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Method for the Isolation and Identification of mRNAs, microRNAs and Protein Components of Ribonucleoprotein Complexes from Cell Extracts using RIP-Chip

As a result of the development of high-throughput sequencing and efficient microarray analysis, global gene expression analysis has become an easy and ...

Exposure to short-wavelength UV light (UVC) strongly induces p53 expression. In human RKO colorectal carcinoma cells, this increase was not due to elevated p53 mRNA abundance, cytoplasmic export of p53 mRNA, or UVC-triggered stabilization of the p53 protein. Instead, p53 translation was potently enhanced after UVC irradiation. The 3' UTR of p53 was found to be a target of the RNA-binding protein HuR in a UVC-dependent manner in vitro and in vivo. HuR-overexpressing RKO cells displayed elevated p53 levels, whereas cells expressing reduced HuR showed markedly diminished p53 abundance and p53 translation. Our results demonstrate a role for HuR in binding to the p53 mRNA and enhancing its translation.

RNA-binding protein HuR enhances p53 translation in response to ultraviolet light irradiation.

Gef&auml;hrdung durch kurze Wellenl&auml;nge UV-Licht (UVC) induziert stark p53 Ausdruck. In den menschlichen Zellen f&uuml;r RKO-kolorektales Karzinom war dieser Anstieg nicht aufgrund erh&ouml;hter p53 mRNA F&uuml;lle, zytoplasmatische Export von p53 mRNA oder UVC-ausgel&ouml;sten Stabilisierung des p53-Proteins. Stattdessen wurde p53 &Uuml;bersetzung nach UVC Bestrahlung stark verbessert. Der 3&#39; UTR von p53 wurde festgestellt, dass um ein Ziel der RNS-bindene Proteine HuR in UVC-abh&auml;ngigen Weise in vitro und in vivo zu sein. HuR-&uuml;berexprimierenden RKO Zellen angezeigt erh&ouml;hten p53-Level, w&auml;hrend Zellen reduzierten HuR zeigte deutlich zum Ausdruck zu bringen F&uuml;lle und p53 &Uuml;bersetzung p53 vermindert. Unsere Ergebnisse zeigen eine Rolle f&uuml;r HuR bei der Bindung an die p53-mRNA und Verbesserung seiner &Uuml;bersetzung.

RNS-bindene Protein HuR erh&ouml;ht p53 &Uuml;bersetzung als Reaktion auf UV-Licht-Bestrahlung.

In diesem Bericht untersuchen wir die Rolle der RNS-bindene Proteine HuR w&auml;hrend Skelett Myogenese. Zu Beginn der Myogenese in C2C12 Myozyten differenzieren und in Vivo in regenerierende Maus Muskel, HuR zytoplasmatischen F&uuml;lle dramatisch erh&ouml;ht zur&uuml;ckzukehren eine &uuml;berwiegend nukleare Pr&auml;senz nach Abschluss der Myogenese. mRNAs Codierung wichtige Regulatoren der Myogenese-spezifische Transkription (Myogenin und MyoD) und Zellzyklus-Entzug (p21), AU-reiche Regionen, wobei befand, dass das um Ziel von HuR in gewissem Sinne Differenzierung abh&auml;ngig zu sein. Dementsprechend wurden mRNA Halbwertzeiten h&ouml;chste Differenzierung, sinkende Differenzierung durchgef&uuml;hrt wurde. Wichtigsten HuR-&uuml;berexprimierenden C2C12 Zellen angezeigt erh&ouml;ht Ziel-mRNA-Expression und Half-Life und unterzog sich altklug Differenzierung. Unsere Erkenntnisse unterstreichen eine kritische Funktion f&uuml;r HuR w&auml;hrend Skelett Myogenese HuRs Koordinate Verordnung Muskel Differenzierung Gene verbunden.

Die Rolle der HuR im Skelett Myogenese durch Koordinaten Verordnung Muskel Differenzierung Gene.

In this report, we investigate the role of the RNA-binding protein HuR during skeletal myogenesis. At the onset of myogenesis in differentiating C2C12 myocytes and in vivo in regenerating mouse muscle, HuR cytoplasmic abundance increased dramatically, returning to a predominantly nuclear presence upon completion of myogenesis. mRNAs encoding key regulators of myogenesis-specific transcription (myogenin and MyoD) and cell cycle withdrawal (p21), bearing AU-rich regions, were found to be targets of HuR in a differentiation-dependent manner. Accordingly, mRNA half-lives were highest during differentiation, declining when differentiation was completed. Importantly, HuR-overexpressing C2C12 cells displayed increased target mRNA expression and half-life and underwent precocious differentiation. Our findings underscore a critical function for HuR during skeletal myogenesis linked to HuR's coordinate regulation of muscle differentiation genes.

Role of HuR in skeletal myogenesis through coordinate regulation of muscle differentiation genes.

During inflammatory responses, a major posttranscriptional regulation of early response and inflammatory gene expression occurs through modulation of mRNA turnover. We report that two potent inducers of the CC chemokine eotaxin, TNF-alpha and IL-4, regulate its production in airway epithelial cells by increasing eotaxin mRNA stability. In experiments using the transcriptional inhibitor actinomycin D, eotaxin mRNA half-life was significantly prolonged by cell stimulation with TNF-alpha or IL-4, with the combination of the two cytokines being the most effective in extending the mRNA half-life. Involvement of the eotaxin 3' untranslated region in the mRNA-stabilizing effect was tested by transient transfection of a construct expressing a chimeric transcript carrying a serum-inducible beta-globin reporter linked to the eotaxin 3' untranslated region. The half-life of the chimeric mRNA was markedly increased in cells stimulated with TNF-alpha and IL-4. Evidence that the mRNA-stabilizing protein HuR participated in the cytokine effect was obtained: first, HuR presence in the cytoplasm, believed to be required for HuR-mediated mRNA stabilization, increased in both transformed (BEAS-2B cell line) and primary bronchial epithelial cells following treatment with TNF-alpha and IL-4. Second, endogenous eotaxin mRNA was found to bind to HuR in vivo, as detected by immunoprecipitation of HuR-containing messenger ribonucleoprotein complexes followed by real-time RT-PCR analysis; such association increased after cell treatment with TNF-alpha and IL-4. Third, overexpression of HuR in BEAS-2B cells significantly increased the expression of eotaxin mRNA and protein. Our findings implicate mRNA stabilization in the cytokine-mediated increase in eotaxin expression and strongly suggest a role for HuR in this effect.

Regulation of eotaxin gene expression by TNF-alpha and IL-4 through mRNA stabilization: involvement of the RNA-binding protein HuR.

W&auml;hrend der entz&uuml;ndlichen Reaktionen beginnt eine gro&szlig;e Posttranscriptionale Regulation der baldige Antwort und entz&uuml;ndliche Genexpression durch Modulation der mRNA-Umsatz. Wir berichten, dass zwei starke Induktoren von der CC-Chemokine Eotaxin, TNF-Alpha und IL-4, seine Produktion in Epithelzellen der Atemwege regulieren durch Eotaxin mRNA Stabilit&auml;t erh&ouml;hen. Im Experimente mit der transcriptional Hemmer Actinomycin D wurde Eotaxin mRNA Halbwertszeit deutlich durch Stimulation der Zelle mit TNF-Alpha oder IL-4, mit der Kombination von zwei Zytokine wird am effektivsten bei der Ausweitung der mRNA-Halbwertszeit verl&auml;ngert. Beteiligung der Eotaxin 3&#39; Untranslatierter Bereich in der mRNA-stabilisierende Wirkung wurde vom transiente Transfektion eines Konstrukts auszudr&uuml;cken eine Chim&auml;re Transkript tragen einen Serum-inducible Beta-Globin-Reporter mit dem Eotaxin 3&#39; Untranslatierter Bereich verkn&uuml;pft getestet. Die Halbwertszeit des Chim&auml;ren mRNA wurde in den Zellen stimuliert mit TNF-Alpha und IL-4 deutlich erh&ouml;ht. Beweise, die das mRNA-stabilisierenden Protein HuR an der Zytokin-Effekt nahm abgerufen wurde: Erstens HuR Pr&auml;senz im Zytoplasma, geglaubt, um f&uuml;r die Stabilisierung der HuR-mediated mRNA erforderlich erh&ouml;ht sowohl die transformierten (BEAS-2B-Zelllinie) als auch die prim&auml;re bronchialen Epithelzellen nach Behandlung mit TNF-Alpha und IL-4. Zweite, endogene Eotaxin mRNA gefunden wurde, um an HuR in vivo zu binden, wie durch Immunopr&auml;zipitation der HuR-haltigen Bote-Gebiets-komplexe gefolgt von RT-PCR-Analyse in Echtzeit erkannt; Dieser Verein nach Zellenbehandlung mit TNF-Alpha und IL-4 erh&ouml;ht. Drittens eine &Uuml;berexpression von HuR in BEAS-2B-Zellen deutlich erh&ouml;ht den Ausdruck des Eotaxin mRNA und Protein. Unsere Ergebnisse implizieren mRNA Stabilisierung in der Zytokin-vermittelte Zunahme des Eotaxin Ausdruck und empfehlen eine Rolle f&uuml;r HuR in diesen Effekt.

Regulierung des Eotaxin-Genexpression von TNF-Alpha und IL-4 durch mRNA Stabilisierung: Beteiligung der RNS-bindene Proteine HuR.

Coordinated gene expression is influenced by transcriptional and posttranscriptional events and is necessary for efficient cell growth and differentiation. Genomic array technologies have afforded great advances in identifying global changes of gene expression in response to a variety of environmental stimuli. However, it has been a challenge to assess whether a concomitant effect on protein expression reflects the coordinated regulation of distinct subsets of mRNAs detected by cDNA arrays [Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (2001) 7018]. We have expanded the utility of cDNA arrays by using them to assist in elucidating combinatorial posttranscriptional eukaryotic operons [Mol. Cell 9 (2002) 1161]. In this study, we have used two mRNA partitioning methods in which: (1) subsets of mRNAs are isolated as endogenous mRNP complexes using autoimmune patient sera, and (2) transcriptional contributions to gene expression are assessed using cDNA array analysis of an en masse nuclear run-on assay (emRUN). The combination of these methods can provide an additional 'systems biology' discovery approach to gene expression analysis based upon the physical partitioning of mRNA subsets, as well as a functional partitioning of transcriptional and posttranscriptional processes. We demonstrate how these approaches can reduce transcriptomic complexity by partitioning mRNAs into biologically relevant subsets in order to derive information about the expression of multiple, but functionally linked, genes.

Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera.

Koordinierte Genexpression von transkriptionelle und Posttranscriptionale Ereignisse beeinflusst und ist notwendig f&uuml;r effiziente Zellwachstum und Differenzierung. Genomische Array-Technologien haben gro&szlig;e Fortschritte bei der Identifizierung von globaler &Auml;nderungen der Genexpression in Reaktion auf verschiedene Reize der Umwelt entzogen. Jedoch war es eine Herausforderung zu beurteilen, ob eine gleichzeitige Wirkung auf die Proteinexpression die koordinierte Verordnung unterschiedliche Teilmengen von mRNAs von cDNA-Arrays erkannt spiegelt [proc National Amauta Sci. U. S. A. 98 (2001) 7018]. Wir haben das Dienstprogramm von cDNA-Arrays mit ihnen Unterst&uuml;tzung bei der kombinatorischen Posttranscriptionale eukaryotischen Operone elucidating ausgebaut [mol Zelle 9 (2002) 1161]. In dieser Studie haben wir zwei Methoden der mRNA-Partitionierung verwendet, in denen: (1) Teilmengen von mRNAs sind als endogene mRNP-komplexe mit Autoimmun Patientenserum isoliert, und (2) transkriptionelle Beitr&auml;ge zur Genexpression werden anhand cDNA Array-Analyse eines massenhaft nukleare nachlaufenden Tests (EmRUN). Die Kombination dieser Methoden bieten eine zus&auml;tzliche &#39;Systems Biology&#39; Entdeckung Ansatz zur Genexpressionsanalyse basierend auf der physischen Partitionierung der mRNA Untergruppen, sowie eine funktionale Aufteilung des transkriptionelle und Posttranscriptionale Prozesse. Wir demonstrieren, wie diese Ans&auml;tze Transcriptomic Komplexit&auml;t verringern k&ouml;nnen, durch die Partitionierung von mRNAs in biologisch relevanten Teilmengen um Informationen zu den Ausdruck mehrerer ableiten zu k&ouml;nnen, aber funktional verbunden, Gene.

Genomweiten gesetzlichen Analyse mit massenhaft nukleare Run-ons und Ribonomic, die Profilerstellung mit Autoimmun Sera.

HuR is a ligand for nuclear mRNAs containing adenylate-uridylate-rich (ARE) elements in the 3'-untranslated region. Once bound to the mRNA, HuR is recognized by adapter proteins that then facilitate nuclear export of the complex. In the cytosol, HuR is thought to function to control stability and translation of its ligand message. We have previously demonstrated that HuR is constitutively expressed in the 3T3-L1 cells and shuttles from the nucleus to the cytosol, but remains predominantly nuclear in the preadipocytes and that as the cells differentiate, there is a marked increase in the proportion of HuR in the cytosol at any time. The GLUT1 glucose transporter is also expressed in both preadipocytes and adipocytes and in vitro RNA gel shifts indicate the mRNA is a ligand for HuR. However, HuR complexes containing the GLUT1 mRNA can only be isolated from the terminally differentiated adipocytes. Moreover, position analysis of the GLUT1 mRNA and HuR protein in polysome profiles demonstrates a shift to the most dense region of the gradient for both message and protein with adipocyte differentiation. Consistent with a regulatory role in the control of GLUT1 expression, siRNA-mediated decrease in HuR protein resulted in a decreased expression of GLUT1 protein. These data suggest that HuR contributes to the metabolic function of the adipocyte through mediation of post-transcriptional regulatory events.

The regulation of glucose transporter (GLUT1) expression by the RNA binding protein HuR.

HuR ist ein Ligand f&uuml;r nukleare mRNAs Containerelemente Adenylat-Uridylate-Reich (sind) in der Region nicht 3&#39;-&uuml;bersetzte. Einmal an die mRNA gebunden, wird HuR erkannt durch Adapter-Proteine, die dann nukleare Export des Komplexes zu erleichtern. In das Zytosol wird HuR gedacht, zur Kontrolle Stabilit&auml;t und &Uuml;bersetzung ihrer Liganden-Botschaft zu funktionieren. Wir haben bereits bewiesen, dass HuR konstitutiv in den Zellen 3T3-L1 und Shuttles vom Kern zu dem Zytosol angegeben, jedoch &uuml;berwiegend nukleare in den Preadipozyten bleibt und wie die Zellen zu unterscheiden, es eine deutliche Steigerung des Anteils der HuR in das Zytosol jederzeit gibt. Die GLUT1-Glucosetransporter dr&uuml;ckt sich auch in Preadipozyten und Adipozyten und in-vitro RNA-Gel-Schichten anzugeben, dass die mRNA ist ein Ligand f&uuml;r HuR. HuR-komplexe, die mit der GLUT1-mRNA k&ouml;nnen jedoch nur von unheilbar differenzierten Adipozyten isoliert sein. Dar&uuml;ber hinaus veranschaulicht Positionsanalyse des GLUT1-mRNA und HuR Protein in Polysom Profilen eine Verschiebung in den dichtesten Bereich des Farbverlaufs f&uuml;r Nachricht und Protein mit Adipozyt Differenzierung. Eine Rolle bei der Kontrolle der GLUT1-Ausdruck, SiRNA-vermittelte Abnahme der HuR Protein in einem verringerten Ausdruck des GLUT1-Protein f&uuml;hrte im Einklang stehen. Diese Daten legen nahe, dass HuR die metabolische Funktion des Adipozyt durch Vermittlung von Posttranskriptionale regulatorischen Veranstaltungen beitr&auml;gt.

Die Regelung der Glukose-Transporter (GLUT1)-Ausdruck durch die RNA-verbindliches Protein HuR.

Serum levels of YKL-40 have been associated with inflammatory diseases and breast cancer. Our purpose was to determine if YKL-40 in breast tissue, nipple aspirate fluid (NAF) and serum is (i) concentrated in NAF compared to matched serum, (ii) increased in the NAF, serum or tissue of women with biopsy proven precancer or cancer compared to healthy women and (iii) influenced by menopausal status. 118 women (61 healthy subjects, 10 with precancer and 47 with breast cancer) aged 17-95 years provided NAF with or without serum samples for analysis. Matched tissue was analyzed from a subset of subjects who underwent breast biopsy. All NAF and serum samples had detectable levels of YKL-40. Median YKL-40 levels for the entire cohort were 683 fold higher in NAF than serum. Premenopausal subjects had higher NAF and lower serum levels of YKL-40 than postmenopausal subjects. YKL-40 levels in NAF but not serum were higher in women with precancer (atypical hyperplasia and lobular carcinoma in situ) than in either healthy subjects (p = 0.025) or subjects with breast cancer (p = 0.015). In women with precancer, YKL-40 distribution in tissue correlated with YKL serum level (p = 0.043). YKL-40 is concentrated in NAF, with the highest concentrations in premenopausal women. NAF levels of YKL-40 are significantly higher in women with precancers than healthy subjects, suggesting that measuring YKL-40 in NAF may improve the identification of women at increased breast cancer risk.

Increased expression of the inflammatory protein YKL-40 in precancers of the breast.

Serumspiegel von YKL-40 wurden entz&uuml;ndliche Erkrankungen und Brustkrebs zugeordnet. Unser Ziel war, um festzustellen, ob YKL-40 in Brustgewebe, Nippel Aspiraten Fluid (NAF) und Serum i konzentriert sich NAF im Vergleich zu &uuml;bereinstimmenden Serum, (Ii) stieg im NAF, Serum oder Gewebe von Frauen mit Biopsie nachgewiesen Precancer oder Krebs im Vergleich zu gesunden Frauen und (Iii) von Wechseljahrsbeschwerden Status beeinflusst. 118 Frauen (61 gesunden Probanden, 10 mit Precancer und 47 mit Brustkrebs) im Alter von 17-95 Jahre NAF mit oder ohne Serumproben zur Analyse bereitgestellt. &Uuml;bereinstimmende Gewebe wurde aus einer Teilmenge von Themen analysiert, die Brust-Biopsie unterzogen. Alle NAF und Serum-Proben lag zwar nachweisbar YKL-40. Median YKL-40-Level f&uuml;r die gesamte Kohorte waren bei NAF h&ouml;her als Serum 683 Falten. Pr&auml;menopausalen Themen hatten h&ouml;here NAF und niedrigere Serumspiegel von YKL-40 als postmenopausalen Themen. YKL-40 Ebenen in NAF aber nicht Serum waren h&ouml;her bei Frauen mit Precancer (atypische Hyperplasie und lobul&auml;res Karzinom in situ) als in jedem gesunden Probanden (p = 0,025) oder Patienten mit Brustkrebs (p = 0,015). Bei Frauen mit Precancer, YKL-40 Verteilung im Gewebe korreliert mit YKL Serum-Niveau (p = 0,043). YKL-40 ist NAF, mit den h&ouml;chsten Konzentrationen bei pr&Atilde; &curren; menopausalen Frauen konzentriert. NAF sind YKL-40 bei Frauen mit Precancers deutlich &uuml;ber dem gesunden Probanden, die darauf hindeutet, dass die Messung YKL-40 in NAF die Identifikation von Frauen auf erh&ouml;htes Brustkrebsrisiko erh&ouml;hen kann.

Erh&ouml;hte Expression des Proteins entz&uuml;ndliche YKL-40 in Precancers der Brust.

IL-13, a critical cytokine in allergy, is regulated by as-yet-elusive mechanisms.

Posttranscriptional regulation of IL-13 in T cells: role of the RNA-binding protein HuR.

IL-13, eine kritische Cytokine in Allergie, wird von als-noch-fl&uuml;chtigen Mechanismen reguliert.

Posttranscriptionale Verordnung &uuml;ber IL-13 in T-Zellen: Rolle der RNS-bindene Proteine HuR.

Glucocorticoids (GCs) are the mainstay of anti-inflammatory therapy. Modulation of posttranscriptional regulation (PTR) of gene expression by GCs is a relevant yet poorly characterized mechanism of their action. The RNA-binding protein tristetraprolin (TTP) plays a central role in PTR by binding to AU-rich elements in the 3'-untranslated region of proinflammatory transcripts and accelerating their decay. We found that GCs induce TTP expression in primary and immortalized human bronchial epithelial cells. To investigate the importance of PTR and the role of TTP in GC function, we compared the effect of GC treatment on genome-wide gene expression using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) obtained from wild-type and TTP(-/-) mice. We confirmed that GCs induce TTP in MEFs and observed in TTP(-/-) MEFs a striking loss of up to 85% of GC-mediated gene expression. Gene regulation by TNF-alpha was similarly affected, as was the antagonistic effect of GC on TNF-alpha-induced response. Inflammatory genes, including cytokines and chemokines, were among the genes whose sensitivity to GCs was affected by lack of TTP. Silencing of TTP in WT MEFs by small interfering RNA confirmed loss of GC response in selected targets. Immunoprecipitation of ribonucleoprotein complexes revealed binding of TTP to several validated transcripts. Changes in the rate of transcript degradation studied by actinomycin D were documented for only a subset of transcripts bound to TTP. These results reveal a strong and previously unrecognized contribution of PTR to the anti-inflammatory action of GCs and point at TTP as a key factor mediating this process through a complex mechanism of action.

Role of the RNA-binding protein tristetraprolin in glucocorticoid-mediated gene regulation.

Glukokortikoide (GCs) sind die Hauptst&uuml;tze der entz&uuml;ndungshemmende Therapie. Modulation der Posttranscriptionale Regulation (PTR) der Genexpression von GCs ist, dass eine relevante noch schlecht ihre Wirkmechanismen gekennzeichnet. Die RNS-bindene Protein Tristetraprolin (TTP) spielt eine zentrale Rolle in PTR durch Binden an AU-reiche Elemente in der Region nicht 3&#39;-&uuml;bersetzte Proinflammatory Abschriften und Beschleunigung ihres Verfalls. Wir fanden, dass GCs TTP Ausdruck in Prim&auml;r- und verewigt menschlichen bronchialen Epithelzellen hervorrufen. Um die Bedeutung der PTR und die Rolle der TTP in GC-Funktion zu untersuchen, verglichen wir die Wirkung von GC-Behandlung auf genomweiten Genexpression mit M&auml;useembryonalen (MEFs) aus Wildtyp und TTP(-/-) M&auml;usen gewonnen. Wir best&auml;tigten, dass GCs TTP in MEFs induzieren und einen markanten Verlust von bis zu 85 % der GC-vermittelten Genexpression in TTP(-/-) MEFs beobachtet. Genregulation von TNF-Alpha wurde in &auml;hnlicher Weise betroffen, da die Antagonistische Wirkung der GC auf TNF-Alpha-induzierte Reaktion war. Entz&uuml;ndlichen Gene, wie Zytokine und Chemokine, geh&ouml;rten zu den Genen, deren Empfindlichkeit gegen&uuml;ber GCs durch mangelnde TTP betroffen war. Von TTP im WT MEFs von small interfering RNA Silencing best&auml;tigt Verlust des Ansprechens der GC in ausgew&auml;hlte Ziele. Immunopr&auml;zipitation-Gebiets-komplexe offenbart Bindung der TTP an mehrere validierte Abschriften. &Auml;nderungen in die Geschwindigkeit des Abbaus der Abschrift von Actinomycin D untersucht wurden f&uuml;r nur eine Teilmenge der Abschriften an TTP gebunden dokumentiert. Diese Ergebnisse zeigen einen starken und zuvor unbekannten Beitrag der PTR auf die entz&uuml;ndungshemmende Wirkung des GCs und zeigen auf TTP als Schl&uuml;sselfaktor Vermittlung dieser Proze&szlig; durch einen komplexen Mechanismus der Aktion.

Rolle von der RNS-bindene Protein Tristetraprolin in Glukokortikoid-vermittelte Genregulation.

Es ist nachgewiesen, dass extrazellul&auml;re mRNA in der Zirkulation festgestellt werden kann. Unsere Hypothese war, dass die zirkulierenden MiRNAs sind auch vorhanden und differentiell exprimierten im Serum von Patientinnen mit Brustkrebs im Vergleich zu Kontrollen.

Zirkulierende MicroRNAs Brustkrebs und gesunden Probanden.

It has been demonstrated that extracellular mRNA can be detected in the circulation. Our hypothesis was that circulating miRNAs are also present and differentially expressed in the serum of breast cancer patients compared to controls.

Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.

The discordance between steady-state levels of mRNAs and protein has been attributed to posttranscriptional control mechanisms affecting mRNA stability and translation. Traditional methods of genome wide microarray analysis, profiling steady-state levels of mRNA, may miss important mRNA targets owing to significant posttranscriptional gene regulation by RNA binding proteins (RBPs).

The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer.

Die Diskordanz zwischen station&auml;ren mRNAs und Protein wurde auf Posttranscriptionale Kontrollmechanismen, die die Stabilit&auml;t der mRNA und &Uuml;bersetzung zur&uuml;ckgef&uuml;hrt. Traditionelle Methoden der Genom-breiten Microarray-Analyse, Profilerstellung station&auml;ren Ebenen der mRNA, k&ouml;nnen wichtige Ziele der mRNA aufgrund der erheblichen Posttranscriptionale Genregulation durch RNA-bindende Proteine (RBPs) verpasst.

Das RNA-verbindliches Protein HuR regelt differentiell eindeutigen Teilmengen von mRNAs &Ouml;strogen-Rezeptor-negativen und &Ouml;strogen-Rezeptor-positivem Brustkrebs.

Interactions between RNA binding proteins (RBPs) and genes are not well understood, especially in regulation of angiogenesis. The RBP HuR binds to the AU-rich (ARE) regions of labile mRNAs, facilitating their translation into protein and has been hypothesized to be a tumor-maintenance gene. Elevated levels of cytoplasmic HuR directly correlate with increased invasiveness and poor prognosis for many cancers, including those of the breast. HuR controls the expression of multiple genes involved in angiogenesis including VEGFÎ±, HIF1Î± and thrombospondin 1 (TSP1). We investigated the role of HuR in estrogen receptor negative (ER(-)) breast cancer. MDA-MB-231 cells with higher levels of HuR have alterations in cell cycle kinetics and faster growth. Unexpectedly, HuR overexpression significantly interfered with tumor growth in orthotopic mouse models. The putative mechanism seems to be an anti-angiogenetic effect by increasing expression of TSP1 but also surprisingly, downregulating VEGF, a target which HuR normally increases. Our findings reveal that HuR may be regulating a cluster of genes involved in blood vessel formation which controls tumor angiogenesis. An approach of modulating HuR levels may overcome limitations associated with monotherapies targeting tumor vessel formation.

Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis.

Interaktionen zwischen RNA-bindende Proteine (RBPs) und Genen sind nicht gut, vor allem bei der Regulierung der Angiogenese verstanden. Die RBP-HuR bindet an den AU-Reich (ARE) Regionen zersetzliche mRNAs, erleichtern deren &Uuml;bersetzung in Proteine und hat um ein Tumor-Wartung-gen werden theoretisiert worden. Erh&ouml;hte Konzentrationen von zytoplasmatischen HuR korrelieren direkt mit erh&ouml;hter Invasivit&auml;t und schlechte Prognose bei vielen Krebsarten, einschlie&szlig;lich derjenigen der Brust. HuR steuert die Expression von mehreren Genen Angiogenese, einschlie&szlig;lich VEGF&alpha;, HIF1&alpha; und Thrombospondin 1 (TSP1) beteiligt. Wir untersuchten die Rolle der HuR &Ouml;strogen-Rezeptor-negativen (ER(-))-Brustkrebs. MDA-MB-231-Zellen mit h&ouml;herem HuR haben &Auml;nderungen in Zellzykluskinetik und schnelleres Wachstum. HuR &Uuml;berexpression mischte sich unerwartet deutlich mit Tumorwachstum in Orthotopic Mausmodelle. Der vermeintliche Mechanismus scheint eine Anti-Angiogenetic Wirkung durch die Erh&ouml;hung der Expression von TSP1 aber auch &uuml;berraschend Herunterregulierung VEGF, ein Ziel, das HuR normalerweise erh&ouml;ht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass HuR einen Cluster von Genen, die bei Blutgef&auml;&szlig;-Bildung regulieren kann die Tumorangiogenese steuert. Ein Ansatz der modulierenden HuR Ebenen kann Einschr&auml;nkungen zugeordnet Monotherapies Zielgruppenadressierung Schiff Tumorbildung &uuml;berwinden.

Eine &Uuml;berexpression von der RNA verbindliches Protein beeintr&auml;chtigt HuR Tumorwachstum in Dreifach negativem Brustkrebs mangelhaft Angiogenese zugeordnet.

HuR is a regulator of mRNA turnover or translation of inflammatory genes through binding to adenylate-uridylate-rich elements and related motifs present in the 3'untranslated region (UTR) of mRNAs. We postulate that HuR critically regulates the epithelial response by associating with multiple ARE-bearing, functionally related inflammatory transcripts. We aimed to identify HuR targets in the human airway epithelial cell line BEAS-2B challenged with TNF-Î± plus IFN-Î³, a strong stimulus for inflammatory epithelial responses. Ribonucleoprotein complexes from resting and cytokine-treated cells were immunoprecipitated using anti-HuR and isotype-control Ab, and eluted mRNAs were reverse-transcribed and hybridized to an inflammatory-focused gene array. The chemokines CCL2, CCL8, CXCL1, and CXCL2 ranked highest among 27 signaling and inflammatory genes significantly enriched in the HuR RNP-IP from stimulated cells over the control immunoprecipitation. Among these, 20 displayed published HuR binding motifs. Association of HuR with the four endogenous chemokine mRNAs was validated by single-gene ribonucleoprotein-immunoprecipitation and shown to be 3'UTR-dependent by biotin pull-down assay. Cytokine treatment increased mRNA stability only for CCL2 and CCL8, and transient silencing and overexpression of HuR affected only CCL2 and CCL8 expression in primary and transformed epithelial cells. Cytokine-induced CCL2 mRNA was predominantly cytoplasmic. Conversely, CXCL1 mRNA remained mostly nuclear and unaffected, as CXCL2, by changes in HuR levels. Increase in cytoplasmic HuR and HuR target expression partially relied on the inhibition of AMP-dependent kinase, a negative regulator of HuR nucleocytoplasmic shuttling. HuR-mediated regulation in airway epithelium appears broader than previously appreciated, coordinating numerous inflammatory genes through multiple posttranscriptional mechanisms.

Chemokine transcripts as targets of the RNA-binding protein HuR in human airway epithelium.

HuR ist ein Regulator der mRNA Umsatz oder &Uuml;bersetzung von entz&uuml;ndlichen Gene durch Bindung an Adenylat-Uridylate-Reich-Elemente und &auml;hnliche Motive in der 3&#39; un&uuml;bersetzte Region (UTR) mRNAs. Wir postulieren, dass HuR kritisch die epitheliale Antwort regelt durch Zuordnen zu mehreren sind tragende, funktional &auml;hnliche entz&uuml;ndliche Abschriften. Wir wollten HuR Ziele in der menschlichen Atemwege Epithelialer Zellen zu identifizieren, die BEAS-2B mit TNF-&alpha; und IFN-&gamma;, ein starker Anreiz f&uuml;r entz&uuml;ndliche epitheliale Antworten in Frage gestellt. -Gebiets-komplexe von ruhelosigkeit und Zytokin-behandelten Zellen waren Immunoprecipitated mit Anti-HuR und Isotype-Steuerung Ab und eluierten mRNAs waren umgekehrt transkribiert und in ein Array von entz&uuml;ndlichen ausgerichtete gen hybridisierten. Die Chemokine CCL2, CCL8, CXCL1 und CXCL2, die h&ouml;chste z&auml;hlt zu den 27 Signalisierung und entz&uuml;ndlichen Gene erheblich bereichert in der HuR RNP-IP aus stimulierten Zellen &uuml;ber die Steuerelement-Immunopr&auml;zipitation. Unter diesen ver&ouml;ffentlicht 20 angezeigt HuR Bindung Motive. Verband der HuR mit den vier endogene Chemokine mRNAs war von Einzel-gen Ribonucleoprotein-Immunopr&auml;zipitation validiert und gezeigt, dass 3&#39;UTR-abh&auml;ngig von Biotin Pulldown-Assay. Zytokin-Behandlung erh&ouml;hte mRNA Stabilit&auml;t nur f&uuml;r CCL2 und CCL8, und vor&uuml;bergehend zum Schweigen und eine &Uuml;berexpression von HuR betroffen nur CCL2 und CCL8 Ausdruck in Prim&auml;r- und transformierten Epithelzellen. Zytokin-induzierte CCL2 mRNA war &uuml;berwiegend zytoplasmatischen. Umgekehrt CXCL1 mRNA meist nukleare und blieb unber&uuml;hrt, als CXCL2, HuR &Auml;nderungen. Zunahme der zytoplasmatischen HuR und HuR Zielausdruck teilweise auf die Hemmung der AMP-abh&auml;ngige Kinase, ein negativer Regulator der HuR Nucleocytoplasmic pendelt. HuR-vermittelte Verordnung in Airway Epithel erscheint breiter, als zuvor gesch&auml;tzt, Koordinierung der zahlreichen entz&uuml;ndlichen Gene durch mehrere Posttranscriptionale Mechanismen.

Chemokine Transkripte als Ziele der RNS-bindene Proteine HuR in menschlichen Atemwege Epithel.

The posttranscriptional mechanisms whereby RNA-binding proteins (RBPs) regulate T cell differentiation remain unclear. RBPs can coordinately regulate the expression of functionally related genes via binding to shared regulatory sequences, such as the adenylate-uridylate-rich elements (AREs) present in the 3' untranslated region (UTR) of mRNA. The RBP HuR posttranscriptionally regulates IL-4, IL-13, and other Th2 cell-restricted transcripts. We hypothesized that the ARE-bearing GATA-3 gene, a critical regulator of Th2 polarization, is under HuR control as part of its coordinate posttranscriptional regulation of the Th2 program. We report that in parallel with stimulus-induced increase in GATA-3 mRNA and protein levels, GATA-3 mRNA half-life is increased after restimulation in the human T cell line Jurkat, in human memory and Th2 cells, and in murine Th2-skewed cells. We demonstrate by immunoprecipitation of ribonucleoprotein complexes that HuR associates with the GATA-3 endogenous transcript in human T cells and found, using biotin pulldown assay, that HuR specifically interacts with its 3'UTR. Using both loss-of-function and gain-of-function approaches in vitro and in animal models, we show that HuR is a critical mediator of stimulus-induced increase in GATA-3 mRNA and protein expression and that it positively influences GATA-3 mRNA turnover, in parallel with selective promotion of Th2 cytokine overexpression. These results suggest that HuR-driven posttranscriptional control plays a significant role in T cell development and effector function in both murine and human systems. A better understanding of HuR-mediated control of Th2 polarization may have utility in altering allergic airway inflammation in human asthmatic patients.

Coordinate regulation of GATA-3 and Th2 cytokine gene expression by the RNA-binding protein HuR.

Die Posttranscriptionale Mechanismen, die bei dem RNA-bindende Proteine (RBPs) T-Zell-Differenzierung regulieren bleiben unklar. RBPs kann coordinately regulieren die Expression von verwandeten Genen &uuml;ber Bindung an gemeinsame regulatorische Sequenzen, wie z. B. die Adenylat-Uridylate-Reich-Elemente (AREs) in der 3&#39; un&uuml;bersetzte Region (UTR) der mRNA. Die RBP-HuR regelt posttranscriptionally IL-4, IL-13 und andere Th2-Zelle-eingeschr&auml;nkte-Transkripte. Wir die Hypothese, dass das sind tragende GATA-3 gen, ein wichtiger Regulator der Th2-Polarisation, als Teil seiner Koordinaten Posttranscriptionale Regulation des Programms Th2 HuR Kontrolle unterliegt. Wir berichten, dass parallel zu den Reiz-induzierten Anstieg GATA-3 mRNA und Protein, GATA-3 mRNA-Halbwertszeit nach Restimulation in der menschlichen T-Zell-Linie Jurkat, im menschlichen Ged&auml;chtnis und Th2 Zellen und in murinen verzerrt, Th2 Zellen erh&ouml;ht wird. Wir demonstrieren durch Immunopr&auml;zipitation-Gebiets-komplexe, die die GATA-3 endogene Abschrift in den menschlichen T-Zellen HuR zuordnet und gefunden, Biotin-Pulldown-Probe, die HuR, die speziell mit interagiert mit seiner 3&#39;UTR. Anhand der Verlustfunktion und Gain of Function Ans&auml;tze in vitro und in Tiermodellen zeigen wir, dass HuR ein kritischer Vermittler von Reiz-induzierte Zunahme GATA-3-mRNA und Protein-Expression und GATA-3 mRNA Umsatz, parallel zu selektive F&ouml;rderung von Th2 Cytokine &Uuml;berexpression positiv beeinflusst. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HuR-gesteuerte Posttranscriptionale Kontrolle eine bedeutende Rolle in T-Zell-Entwicklung und Effektor-Funktion sowohl murinen und menschliche Systeme spielt. Ein besseres Verst&auml;ndnis der HuR-vermittelte Kontrolle der Th2-Polarisierung m&ouml;glicherweise Dienstprogramm allergischen Atemwegsentz&uuml;ndung in menschlichen Asthma-Patienten zu &auml;ndern.

Article	Year
RNA-binding protein HuR enhances p53 translation in response to ultraviolet light irradiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 12821781	2003
Role of HuR in skeletal myogenesis through coordinate regulation of muscle differentiation genes. Molecular and cellular biology\| PubMed ID: 12832484	2003
Regulation of eotaxin gene expression by TNF-alpha and IL-4 through mRNA stabilization: involvement of the RNA-binding protein HuR. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950)\| PubMed ID: 14530362	2003
Genome-wide regulatory analysis using en masse nuclear run-ons and ribonomic profiling with autoimmune sera. Gene\| PubMed ID: 14604794	2003
The regulation of glucose transporter (GLUT1) expression by the RNA binding protein HuR. Journal of cellular biochemistry\| PubMed ID: 16639702	2006
Increased expression of the inflammatory protein YKL-40 in precancers of the breast. International journal of cancer. Journal international du cancer\| PubMed ID: 17565739	2007
Posttranscriptional regulation of IL-13 in T cells: role of the RNA-binding protein HuR. The Journal of allergy and clinical immunology\| PubMed ID: 18279945	2008
Role of the RNA-binding protein tristetraprolin in glucocorticoid-mediated gene regulation. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950)\| PubMed ID: 18523301	2008
Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects. BMC research notes\| PubMed ID: 19454029	2009
The RNA binding protein HuR differentially regulates unique subsets of mRNAs in estrogen receptor negative and estrogen receptor positive breast cancer. BMC cancer\| PubMed ID: 20370918	2010
Overexpression of the RNA binding protein HuR impairs tumor growth in triple negative breast cancer associated with deficient angiogenesis. Cell cycle (Georgetown, Tex.)\| PubMed ID: 20724828	2010
Chemokine transcripts as targets of the RNA-binding protein HuR in human airway epithelium. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950)\| PubMed ID: 21220697	2011
Coordinate regulation of GATA-3 and Th2 cytokine gene expression by the RNA-binding protein HuR. Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950)\| PubMed ID: 21613615	2011

Ulus Atasoy

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