unaffected, LIMK inhibition impairs matrix protein degradation and invadopodia formation associated with significantly faster recovery times in FRAP assays indicative of reduced F-actin stability. When LIMK is knocked down in MDA-MB-231 cells, they lose the ability to lead strands of collectively invading cells. Similarly, when LIMK activity is blocked in cancer-associated fibroblasts, they are unable to lead the collective invasion of squamous carcinoma cells in an organotypic skin model. These results show that LIMK is required for matrix remodeling activities for path generation by leading cells in collective invasion.

LIM kinases are required for invasive path generation by tumor and tumor-associated stromal cells.

LIM-Kinasen 1 und 2 (LIMK1/2) sind zentral positionierten Regulatoren der Aktin-Zytoskelett Dynamik. Mit SiRNA-vermittelte Niederschlag oder ein neuartiges niedermolekularer Inhibitor, zeigen wir, dass LIMK erforderlich f&uuml;r Pfad-Generation von f&uuml;hrenden Tumorzellen und Nontumor stromal Zellen w&auml;hrend der kollektiven Tumorinvasion Zelle ist. LIMK Hemmung Cofilin Phosphorylierung, F-Actin Ebenen, Serum Antwort Faktor transkriptionelle Aktivit&auml;t und Kollagen Kontraktion und reduziert Invasion im dreidimensionalen Invasion Proben. Obwohl Motilit&auml;t unber&uuml;hrt war, beeintr&auml;chtigt die LIMK Hemmung Matrix Proteinabbau und Invadopodia Bildung wesentlich schnellere Wiederherstellungszeiten bei FRAP-Assays bezeichnend f&uuml;r reduzierte F-Actin-Stabilit&auml;t zugeordnet. Wenn LIMK im MDA-MB-231 Zellen abgerissen ist, verlieren sie die F&auml;higkeit Str&auml;nge der Kollektiv eindringenden Zellen f&uuml;hren. Ebenso, wenn LIMK Aktivit&auml;t in Krebs-assoziierte Fibroblasten blockiert ist, werden sie dem kollektiven Einmarsch der Plattenepithel-Karzinom-Zellen in einem organotypische Haut-Modell. Diese Ergebnisse zeigen, dass LIMK f&uuml;r Matrix Umbau Aktivit&auml;ten f&uuml;r Pfad-Generation von f&uuml;hrenden Zellen im kollektiven Invasion erforderlich ist.

LIM-Kinasen sind f&uuml;r invasive Pfad-Generation von Tumor und Tumor-assoziierte stromal Zellen erforderlich.

The central arbiter of cell fate in response to DNA damage is p53, which regulates the expression of genes involved in cell cycle arrest, survival and apoptosis. Although many responses initiated by DNA damage have been characterized, the role of actin cytoskeleton regulators is largely unknown. We now show that RhoC and LIM kinase 2 (LIMK2) are direct p53 target genes induced by genotoxic agents. Although RhoC and LIMK2 have well-established roles in actin cytoskeleton regulation, our results indicate that activation of LIMK2 also has a pro-survival function following DNA damage. LIMK inhibition by siRNA-mediated knockdown or selective pharmacological blockade sensitized cells to radio- or chemotherapy, such that treatments that were sub-lethal when administered singly resulted in cell death when combined with LIMK inhibition. Our findings suggest that combining LIMK inhibitors with genotoxic therapies could be more efficacious than single-agent administration, and highlight a novel connection between actin cytoskeleton regulators and DNA damage-induced cell survival mechanisms.

p53-mediated transcriptional regulation and activation of the actin cytoskeleton regulatory RhoC to LIMK2 signaling pathway promotes cell survival.

Zum zentralen Richter &uuml;ber das Schicksal der Zelle als Antwort auf DNA-Sch&auml;den ist p53, die regelt die Expression von Genen Zellzyklus Verhaftung, &Uuml;berleben und Apoptose beteiligt. Obwohl viele Reaktionen initiiert von DNA-Sch&auml;den gepr&auml;gt haben, ist die Rolle der Aktin-Zytoskeletts Regulierungsbeh&ouml;rden weitgehend unbekannt. Wir zeigen nun, dass RhoC und LIM Kinase 2 (LIMK2) sind direkte p53-Zielgene von gentoxischen Agenten induziert. Obwohl RhoC und LIMK2 gut etablierten Rollen in Aktin-Zytoskelett-Verordnung haben, zeigen unsere Ergebnisse, dass Aktivierung des LIMK2 hat auch eine pro-survival Funktion, die nach DNA-Sch&auml;den. LIMK Hemmung von SiRNA-vermittelte Niederschlag oder selektiv pharmakologische blockade sensibilisierte Zellen zu Radio- oder Chemotherapie, so dass Behandlungen, die subletale einzeln verabreicht wurden Zelltod in Kombination mit LIMK Hemmung gef&uuml;hrt. Unsere Forschungsergebnisse legen nahe, dass LIMK Inhibitoren mit genotoxischen Therapien kombinieren k&ouml;nnte wirksamer als Single-Agent-Administration und eine neuartige Verbindung zwischen Aktin-Zytoskelett-Regulatoren und &Uuml;berlebensmechanismen f&uuml;r DNA-Sch&auml;den-induced Zelle zu markieren.

p53-vermittelte transkriptionelle Regulation und Aktivierung des Aktin-Zytoskeletts, die gesetzlichen RhoC zu LIMK2 Signalisierung Weg f&ouml;rdert Zelle &uuml;berleben.

The spread of tumor cells from primary sites often occurs as associated cell collectives. In this form of invasion, the contribution of cells leading the way may differ from those that follow. By implication, proteins that regulate the actin cytoskeleton, a major driver of cell motility, may have different roles depending on whether they are in leading or following cells. The LIM kinases 1 and 2 (LIMK) phosphorylate and inactivate the filamentous actin severing function of cofilin proteins. Using siRNA or pharmacological inhibitors, LIMK was found to be required in leading cells of collectively invading tumor cells, or in cancer-associated stromal fibroblasts, for effective extracellular matrix degradation that facilitates three-dimensional invasion. The decreased extracellular matrix degrading activities were associated with an inability to form the stable filamentous actin structures necessary to make matrix-degrading protrusive structures. However, LIMK was not required for cell motility or for path-following in associated collectives. These findings show that leading and following cells in collective invasion have different properties and indicate that targeting the activities in leading cells is sufficient to significantly inhibit tumor cell invasiveness.

Trailblazing LIM kinases take the lead in collective tumor cell invasion.

Die Ausbreitung der Tumorzellen aus prim&auml;ren Standorten tritt h&auml;ufig als zugeordnete Zelle kollektive. In dieser Form der Invasion kann der Beitrag der Zellen, die den Weg von denen abweichen, die Folgen. Durch Implikation k&ouml;nnen Proteine, die Regeln des Aktin-Zytoskeletts, ein Hauptgrund f&uuml;r Zelle Motilit&auml;t, haben unterschiedliche Rollen abh&auml;ngig davon, ob sie in f&uuml;hrenden oder nach Zellen. Die LIM-Kinasen 1 und 2 (LIMK) phosphoryliert und inaktivieren die filament&ouml;se Actin, die Funktion der Proteine Cofilin trennte. Mit SiRNA oder pharmakologische Inhibitoren, LIMK wurde festgestellt, dass in f&uuml;hrenden Zellen der Kollektiv Invasionstruppen Tumorzellen ben&ouml;tigt werden, oder f&uuml;r effektive extrazellul&auml;ren Matrix Abbau erleichtert, die in Krebs-assoziierte stromal Fibroblasten, dreidimensionale Einmarsch. Die verminderte extrazellul&auml;ren Matrix erniedrigende T&auml;tigkeiten wurden mit einer Unf&auml;higkeit, die stabile filament&ouml;sen Aktin-Strukturen zu Matrix-erniedrigende protrusive Strukturen bilden. LIMK war jedoch nicht erforderlich, f&uuml;r Zelle Motilit&auml;t oder in damit verbundenen kollektiven Pfad-Folgendes. Diese Ergebnisse zeigen, dass die f&uuml;hrende und folgende Zellen im kollektiven Invasion haben unterschiedliche Eigenschaften und darauf hinweisen, dass die Ausrichtung der Aktivit&auml;ten in den f&uuml;hrenden Zellen signifikant hemmen Tumor Zelle Invasivit&auml;t ausreicht.

Wegweisende LIM-Kinasen &uuml;bernehmen in kollektiven Tumorinvasion Zelle die F&uuml;hrungsrolle.

MRCKÎ± and MRCKÎ² (myotonic dystrophy kinase-related Cdc42-binding kinases) belong to a subfamily of Rho GTPase activated serine/threonine kinases within the AGC-family that regulate the actomyosin cytoskeleton. Reflecting their roles in myosin light chain (MLC) phosphorylation, MRCKÎ± and MRCKÎ² influence cell shape and motility. We report further evidence for MRCKÎ± and MRCKÎ² contributions to the invasion of cancer cells in 3-dimensional matrix invasion assays. In particular, our results indicate that the combined inhibition of MRCKÎ± and MRCKÎ² together with inhibition of ROCK kinases results in significantly greater effects on reducing cancer cell invasion than blocking either MRCK or ROCK kinases alone. To probe the kinase ligand pocket, we screened 159 kinase inhibitors in an in vitro MRCKÎ² kinase assay and found 11 compounds that inhibited enzyme activity >80% at 3 ÂµM. Further analysis of three hits, Y-27632, Fasudil and TPCA-1, revealed low micromolar IC(50) values for MRCKÎ± and MRCKÎ². We also describe the crystal structure of MRCKÎ² in complex with inhibitors Fasudil and TPCA-1 bound to the active site of the kinase. These high-resolution structures reveal a highly conserved AGC kinase fold in a typical dimeric arrangement. The kinase domain is in an active conformation with a fully-ordered and correctly positioned Î±C helix and catalytic residues in a conformation competent for catalysis. Together, these results provide further validation for MRCK involvement in regulation of cancer cell invasion and present a valuable starting point for future structure-based drug discovery efforts.

Co-crystal structures of inhibitors with MRCKÎ², a key regulator of tumor cell invasion.

MRCK&alpha; und MRCK&beta; (Myotone Dystrophie Kinase-bezogene Cdc42-Bindung Kinasen) geh&ouml;ren zur Unterfamilie der Rho-GTPase aktiviert-Serin/Threonin-Kinasen innerhalb der AGC-Familie, die das Zytoskelett Actomyosin regulieren. Reflektieren ihre Rollen der Phosphorylierung der Myosin-Leichtketten (MLC), beeinflussen MRCK&alpha; und MRCK&beta; Zelle Form und Beweglichkeit der Spermien. Wir berichten weiter Beweis f&uuml;r MRCK&alpha; und MRCK&beta;-Beitr&auml;ge auf die Invasion der Krebszellen im 3-dimensionalen Matrix Invasion Proben. Insbesondere zeigen unsere Ergebnisse, dass die kombinierte Hemmung der MRCK&alpha; und MRCK&beta; zusammen mit der Hemmung der ROCK-Kinasen deutlich gr&ouml;&szlig;ere Auswirkungen auf die Verringerung der Krebs Zelle Einmarsch als blockieren entweder MRCK oder ROCK Kinasen allein f&uuml;hrt. Um die Kinase-Ligand-Pocket-Sonde wir geschirmt 159-Kinase-Inhibitoren in ein in-vitro-MRCK&beta; Kinase Assay und fanden 11 Verbindungen, die Enzymaktivit&auml;t gehemmt &gt; 80 % bei 3 &micro;M. Weitere Analyse der drei Hits, Y-27632, Fasudil und TPCA-1, ergab niedrige micromolar IC (50) Werte f&uuml;r MRCK&alpha; und MRCK&beta;. Wir beschreiben auch die Kristallstruktur von MRCK&beta; im Komplex mit Inhibitoren, an die der aktiven Site die Kinase Fasudil und TPCA-1 gebunden. Diese hochaufl&ouml;senden Strukturen zeigen eine stark konservierte AGC-Kinase-Falte in einer typischen Dimere Anordnung. Die Kinase-Dom&auml;ne ist eine aktive Konformation mit einer vollst&auml;ndig bestellt und richtig positioniert &alpha;C Helix und katalytische R&uuml;ckst&auml;nde in eine Konformation zust&auml;ndigen f&uuml;r Katalyse. Zusammen, diese Ergebnisse liefern weitere Validierung f&uuml;r MRCK Beteiligung an Verordnung Krebs Zelle Invasion und einen wertvollen Ausgangspunkt f&uuml;r zuk&uuml;nftige Strukturbasiertes Entdeckung Bem&uuml;hungen zu pr&auml;sentieren.

Article	Year
RNA polymerase III transcription can be derepressed by oncogenes or mutations that compromise p53 function in tumours and Li-Fraumeni syndrome. Oncogene\| PubMed ID: 12082526	2002
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Co-crystal structures of inhibitors with MRCKÎ², a key regulator of tumor cell invasion. PloS one\| PubMed ID: 21949762	2011

Diane Crighton

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