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Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

The development of organotypic epithelial raft cultures has provided researchers with an efficient in vitro system that faithfully recapitulates ...

Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is the etiologic agent for KS tumors, multicentric Castleman's disease, and primary effusion lymphomas. Like other herpesvirus capsids, the KSHV capsid is an icosahedral structure composed of six proteins. The capsid shell is made up of the major capsid protein, two triplex proteins, and the small capsid protein. The scaffold protein and the protease occupy the internal space. The assembly of KSHV capsids is thought to occur in a manner similar to that determined for herpes simplex virus type 1 (HSV-1). Our goal was to assemble KSHV capsids in insect cells using the baculovirus expression vector system. Six KSHV capsid open reading frames were cloned and the proteins expressed in Sf9 cells: pORF25 (major capsid protein), pORF62 (triplex 1), pORF26 (triplex 2), pORF17 (protease), pORF17.5 (scaffold protein), and also pORF65 (small capsid protein). When insect cells were coinfected with these baculoviruses, angular capsids that contained internal core structures were readily observed by conventional electron microscopy of the infected cells. Capsids were also readily isolated from infected cells by using rate velocity sedimentation. With immuno-electron microscopy methods, these capsids were seen to be reactive to antisera to pORF65 as well as to KSHV-positive human sera, indicating the correct conformation of pORF65 in these capsids. When either virus expressing the triplex proteins was omitted from the coinfection, capsids did not assemble; similar to observations made in HSV-1-infected cells. If the virus expressing the scaffold protein was excluded, large open shells that did not attain icosahedral structure were seen in the nuclei of infected cells. The presence of pORF65 was required for capsid assembly, in that capsids did not form if this protein was absent as judged by both by ultrastructural analysis of infected cells and rate velocity sedimentation experiments. Thus, a novel outcome of this study is the finding that the small capsid protein of KSHV, like the major capsid and triplex proteins, is essential for capsid shell assembly.

Small capsid protein pORF65 is essential for assembly of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus capsids.

Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus (KSHV) ist das &auml;tiologische Mittel f&uuml;r KS-Tumoren, multizentrischen Castleman-Krankheit und prim&auml;ren Erguss Lymphome. Wie andere Capsids Herpesvirus ist das Kapsid KSHV einer ikosaedrischen Struktur, bestehend aus sechs Proteine. Die Shell Kapsid besteht aus das wichtigste Kapsidprotein, zwei triplex Proteine und das kleine Kapsidprotein. Das Ger&uuml;st-Protein und die Protease einnehmen internen Platz. Die Montage der KSHV Capsids ist vermutlich auftreten, &auml;hnlich wie bei Herpes-Simplex-Virustyp 1 (HSV-1) bestimmt. Unser Ziel war es, KSHV Capsids in Insektenzellen mit dem Baculovirus Ausdruck Vektor-System zusammenstellen. Sechs KSHV Kapsid offen lesen Bilder wurden geklont und die Proteine, die in Sf9 Zellen: pORF25 (wichtigste Kapsidprotein), pORF62 (triplex 1), pORF26 (triplex 2), pORF17 (Protease), pORF17.5 (Ger&uuml;st-Protein) und auch pORF65 (kleine Kapsidprotein). Wenn Insektenzellen mit dieser Baculoviruses coinfected waren, wurden eckig Capsids, die interne Strukturen enthalten leicht von konventionellen Elektronenmikroskopie der infizierten Zellen beobachtet. Capsids wurden auch von infizierten Zellen mit Tarif Geschwindigkeit Ablagerung leicht isoliert. Mit Immuno-Elektronen-Mikroskopie-Methoden galten diese Capsids reaktiv, Antiseren, pORF65 als auch hinsichtlich der menschlichen KSHV-positiven Seren, angibt, die richtige Gestaltung des pORF65 in diesen Capsids sein. Wenn entweder Virus zum Ausdruck der triplex-Proteine in der Coinfection weggelassen wurde, zusammen Capsids nicht; &auml;hnliche Beobachtungen in HSV-1-infizierten Zellen. Wenn das Virus zum Ausdruck bringen des Ger&uuml;st-Proteins ausgeschlossen wurde, galten gro&szlig;e offene Muscheln, die nicht deren Struktur erreichen in den Kernen der infizierten Zellen. Das Vorhandensein von pORF65 war bei der Kapsid Versammlung, in diesem Capsids nicht Formular, wenn dieses Protein nicht vorkam wie von beiden durch ultrastrukturelle Analyse von infizierten Zellen und Tarif Geschwindigkeit Ablagerung Experimente beurteilt. So ist ein neuartiges Ergebnis dieser Studie die Feststellung, dass das kleine Kapsidprotein von KSHV, wie die gro&szlig;en Kapsid und triplex Proteine, f&uuml;r Kapsid Schale Montage wichtig.

Kleine Kapsid Protein pORF65 ist essentiell f&uuml;r die Montage von Kaposi-Sarkom-assoziierte Herpesvirus Capsids.

Staphylococcal peptidoglycan hydrolases are a potential new source of antimicrobials. A large subset harbors C-terminal SH3b_5 cell wall binding domains. These C-terminal domains have been shown to be necessary for accurate cell wall recognition and subsequent staphylolytic activity for some endolysins. Over fifty proteins of staphylococcal or phage origin containing SH3b domains were aligned, yielding five highly repetitive groups of proteins. Representative C-termini from these five groups, and six staphylococcal proteins for which no homologues have been identified, were aligned, revealing two distinct SH3b_5 subgroups with overlapping but differentially conserved residues. A premise behind this research is that there may be unique cell wall binding properties conferred by these staphylococcal domains that could be exploited to specifically enhance anti-staphylococcal efficacy in heterologous protein fusion constructs. To identify functional differences between the two subgroups, the native Cpl-7 cell wall binding domains of the streptococcal LambdaSa2 endolysin were replaced by staphylococcal SH3b domains from both subgroups. SH3b domains from either lysostaphin (bacteriocin) or LysK (phage endolysin) resulted in a approximately 5x increase in staphylolytic activity conferred on the streptococcal endopeptidase domain, and surprisingly these same fusions maintained significant streptolytic activity suggesting that the staphylococcal SH3b domains are not always staphylococcal-specific. A comparison of the differences in lytic activity conferred on the LambdaSa2 endopeptidase domain by either LysK or lysostaphin SH3b domain differed by no more than a factor of two. Through the collection of peptidoglycan hydrolase sequences, three new putative intron-containing phage endolysin genes were identified in public data sets for the phages G1, X2 and 85.

Differentially conserved staphylococcal SH3b_5 cell wall binding domains confer increased staphylolytic and streptolytic activity to a streptococcal prophage endolysin domain.

Staphylokokken Peptidoglycan-HYDROLASEN sind eine potenzielle neue Quelle von Antibiotika. Eine gro&szlig;e Teilmenge birgt der C-terminalen SH3b_5 Zellwand Bindung Dom&auml;nen. Diese C-terminalen Dom&auml;nen wurden gezeigt, f&uuml;r genaue Zellwand Anerkennung und nachfolgende Staphylolytic Aktivit&auml;t f&uuml;r einige Endolysins erforderlich. &Uuml;ber f&uuml;nfzig Proteine der Staphylokokken oder Phage Ursprungs enthaltende SH3b Dom&auml;nen ausgerichtet wurden, woraus sich f&uuml;nf stark repetitive Gruppen von Proteinen. Vertreter C-Termini aus diesen f&uuml;nf Gruppen und sechs Staphylokokken Proteine, f&uuml;r die keine Homologen identifiziert wurden, wurden ausgerichtet, zwei unterschiedliche SH3b_5 Untergruppen mit &uuml;berlappenden sondern differentiell konservierten R&uuml;ckst&auml;nde offenbart. Eine Pr&auml;misse hinter dieser Forschung ist, dass es m&ouml;glicherweise einzigartige Zellwand Binden von Eigenschaften, die aus der Staphylokokken Domains, die ausgenutzt werden k&ouml;nnte, um speziell bei heterologe Protein Fusion Konstrukte anti-staphylococcal Wirksamkeit zu erh&ouml;hen. Um funktionale Unterschiede zwischen den zwei Untergruppen zu identifizieren, wurden die native Cpl-7 Zellwand Bindung Bereiche der Streptokokken-LambdaSa2-Endolysin ersetzt durch Staphylokokken SH3b Dom&auml;nen aus beiden Untergruppen. SH3b Dom&auml;nen aus Lysostaphin (Bacteriocin) oder LysK (Phage Endolysin) f&uuml;hrte zu einer Erh&ouml;hung von ca. 5 X Staphylolytic-Aktivit&auml;t, die Durchf&uuml;hrungsbefugnisse der Streptokokken Endopeptidase-Dom&auml;ne und &uuml;berraschend diese gleichen Fusionen gepflegt signifikanten streptolytic T&auml;tigkeit, die darauf hindeutet, dass die Staphylokokken SH3b Dom&auml;nen nicht immer Staphylokokken-spezifisch sind. Ein Vergleich der Unterschiede bei lytische Aktivit&auml;t, welche auf der LambdaSa2-Endopeptidase-Dom&auml;ne von entweder LysK, oder Lysostaphin SH3b Dom&auml;ne unterschieden sich von nicht mehr als den Faktor 2. Durch die Auflistung der Peptidoglycan-Hydrolase-Sequenzen wurden drei neue vermeintliche Intron-haltigen Phage Endolysin Gene in &ouml;ffentliche Datens&auml;tze f&uuml;r die Phagen G1, X 2 und 85 identifiziert.

Differentiell konservierte Staphylokokken SH3b_5 Zellwand Bindung Dom&auml;nen &uuml;bertragen, erh&ouml;hte Staphylolytic und streptolytic T&auml;tigkeit einer Streptokokken Prophage Endolysin Dom&auml;ne.

Article	Year
Small capsid protein pORF65 is essential for assembly of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus capsids. Journal of virology\| PubMed ID: 18463150	2008
Differentially conserved staphylococcal SH3b_5 cell wall binding domains confer increased staphylolytic and streptolytic activity to a streptococcal prophage endolysin domain. Gene\| PubMed ID: 19422893	2009

Daniel Anacker

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