polymer-microarrays-for-high-throughput-discovery-of-biomaterials

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

In gram-negative bacterial pathogens, such as Pseudomonas aeruginosa and Yersinia pseudotuberculosis, cell-to-cell communication via the N-acylhomoserine lactone (AHL) signal molecules is involved in the cell population density-dependent control of genes associated with virulence. This phenomenon, termed quorum sensing, relies upon the accumulation of AHLs to a threshold concentration at which target structural genes are activated. By using biosensors capable of detecting a range of AHLs we observed that, in cultures of Y. pseudotuberculosis and P. aeruginosa, AHLs accumulate during the exponential phase but largely disappear during the stationary phase. When added to late-stationary-phase, cell-free culture supernatants of the respective pathogen, the major P. aeruginosa [N-butanoylhomoserine lactone (C4-HSL) and N-(3-oxododecanoyl)homoserine lactone (3-oxo-C12-HSL)] and Y. pseudotuberculosis [N-(3-oxohexanoyl)homoserine lactone (3-oxo-C6-HSL) and N-hexanoylhomoserine lactone (C6-HSL)] AHLs were inactivated. Short-acyl-chain compounds (e.g., C4-HSL) were turned over more extensively than long-chain molecules (e.g., 3-oxo-C12-HSL). Little AHL inactivation occurred with cell extracts, and no evidence for inactivation by specific enzymes was apparent. This AHL turnover was discovered to be due to pH-dependent lactonolysis. By acidifying the growth media to pH 2.0, lactonolysis could be reversed. By using carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy, we found that the ring opening of homoserine lactone (HSL), N-propionyl HSL (C3-HSL), and C4-HSL increased as pH increased but diminished as the N-acyl chain was lengthened. At low pH levels, the lactone rings closed but not via a simple reversal of the ring opening reaction mechanism. Ring opening of C4-HSL, C6-HSL, 3-oxo-C6-HSL, and N-octanoylhomoserine lactone (C8-HSL), as determined by the reduction of pH in aqueous solutions with time, was also less rapid for AHLs with more electron-donating longer side chains. Raising the temperature from 22 to 37 degrees C increased the rate of ring opening. Taken together, these data show that (i) to be functional under physiological conditions in mammalian tissue fluids, AHLs require an N-acyl side chain of at least four carbons in length and (ii) that the longer the acyl side chain the more stable the AHL signal molecule.

N-acylhomoserine lactones undergo lactonolysis in a pH-, temperature-, and acyl chain length-dependent manner during growth of Yersinia pseudotuberculosis and Pseudomonas aeruginosa.

N-Acylhomoserinlactone unterziehen lactonolysis in einem pH-Wert-, Temperatur-und Acylkettenl&#xE4;nge-abh&#xE4;ngigen Weise w&#xE4;hrend des Wachstums von Yersinia pseudotuberculosis und Pseudomonas aeruginosa.

The Yersinia enterocolitica LuxI homologue YenI directs the synthesis of N-3-(oxohexanoyl)homoserine lactone (3-oxo-C6-HSL) and N-hexanoylhomoserine lactone (C6-HSL). In a Y. enterocolitica yenI mutant, swimming motility is temporally delayed while swarming motility is abolished. Since both swimming and swarming are flagellum dependent, we purified the flagellin protein from the parent and yenI mutant. Electrophoresis revealed that in contrast to the parent strain, the yenI mutant grown for 17 h at 26 degrees C lacked the 45-kDa flagellin protein FleB. Reverse transcription-PCR indicated that while mutation of yenI had no effect on yenR, flhDC (the motility master regulator) or fliA (the flagellar sigma factor) expression, fleB (the flagellin structural gene) was down-regulated. Since 3-oxo-C6-HSL and C6-HSL did not restore swimming or swarming in the yenI mutant, we reexamined the N-acylhomoserine lactone (AHL) profile of Y. enterocolitica. Using AHL biosensors and mass spectrometry, we identified three additional AHLs synthesized via YenI: N-(3-oxodecanoyl)homoserine lactone, N-(3-oxododecanoyl)homoserine lactone (3-oxo-C12-HSL), and N-(3-oxotetradecanoyl)homoserine lactone. However, none of the long-chain AHLs either alone or in combination with the short-chain AHLs restored swarming or swimming in the yenI mutant. By investigating the transport of radiolabeled 3-oxo-C12-HSL and by introducing an AHL biosensor into the yenI mutant we demonstrate that the inability of exogenous AHLs to restore motility to the yenI mutant is not related to a lack of AHL uptake. However, both AHL synthesis and motility were restored by complementation of the yenI mutant with a plasmid-borne copy of yenI.

Quorum sensing in Yersinia enterocolitica controls swimming and swarming motility.

Yersinia Enterocolitica LuxI Homolog YenI leitet die Synthese von N - 3-(Oxohexanoyl)-Homoserin-lacton (3-Oxo-C6-HSL) und N-Hexanoylhomoserine-lacton (C6-HSL). In Y. Enterocolitica YenI Mutanten wird das Schwimmen Motilit&auml;t zeitlich verz&ouml;gert, w&auml;hrend Ausschw&auml;rmen Motilit&auml;t abgeschafft wird. Da sowohl Schwimmen und schw&auml;rmen Kutscherpeitschennatter angewiesen sind, gereinigt wir das Flagellin-Protein aus den &uuml;bergeordneten und YenI Mutanten. Elektrophorese ergab, dass im Gegensatz zu der Stammkultur, die YenI-Mutant angebaut f&uuml;r 17 h bei 26 Grad C das Flagellin-45-kDa-Protein FleB fehlte. Reverse Transkription-PCR zeigte, dass w&auml;hrend der Mutation von YenI hatte keinen Einfluss auf YenR, FlhDC (der Motilit&auml;t master Regler) oder FliA (die Flimmerband Sigma-Faktor) Ausdruck, FleB (die Flagellin-Structural-Gen) unten-geregelt. Da 3-Oxo-C6-HSL und C6-HSL nicht schwimmen oder in der YenI-Mutant Ausschw&auml;rmen wiederhergestellt, &uuml;berpr&uuml;ft wir das N-Acylhomoserine-lacton (AHL)-Profil von Y. Enterocolitica. Mit AHL-Biosensoren und Massenspektrometrie, wir identifizierten drei zus&auml;tzliche AHLs synthetisiert &uuml;ber YenI: Homoserin lacton N-(3-Oxodecanoyl), N (3-Oxododecanoyl)-Homoserin lacton (3-Oxo-C12-HSL) und N (3-Oxotetradecanoyl)-Homoserin-lacton. Jedoch wiederhergestellt keines der langkettigen AHLs entweder allein oder in Kombination mit der kurzkettigen AHLs, schw&auml;rmen oder Schwimmen in der YenI-Mutant. Durch die Untersuchung des Transport von radioaktive 3-Oxo-C12-HSL und durch die Einf&uuml;hrung einer AHL-Biosensor in der YenI-Mutant zeigen wir, dass die Unf&auml;higkeit der exogenen AHLs Motilit&auml;t in der YenI-Mutant wiederherstellen nicht mit mangelnder AHL-Aufnahme. Jedoch waren sowohl die AHL-Synthese als auch die Motilit&auml;t durch Erg&auml;nzung von der YenI-Mutant mit einem Plasmid &uuml;bertragene Kopie der YenI wiederhergestellt.

Quorum sensing in Yersinia Enterocolitica steuert Schwimmen und schw&auml;rmen Motilit&auml;t.

A method for the comprehensive profiling of the N-acylhomoserine lactone (AHL) family of bacterial quorum-sensing molecules is presented using liquid chromatography (LC) coupled to hybrid quadrupole-linear ion trap (QqQLIT) mass spectrometry. Information-dependent acquisition (IDA), using triggered combinations of triple-quadrupole and linear ion trap modes in the same LC-MS/MS run, was used to simultaneously screen, quantify and identify multiple AHLs in a single sample. This MS method uses common AHL fragment ions attributed to the homoserine moiety and the 3-oxo-, 3-hydroxy- or unsubstituted acyl side chains, to identify unknown AHLs in cell-free culture supernatants in an unbiased manner. This LC-MS technique was applied to determine the relative molar ratios of AHLs produced by Yersinia pseudotuberculosis and the consequences of inactivating by mutation either or both of the AHL synthase genes (ypsI and ytbI) on AHL profile and concentration. The Y. pseudotuberculosis wild type but not the ypsI ytbI double mutant produced at least 24 different AHLs with acyl chains ranging from C4 to C15 with or without 3-oxo or 3-hydroxy substituents. YtbI, in contrast to YpsI, could direct the synthesis of all of the AHLs identified. The most abundant and hence most biologically relevant Y. pseudotuberculosis AHLs were found to be the 3-oxo-substituted C6, C7 and C8 AHLs and the unsubstituted C6 and C8 compounds. The LC-QqQLIT methodology is broadly applicable to quorum-sensing signal molecule analysis and can provide comprehensive AHL profiles and concentrations from a single sample and simultaneously collect confirmatory spectra for each AHL identified.

Comprehensive profiling of N-acylhomoserine lactones produced by Yersinia pseudotuberculosis using liquid chromatography coupled to hybrid quadrupole-linear ion trap mass spectrometry.

Eine Methode f&uuml;r die umfassende Profilerstellung f&uuml;r die Familie der N-Acylhomoserine-lacton (AHL) bakteriellen Quorum-sensing-Molek&uuml;le ist pr&auml;sentiert mit der Fl&uuml;ssigchromatographie (LC), gekoppelt mit Massenspektrometrie der Hybrid-lineare Quadrupole Ionenfalle (QqQLIT). Informationen-abh&auml;ngige Erwerb (IDA), mit ausgel&ouml;ste Kombinationen von Triple-Quadrupol und lineare Ionenfalle Modi der gleichen LC-MS/MS laufen, wurde verwendet, um gleichzeitig Bildschirm, zu quantifizieren und zu mehreren AHLs in einer einzigen Probe zu identifizieren. Diese MS-Methode verwendet gemeinsame AHL-Fragment-Ionen zur&uuml;ckzuf&uuml;hren auf die Homoserin-Gruppe und die 3 - Oxo-, 3-hydroxy- oder nichtsubstituierter Acil Seitenketten, um unbekannte AHLs in zellfreien Gewebekultursupernatants auf unvoreingenommene Weise zu identifizieren. Diese LC-MS-Technik wurde angewendet, um festzustellen, dass die relative molare Verh&auml;ltnisse von AHLs von Yersinia Pseudotuberculosis und die Folgen der Abt&ouml;tung durch Mutation eine oder beide der AHL Synthase Gene (YpsI und YtbI) auf AHL-Profil und Konzentration produziert. Die Y. Pseudotuberculosis Wildtyp aber nicht die YpsI YtbI Doppel Mutant produziert mindestens 24 verschiedene AHLs mit Acil Ketten von bis C4 C15 mit oder ohne 3-Oxo- oder 3-hydroxy-Substituenten. YtbI, im Gegensatz zu YpsI, konnte die Synthese aller von der AHLs identifiziert vorhanden. Die h&auml;ufigste und somit biologisch relevanten Y. Pseudotuberculosis AHLs fanden sich die 3-Oxo-substituierte C6, C7 und C8 AHLs und die nicht substituierte C6 und C8-Verbindungen sein. Die LC-QqQLIT-Methodik gilt weitgehend f&uuml;r Quorum-sensing-Molek&uuml;l Signalanalyse und bieten umfassende AHL-Profile und Konzentrationen von einer einzigen Probe und sammeln Sie gleichzeitig best&auml;tigende Spektren f&uuml;r jede AHL identifiziert.

Umfassende Profilierung von N-Acylhomoserine Lactone produziert von Yersinia Pseudotuberculosis mit Fl&uuml;ssigkeitschromatographie gekoppelt mit Hybrid-lineare Quadrupole Ionenfalle-Massenspektrometrie.

Quorum sensing (QS) in Yersinia pseudotuberculosis involves two pairs of LuxRI orthologues (YpsRI and YtbRI) and multiple N-acylhomoserine lactones (AHLs). In a ypsI/ytbI mutant, AHL synthesis was abolished, unaffected in a ypsR/ytbR double mutant and substantially reduced in a ypsI/ytbR mutant, indicating that neither YpsR nor YtbR is essential for AHL synthesis. To determine the interrelationship between YpsRI and YtbRI we constructed chromosomal lux-promoter fusions to ypsR, ypsI, ytbR and ytbI and examined their expression in each of the QS mutant backgrounds. The YpsRI system negatively autoregulates itself but positively regulates the expression of the ytbRI system whereas the ytbRI system is positively autoregulated but only at the level of ytbI expression. YtbRI does not control expression of ypsR or ypsI. This hierarchical QS system controls swimming motility via regulation of flhDC and fliA. The AHLs synthesized via YtbI play a dual role, activating flhDC, in conjunction with YpsR but repressing fliA in conjunction with YtbR and YpsR. In liquid and plate assays, the early onset of motility observed in ypsR and ypsI mutants was abolished in ytbI, ytbR ypsI/ytbI, ypsR/ytbR mutants, indicating that QS regulates motility both positively (via YtbRI) and negatively (via YpsRI).

Functional interplay between the Yersinia pseudotuberculosis YpsRI and YtbRI quorum sensing systems modulates swimming motility by controlling expression of flhDC and fliA.

Quorum sensing (QS) in Yersinia Pseudotuberculosis umfasst zwei Paare von LuxRI Orthologues (YpsRI und YtbRI) und mehrere N-Acylhomoserine-Lactone (AHLs). AHL-Synthese war eine Mutante YpsI/YtbI abgeschafft, in eine YpsR/YtbR-Doppel-Mutante unber&uuml;hrt und stark reduzierten in ein YpsI/YtbR-Mutant, der darauf hinweist, dass weder YpsR noch YtbR f&uuml;r AHL Synthese wichtig. Die Wechselbeziehung zwischen YpsRI und YtbRI bestimmen wir chromosomalen Lux-Projekttr&auml;ger Fusionen und YpsR, YpsI, YtbR und YtbI konstruiert und untersucht ihren Ausdruck in jedem der QS mutant Hintergr&uuml;nde. Das YpsRI-System negativ Autoregulates selbst aber positiv reguliert den Ausdruck des YtbRI Systems, w&auml;hrend das YtbRI-System Autoregulated aber nur auf der Ebene der YtbI Ausdruck positiv ist. YtbRI kontrolliert nicht Ausdruck der YpsR oder YpsI. Diese hierarchische QS-System steuert Schwimmen Motilit&auml;t &uuml;ber Regulierung von FlhDC und FliA. Die AHLs synthetisiert &uuml;ber YtbI spielen eine Doppelrolle, Aktivierung der FlhDC, in Verbindung mit YpsR, sondern Unterdr&uuml;ckung FliA in Verbindung mit YtbR und YpsR. In Fl&uuml;ssigkeit und Teller-Assays, die fr&uuml;h einsetzende Motilit&auml;t beobachtet in YpsR und YpsI Mutanten wurde abgeschafft YtbI, YtbR YpsI/YtbI, YpsR/YtbR-Mutanten, die darauf hinweist, dass QS regelt Motilit&auml;t positiv (&uuml;ber YtbRI) und negativ (&uuml;ber YpsRI).

Funktionale Zusammenspiel der Yersinia Pseudotuberculosis YpsRI und YtbRI Quorum sensing Systems moduliert Motilit&auml;t schwimmen durch die Kontrolle der Expression von FlhDC und FliA.

Wir beschreiben hier die Funktionelle Charakterisierung des Gens FlgM in Yersinia Pseudotuberculosis. Direkte Interaktion der FlgM mit der alternative Sigma-Faktor-sigma(28) (FliA) wurde erstmals offiziell best&auml;tigt. Eine konservierte Region in der C-Terminus von FlgM wurde gefunden, die die sigma(28) bindende Dom&auml;ne enthalten. Durch Site-verwiesene Mutagenese, bakterielle-zwei-Hybrid-Analyse und Westliches Beflecken waren die prim&auml;ren FlgM-Bindungsstellen mit sigma(28) gezeigt, Ile85, Ala86 und Leu89. Eine Rolle f&uuml;r FlgM Schwimmen Motilit&auml;t zeigte Inaktivierung von FlgM und sp&auml;tere Erg&auml;nzung in Trans Transcriptional Verschmelzung Analysen zeigten differenzielle Genexpression von FlhDC, FliA, FlgM und ein Video in die FliA und FlgM Mutanten, die gegen&uuml;ber dem Wildtyp. FlhDC Ausdruck wurde nicht von sigma(28) oder FlgM beeinflusst, w&auml;hrend FliA Ausdruck war in der FliA-Mutant abgeschafft und den FlgM-Mutanten im Vergleich zu den Wildtyp, darauf hinweist, dass FliA und FlgM FliA Transkription aktivieren kann betr&auml;chtlich zur&uuml;ckgegangen. Im Gegensatz dazu lag FlgM Transkription in den FliA Mutanten im Vergleich zu den Wildtyp, was darauf hindeutet, dass FlgM Transkription von sigma(28) unterdr&uuml;ckt wurde. Interessanterweise wurde FliC Ausdruck in der FlgM-Mutant, was auf eine negative Rolle f&uuml;r FlgM in FliC Ausdruck deutlich erh&ouml;ht. Die Transkription anderer Gene des Sigma-abh&auml;ngige (kauen, FlgD, FlaA, CsrA und FliZ) wurde auch in FliA gepr&uuml;ft und FlgM mutant Hintergr&uuml;nde und dies ergab, dass andere Sigma-Faktoren au&szlig;er sigma(28) Flimmerband Biogenese in Y. Pseudotuberculosis beteiligt sein k&ouml;nnen. Zusammengenommen die Motilit&auml;t Ph&auml;notypen und die Auswirkungen der FlgM Mutation zur Regulierung dieser wichtigen Motilit&auml;t-Gene, schlagen wir vor, dass die Regulierungsmechanismen Flimmerband Biogenese in Y. Pseudotuberculosis von denen f&uuml;r andere Bakterien beschriebenen abweichen k&ouml;nnen.

Funktionelle Charakterisierung der FlgM bei der Regulierung der Flimmerband Synthese und Motilit&auml;t in Yersinia Pseudotuberculosis.

We describe here the functional characterization of the flgM gene in Yersinia pseudotuberculosis. Direct interaction of FlgM with the alternative sigma factor sigma(28) (FliA) was first confirmed. A conserved region in the C-terminus of FlgM was found which included the sigma(28) binding domain. By site-directed mutagenesis, bacterial two-hybrid analysis and Western blotting, the primary FlgM binding sites with sigma(28) were shown to be Ile85, Ala86 and Leu89. A role for FlgM in swimming motility was demonstrated by inactivation of flgM and subsequent complementation in trans. Transcriptional fusion analyses showed differential gene expression of flhDC, fliA, flgM and fliC in the fliA and flgM mutants compared with the wild-type. flhDC expression was not influenced by sigma(28) or FlgM while fliA expression was abolished in the fliA mutant and considerably reduced in the flgM mutant when compared to the wild-type, indicating that both FliA and FlgM can activate fliA transcription. Conversely, flgM transcription was higher in the fliA mutant when compared to the wild-type, suggesting that flgM transcription was repressed by sigma(28). Interestingly, fliC expression was markedly increased in the flgM mutant, suggesting a negative regulatory role for FlgM in fliC expression. The transcription of other sigma-dependent genes (cheW, flgD, flaA, csrA and fliZ) was also examined in fliA and flgM mutant backgrounds and this revealed that other sigma-factors apart from sigma(28) may be involved in flagellar biogenesis in Y. pseudotuberculosis. Taking together the motility phenotypes and effects of flgM mutation on the regulation of these key motility genes, we propose that the mechanisms regulating flagellar biogenesis in Y. pseudotuberculosis may differ from those described for other bacteria.

Functional characterization of FlgM in the regulation of flagellar synthesis and motility in Yersinia pseudotuberculosis.

Yersinia pseudotuberculosis is an enteric bacterium which must overcome the acidic stress in host organs for successful colonization, but how this bacterium survives in acidic conditions remains largely unknown. In the present study, the importance of OmpR in acid survival of Y. pseudotuberculosis YpIII was confirmed by the fact that mutation of ompR (strain DeltaompR) greatly reduced cell survival at pH 4.5 or lower. To characterize the regulatory role of OmpR in this acid survival process, proteomic analysis was carried out to compare YpIII at pH 7.0 and pH 4.5 with DeltaompR at pH 7.0, and urease components were revealed to be the main targets for OmpR regulation. Addition of urea to the culture medium also enhanced acid survival of YpIII but not DeltaompR and urease activity was significantly induced by acid in YpIII but not in DeltaompR. Each of the seven components of the YpIII urease gene cluster was fused to a lacZ reporter and their expression was dramatically decreased in a DeltaompR background; this supports the notion that OmpR positively regulates urease expression. Furthermore, gel shift analysis revealed that OmpR binds to the deduced promoter regions of three polycistronic transcriptional units (ureABC, ureEF and ureGD) in the urease cluster, suggesting that the regulation of OmpR to urease components is direct. Taken together, these data strongly suggest that OmpR activates urease expression to enhance acid survival in Y. pseudotuberculosis.

OmpR positively regulates urease expression to enhance acid survival of Yersinia pseudotuberculosis.

Yersinia Pseudotuberculosis ist ein enterisches Bakterium, das die saure Spannung in Host Organe f&uuml;r erfolgreiche Kolonisierung &uuml;berwinden muss, aber wie dieses Bakterium in sauren Bedingungen &uuml;berlebt, ist weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Studie wurde die Bedeutung von OmpR in S&auml;ure &Uuml;berleben von Y. Pseudotuberculosis YpIII durch die Tatsache best&auml;tigt, dass Mutation des OmpR (Stamm DeltaompR) Zelle &Uuml;berleben bei pH 4.5 oder unteren stark reduziert. Um die Rolle von OmpR dabei S&auml;ure &uuml;berleben zu charakterisieren, Proteomic wurden untersucht, um YpIII bei einem pH-Wert 7.0 und pH 4.5 mit DeltaompR bei pH 7.0 zu vergleichen, und Urease-Komponenten wurden offenbart das Hauptanwendungsgebiet f&uuml;r OmpR Verordnung sein. Zusatz von Harnstoff zu dem Kulturmedium auch verst&auml;rkt S&auml;ure &Uuml;berleben der YpIII aber nicht DeltaompR und Urease-Aktivit&auml;t war signifikant induziert durch S&auml;ure in YpIII aber nicht in DeltaompR. Jede der sieben Komponenten von der YpIII Urease-gen-Cluster wurde verschmolzen zu einem LacZ-Reporter und ihr Ausdruck wurde in einem DeltaompR Hintergrund dramatisch abgenommen; Dies unterst&uuml;tzt die Vorstellung, dass OmpR Urease Ausdruck positiv reguliert. Dar&uuml;ber hinaus ergab eine Analyse der Gel-Schicht, dass OmpR an den herausgef&uuml;hrten Projekttr&auml;ger-Regionen der drei Polycistronic transkriptionelle Einheiten (UreABC, UreEF und UreGD) in den Urease-Cluster bindet, was darauf hindeutet, dass die Verordnung von OmpR Urease-Komponenten direkt. Zusammen genommen, empfehlen diese Daten dringend, dass OmpR Urease Ausdruck zur Verbesserung der S&auml;ure &Uuml;berleben in Y. Pseudotuberculosis aktiviert.

OmpR regelt positiv Urease-Ausdruck, um S&auml;ure &uuml;berleben Yersinia Pseudotuberculosis zu verbessern.

N-acylhomoserine lactone (AHL) quorum-sensing molecules modulate the swimming behaviour of zoospores of the macroalga Ulva to facilitate the location of bacterial biofilms. Here we show that the intertidal surfaces colonized by Ulva are dominated by Alphaproteobacteria, particularly the Rhodobacteraceae family, and the Bacteroidetes family Flavobacteriaceae, and that this diverse assemblage both produces and degrades AHLs. N-acylhomoserine lactones could also be extracted from the surfaces of pebbles recovered from intertidal rock-pools. Bacteria representative of this assemblage were isolated and tested for the production and degradation of AHLs, and for their ability to modulate zoospore settlement at different biofilm densities. Of particular interest was a Shewanella sp. This strain produced three major AHLs (OC4, OC10 and OC12) in the late exponential phase, but the longer-chain AHLs were rapidly degraded in the stationary phase. Degradation occurred via both lactonase and amidase activity. A close relationship was found between AHL synthesis and Ulva zoospore settlement. The Shewanella isolate also interfered with AHL production by a Sulfitobacter isolate and its ability to enhance zoospore settlement in a polymicrobial biofilm. This influence on the attachment of Ulva zoospores suggests that AHL-degrading strains can affect bacterial community behaviour by interfering with quorum sensing between neighbouring bacteria. More importantly, these interactions may exert wider ecological effects across different kingdoms.

Turnover of quorum sensing signal molecules modulates cross-kingdom signalling.

N-Acylhomoserine-lacton (AHL)-Quorum-sensing-Molek&uuml;le modulieren das Schwimmen-Verhalten der Zoosporen der Macroalga Ulva den Speicherort der bakteriellen Biofilmen zu erleichtern. Hier zeigen wir, dass die intertidal Fl&auml;chen durch Ulva kolonisierten Alphaproteobacteria, &uuml;berwiegen vor allem die Rhodobacteraceae-Familie und der Bacteroides-Familie Flavobacteriaceae, und dass diese vielf&auml;ltige Gef&uuml;ge sowohl produziert und AHLs degradiert. N-Acylhomoserine Lactone k&ouml;nnte auch die Oberfl&auml;chen der Kieselsteine erholt von intertidal Fels-Pools entnommen werden. Bakterien Vertreter dieses Gef&uuml;ge wurden isoliert und getestet f&uuml;r die Produktion und Abbau von AHLs, und ihre F&auml;higkeit, Zoospore Siedlung bei verschiedenen Biofilm dichten zu modulieren. Von besonderem Interesse war eine Shewanella sp. Diese Sorte produziert drei gro&szlig;e AHLs (OC4, OC10 und OC12) in der sp&auml;ten exponentiellen Phase, aber die l&auml;ngere Kette AHLs waren in der station&auml;ren Phase rasch abgebaut. Abbau ist &uuml;ber Lactonase und Amidase Aktivit&auml;t aufgetreten. Eine enge Beziehung wurde zwischen AHL-Synthese und Ulva Zoospore Siedlung gefunden. Shewanella Isolat mischte sich auch mit AHL-Produktion durch eine isolierte Sulfitobacter und seine F&auml;higkeit, Zoospore Siedlung in einer polymikrobiellen Biofilm zu verbessern. Dieser Einfluss auf die Anlage von Ulva Zoosporen zufolge AHL-erniedrigende St&auml;mme bakterielle Gemeinschaft Verhalten beeinflussen k&ouml;nnen, durch Quorum sensing zwischen benachbarten Bakterien st&ouml;ren. Noch wichtiger ist, k&ouml;nnen diese Interaktionen gr&ouml;&szlig;eren &ouml;kologischen Effekte &uuml;ber verschiedene K&ouml;nigreiche aus&uuml;ben.

Umsatz von Quorum sensing Signalmolek&uuml;le moduliert Kreuz-K&ouml;nigreich zu signalisieren.

OmpR has been demonstrated to negatively regulate the expression of the flagellar master operon flhDC in a wide variety of bacterial species. Here we report the positive regulation of flhDC expression by OmpR in Yersinia pseudotuberculosis. A sigma(70)-dependent promoter was identified by primer extension analysis and an active region with two conserved OmpR-binding sites around the flhDC promoter was confirmed. To confirm the regulation of flhDC expression by OmpR, flhDC as well as the downstream flagellar genes fliA, flgD, flgA, flgM, fliC and flaA were fused to lacZ, and decreased expression of all these genes in an ompR mutant (Delta ompR) was detected. Furthermore, Delta ompR was defective in bacterial motility and flagella synthesis. This defect was due to the low level of expression of flhDC in Delta ompR since overproduction of FlhDC in Delta ompR restored bacterial motility. The importance of two conserved OmpR-binding sites around the flhDC promoter region in the regulation of flhDC expression by OmpR was demonstrated by the fact that mutation of either one or both sites significantly decreased the promoter activity in the wild-type but not in Delta ompR. The binding of OmpR to these two sites was also demonstrated by DNA mobility shift assay. The possible mechanism underlying this positive regulation in Y. pseudotuberculosis is discussed. To our knowledge, this is the first report to demonstrate that OmpR positively regulates flhDC expression.

Positive regulation of flhDC expression by OmpR in Yersinia pseudotuberculosis.

OmpR ist demonstriert worden, den Ausdruck der Flimmerband Meister Operon-FlhDC in einer Vielzahl von bakteriellen Spezies negativ regulieren. Hier berichten wir die positive Regulierung der FlhDC Ausdruck von OmpR in Yersinia Pseudotuberculosis. Sigma 70-abh&auml;ngige Promoter wurde durch Grundierung Erweiterung Analyse identifiziert und eine aktive Region mit zwei konservierten OmpR-Bindungsstellen um FlhDC Projekttr&auml;ger best&auml;tigt wurde. Um die Regulierung der FlhDC Ausdruck von OmpR, FlhDC sowie die nachgeschaltete Flimmerband Gene FliA best&auml;tigen, FlgD, FlgA, FlgM, FliC und FlaA zu LacZ verschmolzen waren, und verminderte Ausdruck all dieser Gene in einem OmpR Mutant (Delta OmpR) wurde erkannt. Dar&uuml;ber hinaus war Delta OmpR Defekte in bakterielle Motilit&auml;t und Flagellen-Synthese. Dieser Fehler wurde aufgrund der geringen Ausdruck des FlhDC im Delta OmpR da &Uuml;berproduktion von FlhDC in Delta OmpR bakterielle Motilit&auml;t wiederhergestellt. Die Bedeutung der zwei konservierten OmpR-Bindungsstellen rund um die FlhDC-Promotor-Region bei der Regulierung der FlhDC Ausdruck von OmpR zeigte die Tatsache, dass die Mutation einer oder beiden Seiten die Promotor-Aktivit&auml;t in der Wild-Typ jedoch nicht in Delta OmpR deutlich zur&uuml;ckgegangen. Die Bindung von OmpR auf diese beiden Seiten zeigte auch DNA Mobilit&auml;tsschichtprobe. Der m&ouml;gliche Mechanismus zugrunde liegt dieser positive Verordnung in Y. Pseudotuberculosis wird diskutiert. Unseres Wissens ist dies der erste Bericht zu zeigen, dass OmpR FlhDC Ausdruck positiv reguliert.

Positive Regulierung der FlhDC Ausdruck von OmpR in Yersinia Pseudotuberculosis.

For many years, bacterial cells were considered primarily as selfish individuals, but, in recent years, it has become evident that, far from operating in isolation, they coordinate collective behaviour in response to environmental challenges using sophisticated intercellular communication networks. Cell-to-cell communication between bacteria is mediated by small diffusible signal molecules that trigger changes in gene expression in response to fluctuations in population density. This process, generally referred to as quorum sensing (QS), controls diverse phenotypes in numerous Gram-positive and Gram-negative bacteria. Recent advances have revealed that bacteria are not limited to communication within their own species but are capable of 'listening in' and 'broadcasting to' unrelated species to intercept messages and coerce cohabitants into behavioural modifications, either for the good of the population or for the benefit of one species over another. It is also evident that QS is not limited to the bacterial kingdom. The study of two-way intercellular signalling networks between bacteria and both uni- and multicellular eukaryotes as well as between eukaryotes is just beginning to unveil a rich diversity of communication pathways.

Quorum sensing and social networking in the microbial world.

Seit vielen Jahren Bakterienzellen galten vor allem als egoistischen Individuen, aber in den letzten Jahren ist es offensichtlich, dass weit von Betrieb isoliert, sie kollektive Verhalten als Reaktion auf die &ouml;kologischen Herausforderungen, die mit anspruchsvollen interzellul&auml;re Kommunikationsnetzwerke koordinieren geworden. Zell-Zell-Kommunikation zwischen Bakterien wird vermittelt durch kleine diffusible Signalmolek&uuml;le, die Ver&auml;nderungen ausl&ouml;sen in Genexpression in Reaktion auf Schwankungen der Bev&ouml;lkerungsdichte. Dieser Proze&szlig;, allgemein bezeichnet als Quorum sensing (QS), steuert verschiedene Ph&auml;notypen in zahlreichen grampositiven und gramnegativen Bakterien. J&uuml;ngste Fortschritte haben gezeigt, dass Bakterien beschr&auml;nken sich nicht auf die Kommunikation innerhalb ihrer eigenen Spezies aber f&auml;hig &#39;h&ouml;ren&#39; und &#39;sendet&#39; nicht verwandte Arten um Nachrichten abfangen und MitbewohnerInnen in Verhaltensst&ouml;rungen &Auml;nderungen, entweder f&uuml;r das wohl der Bev&ouml;lkerung oder zugunsten einer Art &uuml;ber die andere zu zwingen. Es ist auch offensichtlich, dass QS beschr&auml;nkt sich nicht auf das bakterielle K&ouml;nigreich. Das Studium der bidirektionale interzellul&auml;re Signalgebung Netzwerke zwischen Bakterien Uni- und mehrzelligen Eukaryoten sowie zwischen Eukaryoten ist erst am Anfang, eine reiche Vielfalt von Kommunikationswegen zu enth&uuml;llen.

Quorum sensing und soziale Netzwerke in der mikrobiellen Welt.

Yersinia pseudotuberculosis forms biofilms on Caenorhabditis elegans which block nematode feeding. This genetically amenable host-pathogen model has important implications for biofilm development on living, motile surfaces. Here we show that Y. pseudotuberculosis biofilm development on C. elegans is governed by N-acylhomoserine lactone (AHL)-mediated quorum sensing (QS) since (i) AHLs are produced in nematode associated biofilms and (ii) Y. pseudotuberculosis strains expressing an AHL-degrading enzyme or in which the AHL synthase (ypsI and ytbI) or response regulator (ypsR and ytbR) genes have been mutated, are attenuated. Although biofilm formation is also attenuated in Y. pseudotuberculosis strains carrying mutations in the QS-controlled motility regulator genes, flhDC and fliA, and the flagellin export gene, flhA, flagella are not required since fliC mutants form normal biofilms. However, in contrast to the parent and fliC mutant, Yop virulon proteins are up-regulated in flhDC, fliA and flhA mutants in a temperature and calcium independent manner. Similar observations were found for the Y. pseudotuberculosis QS mutants, indicating that the Yop virulon is repressed by QS via the master motility regulator, flhDC. By curing the pYV virulence plasmid from the ypsI/ytbI mutant, by growing YpIII under conditions permissive for type III needle formation but not Yop secretion and by mutating the type III secretion apparatus gene, yscJ, we show that biofilm formation can be restored in flhDC and ypsI/ytbI mutants. These data demonstrate that type III secretion blocks biofilm formation and is reciprocally regulated with motility via QS.

Biofilm development on Caenorhabditis elegans by Yersinia is facilitated by quorum sensing-dependent repression of type III secretion.

Yersinia Pseudotuberculosis bildet Biofilmen auf Caenorhabditis Elegans Fadenwurm F&uuml;tterung blockieren. Dieses genetisch empf&auml;nglich Host-Pathogen-Modell hat wichtige Implikationen f&uuml;r Biofilm-Entwicklung auf lebendige, gekr&uuml;mmter Fl&auml;chen. Hier zeigen wir, dass Y. Pseudotuberculosis Biofilm Entwicklung von C. Elegans N-Acylhomoserine-lacton (AHL) unterliegt-vermittelten Quorum sensing (QS) da (i) AHLs produziert Fadenw&uuml;rmer Zusammenhang Biofilmen und (Ii) Y. Pseudotuberculosis St&auml;mme auszudr&uuml;cken Enzym AHL-erniedrigende oder in dem der AHL-Synthase (YpsI und YtbI) oder Antwort Regler (YpsR und YtbR) Gene mutiert worden sind, sind abgeschw&auml;cht. Obwohl Biofilm-Bildung auch in Y. Pseudotuberculosis St&auml;mme mit Mutationen in der QS-gesteuerte Motilit&auml;t Regulator Gene, FlhDC und FliA und das Flagellin-Export-gen, FlhA, abgeschw&auml;cht ist sind Flagellen nicht erforderlich, da FliC Mutanten normale Biofilme bilden. Allerdings sind im Gegensatz zu den &uuml;bergeordneten und FliC Mutant, Yop Virulon Proteine oben-geregelt im FlhDC, FliA und FlhA Mutanten auf unabh&auml;ngige Weise Temperatur und Kalzium. &Auml;hnliche Beobachtungen wurden f&uuml;r die Y. Pseudotuberculosis QS-Mutanten, die darauf hinweist, dass die Yop Virulon &uuml;ber den Meister Motilit&auml;t Spannungsregler, FlhDC von QS unterdr&uuml;ckt ist gefunden. Indem man heilt die pYV Virulenz Plasmid aus der YpsI/YtbI-Mutant, durch den Anbau von YpIII unter Bedingungen f&uuml;r Typ III permissive Nadel, Bildung aber nicht Yop Sekretion und mutiert das Typ III-Sekretion Apparat gen, YscJ, zeigen wir, dass Biofilm-Bildung in FlhDC und YpsI/YtbI Mutanten wiederhergestellt werden kann. Diese Daten zeigen, dass Typ-III-Sekretion Biofilm-Bildung blockiert und gegenseitig mit Motilit&auml;t &uuml;ber QS geregelt ist.

Biofilm-Entwicklung auf Caenorhabditis Elegans durch Yersinia wird durch Quorum sensing-abh&auml;ngige Repression des Typs III-Sekretion erleichtert.

Transcription of the 74 kb Pseudomonas fluorescens mupirocin [pseudomonic acid (PA)] biosynthesis cluster depends on quorum sensing-dependent regulation via the LuxI/LuxR homologues MupI/MupR. To facilitate analysis of novel PAs from pathway mutants, we investigated factors that affect mup gene expression. First, the signal produced by MupI was identified as N-(3-oxodecanoyl)homoserine lactone, but exogenous addition of this molecule did not activate mupirocin production prematurely nor did expression of mupI in trans increase metabolite production. Second, we confirmed that mupX, encoding an amidase/hydrolase that can degrade N-acylhomoserine lactones, is also required for efficient expression, consistent with its occurrence in a regulatory module linked to unrelated genes in P. fluorescens. Third, and most significantly, mupR expression in trans to wild type and mutants can increase production of antibiotic and novel intermediates up to 17-fold.

Manipulation of quorum sensing regulation in Pseudomonas fluorescens NCIMB 10586 to increase mupirocin production.

Transkription des 74 kb Pseudomonas Fluorescens Mupirocin [pseudomonic S&auml;ure (PA)] Biosynthese Clusters h&auml;ngt Quorum sensing-abh&auml;ngige Verordnung &uuml;ber die LuxI/LuxR Homologen MupI/MupR. Zur Erleichterung der Analyse des Romans PAs von Stoffwechselweg Mutanten untersucht wir Faktoren, die MUP-Genexpression beeinflussen. Erstens das Signal von MupI produziert wurde identifiziert als N (3-Oxodecanoyl)-Homoserin-lacton, aber exogene Erg&auml;nzung dieses Molek&uuml;ls nicht aktiviert haben Mupirocin Produktion vorzeitig noch Tat Ausdruck der MupI in Trans Metabolit Produktion zu erh&ouml;hen. Zweitens best&auml;tigt wir, dass MupX, Codierung eine Amidase/Hydrolase, die N-Acylhomoserine-Lactone, beeintr&auml;chtigt werden kann ist auch f&uuml;r effiziente Ausdruck erforderlich, mit seinem Auftreten in einem regulatorischen Modul mit unabh&auml;ngigen Gene in p. Fluorescens. Drittens, und das ist am wichtigsten erh&ouml;hen MupR Ausdruck in Trans zu Wildtyp und Mutanten Produktion von Antibiotika und neuartige Zwischenprodukte bis zu 17-fold.

Manipulation von Quorum sensing Verordnung in Pseudomonas Fluorescens NCIMB 10586 Mupirocin-Produktion zu steigern.

Zell-Zell-Kommunikation (Quorum sensing (QS)) koordiniert bakterielle Verhalten auf einer Bev&ouml;lkerung. Folglich ist das Verhalten einer nat&uuml;rlichen arten&uuml;bergreifenden Gemeinschaft vermutlich zumindest teilweise abh&auml;ngig von co-existing QS und Quorum abschrecken (QQ) Aktivit&auml;ten. Hier wollten wir neuartige N-Acylhomoserine-lacton (AHL) zu entdecken-abh&auml;ngige QS und QQ St&auml;mme durch die Untersuchung einer bakteriellen Gemeinschaft der Rhizosph&auml;re Ingwer (Zingiber Officinale) w&auml;chst im malaysischen Regenwald zugeordnet.

Charakterisierung von N-Acylhomoserine lacton-erniedrigende Bakterien zugeordnet die Rhizosph&auml;re Zingiber Officinale (Ingwer): Koexistenz von Quorum abschrecken und Quorum sensing in Acinetobacter und Burkholderia.

Cell-to-cell communication (quorum sensing (QS)) co-ordinates bacterial behaviour at a population level. Consequently the behaviour of a natural multi-species community is likely to depend at least in part on co-existing QS and quorum quenching (QQ) activities. Here we sought to discover novel N-acylhomoserine lactone (AHL)-dependent QS and QQ strains by investigating a bacterial community associated with the rhizosphere of ginger (Zingiber officinale) growing in the Malaysian rainforest.

Characterization of N-acylhomoserine lactone-degrading bacteria associated with the Zingiber officinale (ginger) rhizosphere: co-existence of quorum quenching and quorum sensing in Acinetobacter and Burkholderia.

In order to identify new virulence determinants in Y. pseudotuberculosis a comparison between its genome and that of Yersinia pestis was undertaken. This reveals dozens of pseudogenes in Y. pestis, which are still putatively functional in Y. pseudotuberculosis and may be important in the enteric lifestyle. One such gene, YPTB1572 in the Y. pseudotuberculosis IP32953 genome sequence, encodes a protein with similarity to invasin, a classic adhesion/invasion protein, and to intimin, the attaching and effacing protein from enteropathogenic (EPEC) and enterohaemorraghic (EHEC) Escherichia coli.

Identification and characterisation of a novel adhesin Ifp in Yersinia pseudotuberculosis.

Um neue Virulenz Determinanten in Y. Pseudotuberculosis zu ermitteln, einen Vergleich zwischen seines Genoms und der Yersinia Pestis wurde durchgef&uuml;hrt. Dies zeigt Dutzende von Pseudogenes in Y. Pestis, die sind immer noch vermeintlich in Y. Pseudotuberculosis funktionsf&auml;hig und in der enterischen Lebensstil wichtig sein k&ouml;nnen. Ein Gen, YPTB1572 in der Y. Pseudotuberculosis IP32953 Genom-Sequenz kodiert ein Protein mit &Auml;hnlichkeit zu Invasin, ein klassisches Adh&auml;sion/Einmarsch-Protein, Intimin, das Anf&uuml;gen und auszul&ouml;schen Protein von enteropathogener (EPEC) und Enterohaemorraghic (EHEC) Escherichia coli.

Article	Year
N-acylhomoserine lactones undergo lactonolysis in a pH-, temperature-, and acyl chain length-dependent manner during growth of Yersinia pseudotuberculosis and Pseudomonas aeruginosa. Infection and immunity\| PubMed ID: 12228292	2002
Quorum sensing in Yersinia enterocolitica controls swimming and swarming motility. Journal of bacteriology\| PubMed ID: 16452428	2006
Comprehensive profiling of N-acylhomoserine lactones produced by Yersinia pseudotuberculosis using liquid chromatography coupled to hybrid quadrupole-linear ion trap mass spectrometry. Analytical and bioanalytical chemistry\| PubMed ID: 16967185	2007
Functional interplay between the Yersinia pseudotuberculosis YpsRI and YtbRI quorum sensing systems modulates swimming motility by controlling expression of flhDC and fliA. Molecular microbiology\| PubMed ID: 18466299	2008
Functional characterization of FlgM in the regulation of flagellar synthesis and motility in Yersinia pseudotuberculosis. Microbiology (Reading, England)\| PubMed ID: 19383707	2009
OmpR positively regulates urease expression to enhance acid survival of Yersinia pseudotuberculosis. Microbiology (Reading, England)\| PubMed ID: 19443542	2009
Turnover of quorum sensing signal molecules modulates cross-kingdom signalling. Environmental microbiology\| PubMed ID: 19508552	2009
Positive regulation of flhDC expression by OmpR in Yersinia pseudotuberculosis. Microbiology (Reading, England)\| PubMed ID: 19643764	2009
Quorum sensing and social networking in the microbial world. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society\| PubMed ID: 19674996	2009
Biofilm development on Caenorhabditis elegans by Yersinia is facilitated by quorum sensing-dependent repression of type III secretion. PLoS pathogens\| PubMed ID: 21253572	2011
Manipulation of quorum sensing regulation in Pseudomonas fluorescens NCIMB 10586 to increase mupirocin production. Applied microbiology and biotechnology\| PubMed ID: 21318358	2011
Characterization of N-acylhomoserine lactone-degrading bacteria associated with the Zingiber officinale (ginger) rhizosphere: co-existence of quorum quenching and quorum sensing in Acinetoba... BMC microbiology\| PubMed ID: 21385437	2011
Identification and characterisation of a novel adhesin Ifp in Yersinia pseudotuberculosis. BMC microbiology\| PubMed ID: 21527009	2011

Steve Atkinson

Biography

JoVE Journal Publications

Other Publications