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Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

The ability to pattern multiple bioactive cues on a surface is valuable for understanding how neurons interact with their complex extracellular environment. In this report, we introduce a set of methods for creating such surfaces, with the goals of understanding how developing neurons integrate multiple biologically relevant signals and as a tool for studying interactions between multiple neurons. Multiple microcontact printing steps are combined on a single surface to produce an array of polylysine nodes, interconnected by lines of proteins based on the extracellular domains of L1 or N-cadherin. Surprisingly, the N-cadherin protein could also be directly printed onto surfaces while retaining its biological activity. Rat hippocampal neurons selectively attached to the polylysine nodes, differentially extending axonal and dendritic processes along the patterns of L1 and N-cadherin, thus demonstrating control over neuron attachment and outgrowth. Combining these three biomolecules on a single surface revealed a highly complex pattern of protein recognition. Dendrites extended exclusively on N-cadherin patterns, while axons exhibited a very high degree of selectivity on L1 patterns, preferentially at distances greater than 55 mum from the cell body. At shorter distances, axonal processes recognized both L1 and N-cadherin, revealing a new aspect of neuron polarity and axon specification. This onset of L1 selectivity correlated with the establishment of intracellular L1 polarity, suggesting a functional outcome of the process of neuron polarization that has implications in development of neural tissues and creation of in vitro neuron networks.

Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro.

Die F&auml;higkeit, mehrere bioaktive Hinweise auf eine Oberfl&auml;che Muster ist wertvoll f&uuml;r das Verst&auml;ndnis der Interaktion von Neuronen mit ihren komplexen extrazellul&auml;ren Umgebung. In diesem Bericht stellen wir eine Reihe von Methoden zum Erstellen von solchen Oberfl&auml;chen, mit den Zielen des Verst&auml;ndnisses, wie entwickelnde Neuronen mehrere biologisch relevanter Signale integrieren und als Instrument zur Untersuchung von Interaktionen zwischen mehreren Neuronen. Mehrere Microcontact Drucken Schritte werden auf einer einzigen Oberfl&auml;che um ein Array von Polylysin Knoten, miteinander verbunden durch Linien von Proteinen, die basierend auf der extrazellul&auml;ren Dom&auml;nen L1 oder N-Cadherin produzieren kombiniert. &Uuml;berraschenderweise konnte das N-Cadherin-Protein auch direkt auf Oberfl&auml;chen gedruckt werden unter Beibehaltung seiner biologischen Aktivit&auml;t. Ratte-Neuronen selektiv mit der Polylysin-Knoten, differentiell erweitern axonalen und dendritischen Prozesse entlang der Muster von L1 und N-Cadherin, damit demonstrieren Kontrolle &uuml;ber Neuron Anlage und Auswuchs verbunden. Kombination dieser drei Biomolek&uuml;len auf einer einzigen Oberfl&auml;che offenbart ein hochkomplexes Muster der Protein-Anerkennung. Dendriten, die ausschlie&szlig;lich auf N-Cadherin Muster, verl&auml;ngert, w&auml;hrend Axone ein sehr hohes Ma&szlig; an Selektivit&auml;t auf L1-Mustern, vorzugsweise bei Entfernungen gr&ouml;&szlig;er als 55 Mum vom Zellk&ouml;rper ausgestellt. Bei k&uuml;rzeren Entfernungen erkannt axonale Prozesse L1 und N-Cadherin, offenbart einen neuen Aspekt des Neuron Polarit&auml;t und Axon-Spezifikation. Dieser Ausbruch von L1 Selektivit&auml;t korreliert mit der Errichtung des intrazellul&auml;ren L1-Polarit&auml;t, was auf eine funktionale Ergebnis des Prozesses der Neuron-Polarisierung, die Auswirkungen auf die Entwicklung von Nervengewebe und Schaffung von in-vitro-Neuron hat.

Lokale Pr&auml;sentation von L1 und N-Cadherin in Mehrkomponenten, direkte Microscale Muster differentiell Neuron-Funktion in vitro.

Molecules associated with the outer surface of living cells exhibit complex, non-Brownian patterns of diffusion. In this report, supported lipid bilayers were patterned with nanoscale barriers to capture key aspects of this anomalous diffusion in a controllable format. First, long-range diffusion coefficients of membrane-associated molecules were significantly reduced by the presence of the barriers, while short-range diffusion was unaffected. Second, this modulation was more pronounced for large molecular complexes than for individual lipids. Surprisingly, the quantitative effect of these barriers on long-range lipid diffusion could be accurately simulated using a simple, continuum-based model of diffusion on a nanostructured surface; we thus describe a metamaterial that captures the properties of the outer membrane of living cells.

Non-Brownian diffusion of membrane molecules in nanopatterned supported lipid bilayers.

Molek&uuml;le, die mit der &auml;u&szlig;eren Oberfl&auml;che der lebenden Zellen verbunden zeigen komplexe, nicht-Brownsche Muster der Diffusion. In diesem Bericht wurden unterst&uuml;tzten Lipid-Doppelschichten mit nanoskaligen Barrieren Schl&uuml;sselaspekte dieses anomale Diffusion in einem steuerbaren Format erfassen gemustert. Erste, weitr&auml;umige Diffusionskoeffizienten Membran-assoziierter Molek&uuml;le wurden deutlich reduziert durch die Anwesenheit der Hindernisse, w&auml;hrend Kurzstrecken Verbreitung nicht betroffen war. Zweitens war dieser Modulation f&uuml;r gro&szlig;e molekulare Komplexe als f&uuml;r einzelne Lipide ausgepr&auml;gter. &Uuml;berraschenderweise konnte die quantitative Wirkung dieser Hindernisse auf Langstrecken Lipid-Diffusion mit einem einfaches, Kontinuum-basiertes Modell der Diffusion auf eine nanostrukturierte Oberfl&auml;che genau simuliert werden; Wir beschreiben daher ein metamaterial, der die Eigenschaften der &auml;u&szlig;eren Membran lebender Zellen erfasst.

Non-Brownsche Diffusion Membran Molek&uuml;le in Nanopatterned unterst&uuml;tzt Lipid-Doppelschichten.

Spatial organization of signaling complexes is a defining characteristic of the immunological synapse (IS), but its impact on cell communication is unclear. In T cell-APC pairs, more IL-2 is produced when CD28 clusters are segregated from central supramolecular activation cluster (cSMAC)-localized CD3 and into the IS periphery. However, it is not clear in these cellular experiments whether the increased IL-2 is driven by the pattern itself or by upstream events that precipitate the patterns. In this article, we recapitulate key features of physiological synapses using planar costimulation arrays containing antibodies against CD3 and CD28, surrounded by ICAM-1, created by combining multiple rounds of microcontact printing on a single surface. NaÃ¯ve T cells traverse these arrays, stopping at features of anti-CD3 antibodies and forming a stable synapse. We directly demonstrate that presenting anti-CD28 in the cell periphery, surrounding an anti-CD3 feature, enhances IL-2 secretion by naÃ¯ve CD4(+) T cells compared with having these signals combined in the center of the IS. This increased cytokine production correlates with NF-kappaB translocation and requires PKB/Akt signaling. The ability to arbitrarily and independently control the locations of anti-CD3 and anti-CD28 offered the opportunity to examine patterns not precisely attainable in cell-cell interfaces. With these patterns, we show that the peripheral presentation of CD28 has a larger impact on IL-2 secretion than CD3 colocalization/segregation.

Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function.

R&auml;umliche Organisation komplexe zu signalisieren ist ein charakteristisches Merkmal der der immunologischen Synapse (IS), aber seine Auswirkungen auf die Zelle Kommunikation ist unklar. T-Zell-APC paarweise, weitere Il wird erzeugt, wenn CD28-Clustern von zentralen supramolekulare Aktivierungs-Cluster (cSMAC) getrennt werden-CD3 lokalisiert und in der IS-Peripherie. Allerdings ist es in diesen zellul&auml;ren Experimenten unklar, ob die erh&ouml;hte IL getrieben wird, indem das Muster selbst oder upstream-Ereignisse, die die Muster auszuf&auml;llen. In diesem Artikel wir rekapitulieren Hauptmerkmale von physiologischen Synapsen mit planaren Costimulation Arrays enth&auml;lt Antik&ouml;rper gegen CD3 und CD28, umgeben von ICAM-1, erstellt durch die Kombination mehrere Wahlrunden Microcontact Drucken auf einer einzigen Oberfl&auml;che. Na&iuml;ve T-Zellen durchlaufen diese Arrays, Halt an Funktionen von Anti-CD3-Antik&ouml;rper und bilden eine stabile Synapse. Wir zeigen direkt, dass Anti-CD28 in der Peripherie der Zelle pr&auml;sentiert, rund um eine Anti-CD3-Funktion, Il Sekretion von naiv-CD4(+) T-Zellen im Vergleich mit diesen Signalen kombiniert in der Mitte der vs verbessert. Dies erh&ouml;ht Cytokine Produktion korreliert mit NF-KappaB Translokation und erfordert PKB/Akt zu signalisieren. Die F&auml;higkeit, willk&uuml;rlich und unabh&auml;ngig voneinander steuern die Speicherorte der Anti-CD3 und Anti-CD28 bot die M&ouml;glichkeit, Muster nicht gerade erreichbar in Zell-Zell-Schnittstellen zu pr&uuml;fen. Mit diesen Mustern zeigen wir, dass die periphere Pr&auml;sentation von CD28 einen gr&ouml;&szlig;eren Einfluss auf Il Sekretion als CD3 Kolokalisation/Trennung hat.

Micropatterning kostimulatorischen Liganden erh&ouml;ht CD4 + T-Zelle-Funktion.

The lateral mobility of cell membranes plays an important role in cell signaling, governing the rate at which embedded proteins can interact with other biomolecules. The past two decades have seen a dramatic transformation in understanding of this environment, as the mechanisms and potential implications of nanoscale structure of these systems has become accessible to theoretical and experimental investigation. In particular, emerging micro- and nano-scale fabrication techniques have made possible the direct manipulation of model membranes at the scales relevant to these biological processes. This review focuses on recent advances in nanopatterning of supported lipid bilayers, capturing the impact of membrane nanostructure on molecular diffusion and providing a powerful platform for further investigation of the role of this spatial complexity on cell signaling.

Capturing the nanoscale complexity of cellular membranes in supported lipid bilayers.

Die seitliche Beweglichkeit der Zellmembranen spielt eine wichtige Rolle in der Zelle signalisieren, EZB die Rate, in der eingebettete Proteine mit anderen Biomolek&uuml;len interagieren k&ouml;nnen. Die letzten zwei Jahrzehnten haben gesehen, dass ein dramatischer Wandel im Verst&auml;ndnis dieser Umgebung, wie die Mechanismen und die potenziellen Auswirkungen der Nanostruktur dieser Systeme f&uuml;r theoretische und experimentelle Untersuchung zug&auml;nglich geworden ist. Insbesondere haben Schwellenl&auml;nder Mikro und Nano-Ma&szlig;stab Fertigungstechniken die direkte Manipulation der Modell-Membranen im Massstab f&uuml;r diese biologische Prozesse erm&ouml;glicht. Diesen Bericht konzentriert sich auf die j&uuml;ngsten Fortschritte in der Nanopatterning der unterst&uuml;tzten Lipid-Doppelschichten, Erfassung der Auswirkungen der Membran Nanostruktur auf molekulare Diffusion und eine leistungsf&auml;hige Plattform f&uuml;r die weitere Untersuchung der Rolle dieser r&auml;umliche Komplexit&auml;t auf Zelle signalisieren.

Erfassung der nanoskaligen Komplexit&auml;t der Zellmembranen in unterst&uuml;tzten Lipid-Doppelschichten.

Supported lipid bilayers capture the fluidity and chemical properties of cellular membranes. In this report, we introduce a method for creating surfaces that contain multiple, aligned regions of supported membranes of different compositions at scales of micrometers and smaller. This method uses the design of a diffusional barrier to increase the resolution that can be achieved directly using traditional bilayer patterning techniques, such as laminar flow. We demonstrate the use of this platform for presenting ligands to the T Cell Receptor and LFA-1 that are tethered to separate, closely juxtaposed regions of bilayer, capturing an important aspect of the natural organization observed between T cells and Antigen Presenting Cells. Our results present a novel platform for the study of spatial separation of extracellular ligands and its impact on cell signals.

Self-aligned supported lipid bilayers for patterning the cell-substrate interface.

Unterst&uuml;tzte Lipid-Doppelschichten erfassen die Fluidit&auml;t und chemische Eigenschaften der Zellmembranen. In diesem Bericht stellen wir eine Methode f&uuml;r das Erstellen von Oberfl&auml;chen, die enthalten mehrere Regionen unterst&uuml;tzten Membranen verschiedene Kompositionen auf Skalen Mikrometer und kleinere ausgerichtet. Diese Methode verwendet das Design der Diffusionsprozess Barriere, um die Aufl&ouml;sung zu erh&ouml;hen, die direkt mit traditionellen Techniken wie Laminare Str&ouml;mung Musterung Bilayer erreicht werden k&ouml;nnen. Wir demonstrieren die Verwendung dieser Plattform f&uuml;r die Pr&auml;sentation von Liganden mit den T-Zell-Rezeptor und LFA-1, die auf separaten, eng benachbarten Regionen Bilayer, angebunden sind erfassen einen wichtigen Aspekt der nat&uuml;rlichen Organisation zwischen T-Zellen und Antigen pr&auml;sentiert Zellen beobachtet. Unsere Ergebnisse pr&auml;sentieren eine neuartige Plattform f&uuml;r das Studium der r&auml;umlichen Trennung der extrazellul&auml;ren Liganden und seine Auswirkungen auf Zelle Signale.

Self-Aligned unterst&uuml;tzte Lipid-Doppelschichten f&uuml;r Musterung der Zelle-Substrat-Schnittstelle.

Assembly of functional neural circuits relies on the ability of axons to navigate a complex landscape of guidance cues in the extracellular environment. In this report, we investigate localized cell signaling in response to these cues by combining a microfabricated compartmentalization chamber with multicomponent, protein-micropatterned surfaces; this system offers improved spatial resolution and new capabilities for targeted manipulation of neuronal axons. We illustrate the potential of this system by addressing the role of fibroblast growth factor receptor (FGFR) signaling in modulating axon guidance by N-cadherin. Motor neurons that were derived from embryonic stem cells extend axons from one compartment through a microchannel barrier and into a second compartment containing patterns of N-cadherin, against a background of laminin. N-cadherin was effective in both guiding and accelerating motor axon outgrowth. Using the chamber system to target the application of pharmacological agents to specific parts of the neuron, we demonstrate that FGFR signaling in the axon but not the cell body increases the rate of axon outgrowth while not affecting guidance along N-cadherin. These results demonstrate that cell signaling must take into account the spatial layout of the cell. This new platform provides a powerful tool for understanding such effects over a wide range of signaling systems.

Combined microfluidics/protein patterning platform for pharmacological interrogation of axon pathfinding.

Montage von funktionalen neuronale Schaltkreise st&uuml;tzt sich auf die F&auml;higkeit der Axone eine komplexe Landschaft der Anleitung Cues in der extrazellul&auml;ren Umgebung navigieren. In diesem Bericht untersuchen wir lokalisierte Zelle signalisieren in Reaktion auf diese Hinweise durch die Kombination einer Microfabricated Untergliederung Kammer mit Mehrkomponenten, Protein-Micropatterned Oberfl&auml;chen; Dieses System bietet verbesserte r&auml;umliche Aufl&ouml;sung und neue Funktionen f&uuml;r gezielte Manipulation der neuronalen Axone. Wir zeigen das Potenzial dieses Systems durch die Rolle des Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (FGFR-bedingten) signalisieren in den modulierenden Axon Anleitung durch N-Cadherin-Adressierung. Motoneuronen, die aus embryonalen Stammzellen abgeleitet wurden erweitern Axone ein Fach durch eine Microchannel-Barriere und in einem zweiten Fach, Muster von N-Cadherin, vor dem Hintergrund einer Laminin enthalten. N-Cadherin war in F&uuml;hrung und Beschleunigung der motorischen Axon Auswuchs wirksam. Verwenden das Kammer-System, um die Anwendung der pharmakologische Agenten auf bestimmte Teile des Neurons verweisen, zeigen wir, dass FGFR-bedingten signalisieren in den Axon aber nicht Zellk&ouml;rper die Rate der Axon Auswuchs erh&ouml;ht w&auml;hrend der F&uuml;hrung auf N-Cadherin nicht zu beeintr&auml;chtigen. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zelle signalisieren die r&auml;umliche Anordnung der Zelle ber&uuml;cksichtigen muss. Diese neue Plattform bietet ein leistungsf&auml;higes Werkzeug f&uuml;r das Verst&auml;ndnis dieser Wirkungen &uuml;ber einer breiten Strecke der signalisierende Systeme.

Kombinierte Mikrofluidik/Protein Musterung Plattform f&uuml;r pharmakologische Befragung des Axon Pathfinding.

T lymphocytes are a key regulatory component of the adaptive immune system. Understanding how the micro- and nano-scale details of the extracellular environment influence T cell activation may have wide impact on the use of T cells for therapeutic purposes. In this article, we examine how the micro- and nano-scale presentation of ligands to cell surface receptors, including microscale organization and nanoscale mobility, influences the activation of T cells. We extend these studies to include the role of cell-generated forces, and the rigidity of the microenvironment, on T cell activation. These approaches enable delivery of defined signals to T cells, a step toward understanding the cell-cell communication in the immune system, and developing micro/nano- and material- engineered systems for tailoring immune responses for adoptive T cell therapies.

Nanoengineering of Immune Cell Function.

T-Lymphozyten sind eine wichtige regulatorische Komponente des adaptiven Immunsystems. Verstehen, wie die Mikro- und Nano-Ma&szlig;stab-Details der extrazellul&auml;ren Umwelt T-ZELLAKTIVIERUNG beeinflussen kann breit zur Nutzung von T-Zellen f&uuml;r therapeutische Zwecke auswirken. In diesem Artikel untersuchen wir, wie die Mikro- und Nano-Ma&szlig;stab-Pr&auml;sentation des Liganden zu Handy-Oberfl&auml;che Rezeptoren, einschlie&szlig;lich Microscale Organisation und nanoskaligen Mobilit&auml;t, die Aktivierung von T-Zellen beeinflusst. Wir erweitern diese Studien auf die Rolle der Zelle erzeugten Kr&auml;fte und die Starrheit der Mikroumgebung auf T-Zell-Aktivierung. Diese Ans&auml;tze erm&ouml;glichen die Lieferung von definierten Signalen an T-Zellen, einen Schritt in Richtung die Zell-Zell-Kommunikation im Immunsystem zu verstehen und die Entwicklung von Mikro-/Nano- und Material - Systeme f&uuml;r das N&auml;hen der Immunantworten f&uuml;r adoptiven T-Zell-Therapien entwickelt.

Nanoengineering Immunzellen Funktion.

Formation of functional motor circuits relies on the ability of distinct spinal motor neuron subtypes to project their axons with high precision to appropriate muscle targets. While guidance cues contributing to motor axon pathfinding have been identified, the intracellular pathways underlying subtype-specific responses to these cues remain poorly understood. In particular, it remains controversial whether responses to axon guidance cues depend on axonal protein synthesis. Using a growth cone collapse assay, we demonstrate that mouse embryonic stem cell-derived spinal motor neurons (ES-MNs) respond to ephrin-A5, Sema3f, and Sema3a in a concentration-dependent manner. At low doses, ES-MNs exhibit segmental or subtype-specific responses, while this selectivity is lost at higher concentrations. Response to high doses of semaphorins and to all doses of ephrin-A5 is protein synthesis independent. In contrast, using microfluidic devices and stripe assays, we show that growth cone collapse and guidance at low concentrations of semaphorins rely on local protein synthesis in the axonal compartment. Similar bimodal response to low and high concentrations of guidance cues is observed in human ES-MNs, pointing to a general mechanism by which neurons increase their repertoire of responses to the limited set of guidance cues involved in neural circuit formation.

Concentration-dependent requirement for local protein synthesis in motor neuron subtype-specific response to axon guidance cues.

Bildung von funktionalen motor Schaltungen beruht auf der M&ouml;glichkeit verschiedene spinal Motoneuron Untertypen, deren Axone mit hoher Pr&auml;zision zu entsprechenden Muskel-Ziele Projekt. W&auml;hrend Anleitung Hinweise zur motorischen Axon Pathfinding identifiziert wurden, bleiben die intrazellul&auml;ren Bahnen zugrunde liegenden Subtyp-spezifische Reaktionen auf diese Hinweise weitgehend unverstanden. Insbesondere bleibt jedoch umstritten, ob Antworten zu Axon Anleitung Hinweise axonale Proteinsynthese abh&auml;ngen. Mit einem Wachstum Kegel Zusammenbruch Assay, zeigen wir, dass Maus embryonale Stammzellen Cell-derived spinalen Motorneuronen (ES-MNs) und Ephrin-A5, Sema3f und Sema3a Konzentration-abh&auml;ngigen reagieren. Bei niedrigen Dosen zeigen ES-MNs segmentale oder Untertyp-spezifische Antworten, w&auml;hrend diese Selektivit&auml;t verloren bei h&ouml;heren Konzentrationen. Reaktion auf hohe Dosen von Semaphorins und alle Dosen von Ephrin-A5 ist Proteinsynthese unabh&auml;ngig. Im Gegensatz dazu zeigen verwenden, Microfluidic Vorrichtungen und Streifen-Assays, wir, dass Wachstumskegel reduzieren und Anleitung bei niedrigen Konzentrationen des Semaphorins verlassen sich auf lokale Proteinsynthese im axonale Fach. &Auml;hnliche Bimodale Reaktion auf niedrige und hohe Konzentrationen der Anleitung Cues wird beobachtet, in menschlichen ES-MNs, auf ein allgemeiner Mechanismus durch den Neuronen erh&ouml;hen Sie ihr Repertoire von Antworten auf die begrenzten Satz der Anleitung Cues neuralen Schaltkreis Bildung beteiligt.

Article	Year
Local presentation of L1 and N-cadherin in multicomponent, microscale patterns differentially direct neuron function in vitro. Developmental neurobiology\| PubMed ID: 17659593	2007
Non-Brownian diffusion of membrane molecules in nanopatterned supported lipid bilayers. Nano letters\| PubMed ID: 18205424	2008
Micropatterning of costimulatory ligands enhances CD4+ T cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 18505845	2008
Capturing the nanoscale complexity of cellular membranes in supported lipid bilayers. Journal of structural biology\| PubMed ID: 19500676	2009
Self-aligned supported lipid bilayers for patterning the cell-substrate interface. Journal of the American Chemical Society\| PubMed ID: 19708648	2009
Combined microfluidics/protein patterning platform for pharmacological interrogation of axon pathfinding. Lab on a chip\| PubMed ID: 20358107	2010
Nanoengineering of Immune Cell Function. Materials Research Society symposia proceedings. Materials Research Society\| PubMed ID: 21562611	2009
Concentration-dependent requirement for local protein synthesis in motor neuron subtype-specific response to axon guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience\| PubMed ID: 22279234	2012

Lance C. Kam

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