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Electrophysiological Methods for Recording Synaptic Potentials from the NMJ of Drosophila Larvae

In this video, we describe the electrophysiological methods for recording synaptic transmission at the neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila larva. ...

Orf virus (ORFV) is the type species of the parapoxvirus genus and produces cutaneous pustular lesions in sheep, goats and humans. The genome encodes a polypeptide with remarkable homology to interleukin-10 (IL-10), particularly ovine IL-10, and also to IL-10-like proteins encoded by Epstein-Barr virus (EBV) and equine herpesvirus. IL-10 is a pleiotropic cytokine that can exert either immunostimulatory or immunosuppressive effects on many cell types. We have expressed and purified C-terminal FLAG and His(6)-tagged versions of ORFV-IL-10 and shown that ORFV-IL-10 costimulates murine mast cells (MC/9) and inhibits tumour necrosis factor-alpha synthesis in activated mouse peritoneal macrophages. Our results demonstrate that although ORFV-IL-10 is structurally similar to EBV-IL-10 it has evolved a different spectrum of activities. EBV-IL-10 does not stimulate the proliferation of thymocytes or mast cells whereas ORFV-IL-10 has both of these activities. Recent studies show that the critical difference in molecular structure of human IL-10 and EBV-IL-10, which may be the basis of their functional differences, is linked to a single amino acid substitution. Consistent with the activity spectrum reported here for ORFV-IL-10, the viral gene encodes the critical amino acid seen in human IL-10. Although the ORFV-IL-10 gene has clearly undergone significant evolutionary change at the nucleotide level compared with ovine IL-10, it has largely retained the polypeptide structure and functional characteristics of its ovine counterpart, suggesting that mutations of the gene to a potentially more potent immunosuppressive form may compromise the co-existence of host and virus.

Orf virus-encoded interleukin-10 stimulates the proliferation of murine mast cells and inhibits cytokine synthesis in murine peritoneal macrophages.

ORF-Virus-codierten Interleukin-10 stimuliert die Proliferation von murinen Mastzellen und hemmt Zytokinen in murinen peritonealen Makrophagen.

Orf virus encodes a range of immuno-modulatory genes that interfere with host anti-virus immune and inflammatory effector mechanisms. The function of these reflects the pathogenesis of orf. The orf virus interferon resistance protein (OVIFNR) and virus IL-10 (vIL-10) inhibit interferon production and activity. In addition the vIL-10 suppresses inflammatory cytokine production by activated macrophages and keratinocytes. The virus GM-CSF inhibitory factor (GIF) is a novel virus protein that binds to and inhibits the biological activity of GM-CSF and IL-2. Together, these immuno-modulators target key effector mechanisms of host anti-virus immunity to allow time for virus replication in epidermal cells.

Orf virus immuno-modulation and the host immune response.

ORF-Virus Immunmodulation und die Immunantwort des Wirts.

Orf virus causes pustular skin lesions (orf) in sheep, goats and humans. The virus encodes an interleukin-10 (orfvIL-10) that is identical in amino acid composition to ovine IL-10 (ovIL-10) over the C terminal two-thirds of the polypeptide, but not in the N terminal third. The immuno-suppressive and immuno-stimulatory activities of orfvIL-10 and ovIL-10 were compared. Both orfvIL-10 and ovIL-10 inhibited TNF-alpha and IL-8 cytokine production from stimulated ovine macrophages and keratinocytes and IFN-gamma and GM-CSF production from peripheral blood lymphocytes. OrfvIL-10 and ovIL-10 co-stimulated both ovine and murine mast cell proliferation in conjunction with IL-3 (ovine) or IL-4 (murine). Isoleucine at position 87 (Ile(87)) of the mature human IL-10 (huIL-10) has been reported as essential for the immuno-stimulatory activity of huIL-10. In spite of the differences in amino acids within the N-terminal third of orfvIL-10 compared with ovIL-10 and substitution of Ile(87) with Ala(87) in ovIL-10, these variants of ovIL-10 and orfvIL-10 all co-stimulated mast cell proliferation and inhibited macrophage IL-8 production. As ovIL-10 and orfvIL-10 have a similar structure to huIL-10 and conserved receptor-binding residues, it was concluded that Ile(87) is not essential for IL-10 immuno-stimulatory activity. Finally, ovine keratinocytes do not express ovIL-10. This might explain why orf virus has evolved a viral IL-10.

A comparison of the anti-inflammatory and immuno-stimulatory activities of orf virus and ovine interleukin-10.

Ein Vergleich der entz&#xFC;ndungshemmende und immunstimulierende Aktivit&#xE4;ten des ORF-Virus und Schafen Interleukin-10.

"Ryegrass staggers" is a neurological condition of unknown mechanism that impairs motor function in livestock. It is caused by infection of perennial ryegrass pastures by an endophytic fungus that produces neurotoxins, predominantly the indole-diterpenoid compound lolitrem B. Animals grazing on such pastures develop uncontrollable tremors and become uncoordinated in their movement. Lolitrem B and the structurally related tremor inducer paxilline both act as potent large conductance calcium-activated potassium (BK) channel inhibitors. Using patch clamping, we show that their different apparent affinities correlate with their toxicity in vivo. To investigate whether the motor function deficits produced by lolitrem B and paxilline are due to inhibition of BK ion channels, their ability to induce tremor and ataxia in mice deficient in this ion channel (Kcnma1(-/-)) was examined. Our results show that mice lacking Kcnma1 are unaffected by these neurotoxins. Furthermore, doses of these substances known to be lethal to wild-type mice had no effect on Kcnma1(-/-) mice. These studies reveal the BK channel as the molecular target for the major components of the motor impairments induced by ryegrass neurotoxins. Unexpectedly, when the response to lolitrem B was examined in mice lacking the beta4 BK channel accessory subunit (Kcnmb4(-/-)), only low-level ataxia was observed. Our study therefore reveals a new role for the accessory BK beta4 subunit in motor control. The beta4 subunit could be considered as a potential target for treatment of ataxic conditions in animals and in humans.

The molecular mechanism of "ryegrass staggers," a neurological disorder of K+ channels.

&quot;Raigras taumelt&quot; ist eine neurologische Erkrankung des unbekannten Mechanismus, der motorischen Funktion bei landwirtschaftlichen Nutztieren beeintr&auml;chtigt. Sie wird verursacht durch Infektion von Weidelgras Weiden durch einen endophytischen Pilz, die Neurotoxine produziert, vorwiegend die Indol-Diterpenoid zusammengesetzte Lolitrem B. Tiere Weiden auf solche Weiden entwickeln unkontrollierbare zittern und unkoordiniert in ihrer Bewegung zu werden. Lolitrem B und die strukturell &auml;hnlicher Erdsto&szlig; Induktor Paxilline, die sowohl als potenter gro&szlig;en Leitwert Kalzium aktivierte Kalium (BK)-Kanal-Hemmer fungieren. Mit Patch zu spannen, zeigen wir, dass ihre verschiedenen offensichtlichen Affinit&auml;ten mit ihrer Toxizit&auml;t in-vivo korrelieren. Zu untersuchen, ob die Motorik Defizite produziert von Lolitrem B und Paxilline durch Hemmung der BK Ionenkan&auml;le, ihre F&auml;higkeit sind zu Tremor und Ataxie bei M&auml;usen einen Mangel an dieser Ionenkanal (Kcnma1(-/-)) wurde untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass M&auml;usen fehlt Kcnma1 unber&uuml;hrt von diesen Neurotoxinen. Dar&uuml;ber hinaus hatte Dosen dieser Stoffe, die bekannterma&szlig;en t&ouml;dlich f&uuml;r Wildtyp M&auml;usen keine Auswirkung auf die Kcnma1(-/-) M&auml;use. Diese Studien zeigen den BK-Kanal als molekulare Ziel f&uuml;r die wichtigsten Komponenten der motorischen Beeintr&auml;chtigungen von Weidelgras Neurotoxine induziert. Unerwartet, wenn die Antwort auf Lolitrem B wurde in M&auml;usen fehlt die beta4-BK Kanal-Zubeh&ouml;r-Untereinheit untersucht (Kcnmb4(-/-)), nur auf niedriger Ebene Ataxie wurde beobachtet. Unsere Studie zeigt daher eine neue Rolle f&uuml;r die Zubeh&ouml;r BK-beta4-Untereinheit in Motorsteuerung. Die beta4-Untereinheit k&ouml;nnte als ein potenzielles Ziel f&uuml;r Behandlung ataktische Probleme bei Tieren und beim Menschen betrachtet werden.

Der molekulare Mechanismus der &quot;Raigras Staggers,&quot; eine neurologische Erkrankung der K + Kan&auml;le.

Lolitrem B is an indole-diterpenoid neurotoxin which is the main causative agent of ryegrass staggers, an animal disease associated with tremors and incoordination. It is also a potent inhibitor of large conductance calcium-activated potassium (BK) channel activity (IC(50)=4 nM). Furthermore, we have recently shown that the motor function deficits induced by lolitrem B are specifically mediated by BK channels, making the toxin a valuable tool for investigating the molecular function and physiological roles of these channels. To determine what structural features of BK channel agents are required for high potency, the effect of lolitrem B and seven structurally-related lolitrems on BK channel activity has been measured. Concentration-responses and conductance-voltage (G-V) relationships were determined for each compound and related to the different structure types. This study has identified seven new BK channel inhibitors and has allowed the identification of two key structural features required for high potency BK channel activity by lolitrems.

Structural determinants of lolitrems for inhibition of BK large conductance Ca2+-activated K+ channels.

Lolitrem B ist ein Indol-Diterpenoid-Neurotoxin, das der wichtigste Erreger der Weidelgras Staggers, eine Tierkrankheit, Zittern und Gleichgewichtsst&ouml;rungen zugeordnet ist. Es ist auch ein potenter Inhibitor der gro&szlig;en Leitwert Kalzium aktivierte Kalium (BK)-Channel-Aktivit&auml;ten (IC (50) = 4 nM). Dar&uuml;ber hinaus haben wir k&uuml;rzlich gezeigt, dass die Defizite des motorischen Funktion induziert durch Lolitrem B speziell von BK-Kan&auml;le vermittelt werden machen dem Toxin ein wertvolles Instrument f&uuml;r die Untersuchung der molekularen Funktion und physiologischen Rollen dieser Kan&auml;le. Um zu bestimmen, welche strukturellen Merkmale der BK Kanal Agents sind erforderlich f&uuml;r hohe Potenz, die Wirkung der Lolitrem B und hat sieben strukturell verwandt Lolitrems auf BK-Channel-Aktivit&auml;ten gemessen worden. Konzentration-Antworten und Leitwert-Spannung (G-V) Beziehungen waren bestimmt f&uuml;r jede Substanz und mit Bezug auf die unterschiedliche Struktur-Typen. Diese Studie hat sieben neue BK-Kanal-Hemmer und erm&ouml;glichte die Identifizierung von zwei wichtigen strukturellen Merkmale, die f&uuml;r hohe Potenz BK-Channel-Aktivit&auml;ten durch die Lolitrems erforderlichen.

Strukturelle Determinanten der Lolitrems f&uuml;r die Hemmung der BK gro&szlig;e Leitwert Ca2 +-aktivierte K +-Kan&auml;le.

The heart generates and propagates action potentials through synchronized activation of ion channels allowing inward Na(+) and Ca(2+) and outward K(+) currents. There are a number of K(+) channel types expressed in the heart that play key roles in regulating the cardiac cycle. Large conductance calcium-activated potassium (BK) ion channels are not thought to be directly involved in heart function. Here we present evidence that heart rate can be significantly reduced by inhibiting the activity of BK channels. Agents that specifically inhibit BK channel activity, including paxilline and lolitrem B, slowed heart rate in conscious wild-type mice by 30% and 42%, respectively. Heart rate of BK channel knock-out mice (Kcnma1(-/-)) was not affected by these BK channel inhibitors, suggesting that the changes to heart rate were specifically mediated through BK channels. The possibility that these effects were mediated through BK channels peripheral to the heart was ruled out with experiments using isolated, perfused rat hearts, which showed a significant reduction in heart rate when treated with the BK channel inhibitors paxilline (1 microM), lolitrem B (1 microM), and iberiotoxin (0.23 microM), of 34%, 60%, and 42%, respectively. Furthermore, paxilline was shown to decrease heart rate in a dose-dependent manner. These results implicate BK channels located in the heart to be directly involved in the regulation of heart rate.

A role for BK channels in heart rate regulation in rodents.

Das Herz erzeugt und propagiert Aktionspotentiale durch synchronisierte Aktivierung von Ionenkan&auml;len, die nach innen Na(+) und Ca(2+) und nach au&szlig;en K(+) Str&ouml;mungen. Es gibt eine Reihe von K(+) Kanaltypen ausgedr&uuml;ckt im Herzen, die entscheidende Rolle bei der Regulierung der Herzzyklus spielen. Gro&szlig;e Leitwert Kalzium aktivierte Kalium (BK)-Ionenkan&auml;le sind nicht daran gedacht, direkt in der Herzfunktion einbezogen werden. Hier pr&auml;sentieren wir Beweise, dass Herzfrequenz kann durch die Hemmung der Aktivit&auml;t von BK-Kan&auml;len erheblich reduziert werden. Agenten, die speziell BK-Channel-Aktivit&auml;ten, einschlie&szlig;lich Paxilline und Lolitrem B, hemmen verlangsamte Herzfrequenz bewusste Wildtyp-M&auml;usen um 30 % und 42 %, beziehungsweise. Herzfrequenz von BK Kanal Knock-out-M&auml;use (Kcnma1(-/-)) war nicht betroffen von dieser BK-Kanal-Hemmer, was darauf hindeutet, dass die &Auml;nderungen an Herzfrequenz speziell &uuml;ber BK Kan&auml;le vermittelt wurden. Die M&ouml;glichkeit, dass diese Effekte durch BK Kan&auml;le Peripherie zum Herzen vermittelt wurden wurde mit Experimenten mit isoliert, PERFUNDIERTEN Rattenherzen, die eine signifikante Reduktion in der Herzfrequenz nach Behandlung mit der BK Kanal Inhibitoren Paxilline (1 MicroM), Lolitrem B zeigte ausgeschlossen (1 MicroM), und Iberiotoxin (0,23 MicroM), 34 %, 60 % und 42 %, beziehungsweise. Dar&uuml;ber hinaus zeigte Paxilline, Herzfrequenz eine dosisabh&auml;ngige Weise zu verringern. Diese Ergebnisse implizieren BK Kan&auml;le liegt im Herzen direkt bei der Regulierung der Herzfrequenz einzubeziehen.

Eine Rolle f&uuml;r BK-Kan&auml;le in Herzfrequenz-Verordnung bei Nagern.

The aim of this study was to compare the mode of action of the commonly used BK inhibitor paxilline with that of the more recently discovered lolitrem B. Similarities and differences in characteristics of inhibition between the two compounds were investigated. We have previously shown that lolitrem B does not affect the BK channel G-V, in contrast to the rightward shift produced by paxilline. These different effects on the voltage-dependence of activation suggest different modes of action for these two compounds. In this study we show that inhibition by both paxilline and lolitrem B is characterized by an open state preference for BK (hSlo) channels. Both compounds had a 3-fold higher apparent affinity under conditions likely to favour the open state, suggesting they have a similar BK conformational preference for binding. Furthermore, both compounds had a calcium concentration-dependence to their inhibitory effects. The G-V shift induced by paxilline was calcium concentration-dependent.

Mechanism of action of lolitrem B, a fungal endophyte derived toxin that inhibits BK large conductance CaÂ²+-activated K+ channels.

Das Ziel dieser Studie war es, die Wirkungsweise der h&auml;ufig verwendeten BK Inhibitor Paxilline mit der die mehr vor kurzem entdeckten Lolitrem vergleichen, die B. &Auml;hnlichkeiten und Unterschiede in den Eigenschaften der Hemmung zwischen den beiden Verbindungen untersucht worden sind. Wir haben bereits gezeigt, dass dieser Lolitrem B nicht den BK-Kanal G-V, im Gegensatz zu der nach rechts Verschiebung produziert von Paxilline auswirkt. Diese unterschiedlichen Auswirkungen auf die Spannung-Abh&auml;ngigkeit der Aktivierung empfehlen verschiedene Wirkungsweisen f&uuml;r diese zwei Verbindungen. In dieser Studie zeigen wir, dass die Hemmung von Paxilline und Lolitrem B ist gekennzeichnet durch einen ge&ouml;ffneten Zustand Vorliebe f&uuml;r BK (hSlo) Kan&auml;le. Beide Verbindungen hatte eine 3-Band h&ouml;here scheinbare Affinit&auml;t unter Bedingungen beg&uuml;nstigen den ge&ouml;ffneten Zustand, was darauf hindeutet, dass sie eine &auml;hnliche BK Konformations&auml;nderungen Pr&auml;ferenz f&uuml;r Bindung haben. Dar&uuml;ber hinaus mussten beide Verbindungen eine Kalzium-Konzentration-Abh&auml;ngigkeit ihrer hemmenden Wirkungen. Die G-V-Verschiebung von Paxilline induziert war Kalzium Konzentration abh&auml;ngig.

Wirkmechanismus von Lolitrem B, eine pilzartige Endophyt abgeleitet Toxin, das hemmt die BK gro&szlig;e Leitwert Ca&sup2; +-aktivierte K +-Kan&auml;le.

Article	Year
Orf virus-encoded interleukin-10 stimulates the proliferation of murine mast cells and inhibits cytokine synthesis in murine peritoneal macrophages. The Journal of general virology\| PubMed ID: 11961259	2002
Orf virus immuno-modulation and the host immune response. Veterinary immunology and immunopathology\| PubMed ID: 12072264	2002
A comparison of the anti-inflammatory and immuno-stimulatory activities of orf virus and ovine interleukin-10. Virus research\| PubMed ID: 12457984	2002
The molecular mechanism of "ryegrass staggers," a neurological disorder of K+ channels. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics\| PubMed ID: 18801945	2008
Structural determinants of lolitrems for inhibition of BK large conductance Ca2+-activated K+ channels. European journal of pharmacology\| PubMed ID: 19210977	2009
A role for BK channels in heart rate regulation in rodents. PloS one\| PubMed ID: 20090847	2010
Mechanism of action of lolitrem B, a fungal endophyte derived toxin that inhibits BK large conductance CaÂ²+-activated K+ channels. Toxicon : official journal of the International Society on Toxinology\| PubMed ID: 21300077	2011

Wendy Imlach

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