homemade-site-directed-mutagenesis-of-whole-plasmids

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Crop loss due to viral diseases is still a major problem for agriculture today. We present a strategy to achieve virus resistance based on the expression of single-chain Fv fragments (scFvs) against a conserved domain in a plant viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), a key enzyme in virus replication. The selected scFvs inhibited complementary RNA synthesis of different plant virus RdRps in vitro and virus replication in planta. Moreover, the scFvs also bound to the RdRp of the distantly related hepatitis C virus. T(1) and T(2) progeny of transgenic lines of Nicotiana benthamiana expressing different scFvs either in the cytosol or in the endoplasmic reticulum showed varying degrees of resistance against four plant viruses from different genera, three of which belong to the Tombusviridae family. Virus resistance based on antibodies to RdRps adds another tool to the repertoire for combating plant viruses.

Single-chain antibodies against a plant viral RNA-dependent RNA polymerase confer virus resistance.

Einzelketten-Antik&#xF6;rper gegen einen pflanzlichen viralen RNA-abh&#xE4;ngigen RNA-Polymerase Virusresistenz zu verleihen.

This study was performed to determine the prevalence and genotypes of Cryptosporidium species among HIV patients and cattle in Thailand. Stool specimens were collected from 46 HIV patients from Prabat Nampu Temple, Lop Buri Province in central Thailand. Two hundred fecal samples from dairy cattle were collected from seven farms in Chon Buri Province, the eastern part of Thailand. Each sample was concentrated by Sheather's sucrose flotation technique and stained by acid fast stain (AFS) for the identification of oocysts by microscopy. All HIV stool samples and 83 fecal specimens from cattle were further tested using nested polymerase chain reaction (PCR) targeting the 18S SSUrRNA gene to characterize the detected species. In HIV patient samples, the detection rate was 28.7% by AFS and 4.35% by nested PCR. In cattle samples, the detection rate was 13% by AFS and 9.63% by nested PCR. After DNA sequencing results, we identified the genotypes of the Cryptosporidium from seven of the PCR positive samples. All were found to be C. parvum. The findings presented here represent the first genetic identification of Cryptosporidium species in cattle in Thailand.

Prevalence and molecular characterization of human and bovine Cryptosporidium isolates in Thailand.

Diese Studie wurde durchgef&uuml;hrt, um zu bestimmen, die Pr&auml;valenz und die Genotypen von Cryptosporidium Arten bei HIV-Patienten und Rinder in Thailand. Hocker Exemplare wurden gesammelt von 46 HIV-Patienten aus Prabat Nampu Tempel, Lop Buri Provinz in Zentral-Thailand. Zweihundert f&auml;kale Proben von Milchk&uuml;hen wurden von sieben Bauernh&ouml;fen in der Provinz Chonburi, der &ouml;stliche Teil von Thailand gesammelt. Jede Probe wurde durch die Sheather Saccharose Flotation Technik konzentriert und Mikroskopie von S&auml;ure schnell Fleck (AFS) zur Identifizierung von Oozysten Makel. Alle HIV-Stuhlproben und 83 f&auml;kale Proben von Rindern wurden weiter getestet mit geschachtelten Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die Ausrichtung des 18S SSUrRNA Gens, um die gefundenen Arten zu charakterisieren. In HIV Patientenproben war die Erkennungsrate 28,7 % von AFS und 4,35 % von verschachtelten PCR. Bei Rindern Proben war die Erkennungsrate 13 % von AFS und 9,63 % von verschachtelten PCR. Nach DNA-Sequenzierung Ergebnisse haben wir die Genotypen von Cryptosporidium von sieben der PCR positiven Proben identifiziert. Alle wurden gefunden, C. Parvum sein. Die hier vorgestellten Ergebnisse repr&auml;sentieren die erste genetische Identifizierung von Cryptosporidium Arten bei Rindern in Thailand.

Pr&auml;valenz und molekulare Charakterisierung von menschlichen und Rinder Cryptosporidium isoliert in Thailand.

Ectopically expressed rice yellow mottle virus P1 fusion proteins were found to be cleaved in planta and in Escherichia coli. Cleavage takes place in the absence of bacterial protease activity, indicating that the P1 fusion is autocatalytically processed independently of host factors. N-terminal sequencing of the C-terminal cleavage product of transiently expressed P1/GFP (green fluorescence protein) in Nicotiana benthamiana showed that the cleavage site is located between the first two amino acids (aa) downstream of the P1 sequence. Mutagenesis experiments revealed that a phenylalanine to valine substitution at position 157 of the P1 aa sequence impairs proper cleavage, which is nearly unaffected by replacement of phenylalanine with tyrosine. Deletion of methionine(159) (first GFP aa residue) appeared to not affect P1/GFP cleavage. N-terminal P1-tagging with GFP turned out to impair autocleavage, whereas a small His-tag could not fully prevent cleavage. Additionally, a modified P1/GFP carrying an N-terminal deletion of 81 aa was not cleaved. These findings indicate that this region is involved in the proteolysis mechanism and that large N-terminal fusion partners might affect correct folding of the P1 necessary for self-catalysis.

Analysis of an autoproteolytic activity of rice yellow mottle virus silencing suppressor P1.

Ectopically ausgedr&uuml;ckt Reis gelb Mottle Virus P1 Schmelzverfahrensproteine gefunden wurden, um zerspaltet werden in Planta und Escherichia coli. Spaltung erfolgt keine bakterielle Protease-Aktivit&auml;t, die darauf hinweist, dass die P1-Fusion autocatalytically unabh&auml;ngig von der Host Faktoren verarbeitet wird. N-terminale Sequenzierung der C-terminalen Spaltung Produkt der vor&uuml;bergehend ausgedr&uuml;ckt P1/GFP (gr&uuml;ne Fluoreszenz-Protein) in Nicotiana Benthamiana zeigte, dass der Standort einer Spaltung zwischen den ersten beiden Aminos&auml;uren (aa) stromabw&auml;rts der P1-Sequenz befindet. Mutagenese-Experimente zeigten, dass eine Phenylalanin zu Valin Substitution an Position 157 der P1-aa-Sequenz richtige Spaltung, beeintr&auml;chtigt die Ersetzung von Phenylalanin mit Tyrosin fast unber&uuml;hrt ist. Streichung des methionine(159) (erste GFP-aa-R&uuml;ckstand) erschien, P1/GFP Spaltung nicht beeintr&auml;chtigen. N-terminale P1-Etikettieren mit GFP erwies sich als Autocleavage, beeintr&auml;chtigen, w&auml;hrend ein kleiner His-Tag nicht vollst&auml;ndig Spaltung verhindert werden kann. Dar&uuml;ber hinaus eine modifizierte P1/GFP tragen eine N-terminale Deletion von 81 aa war nicht zerspaltet. Diese Befunde zeigen, dass diese Region in der Proteolyse-Mechanismus beteiligt ist und die gro&szlig;e N-terminale Fusion Partner auswirken k&ouml;nnen korrekte Faltung der P1 f&uuml;r selbst-Katalyse.

Analyse einer Autoproteolytic T&auml;tigkeit des Reis gelb Mottle Virus Unterdr&uuml;ckender Schutzbeschaltung P1.

Eighty fecal samples from pre-weaned calves with diarrhea were collected in the Tokachi area in Northern Japan to investigate the prevalence of Cryptosporidium species in such animals. Oocysts from fecal samples collected from each animal were concentrated using sucrose gradient centrifugation. Genomic DNA was extracted from each sample and processed by nested PCR to amplify the partial SSU rRNA gene of Cryptosporidium. Cryptosporidium infections were detected in 75% of the samples. Sequence analysis was performed on all positive samples. Phylogenetic analysis of 33 successfully sequenced isolates of the SSUrRNA PCR products revealed all but one were Cryptosporidium parvum infections. The remaining single case was Cryptosporidium bovis. These findings suggest that C. parvum is prevalent in diarrheic pre-weaned calves and can be a source of cryptosporidial infections for humans and animals in Hokkaido.

First description of Cryptosporidium bovis in Japan and diagnosis and genotyping of Cryptosporidium spp. in diarrheic pre-weaned calves in Hokkaido.

Achtzig f&auml;kale Proben aus pre-weaned K&auml;lber mit Durchfall wurden gesammelt im Bereich Tokachi im Norden Japans, die Pr&auml;valenz von Cryptosporidium Arten in solche Tiere zu untersuchen. Oozysten von den f&auml;kalen Proben von jedem Tier zusammengestellt wurden konzentriert mit Saccharose-Gradienten-Zentrifugierung. Genomischer DNA wurde aus jeder Probe extrahiert und verarbeitet von verschachtelten PCR, die teilweise SSU rRNS Gens von Cryptosporidium zu verst&auml;rken. Cryptosporidium-Infektionen wurden bei 75 % der Proben festgestellt. Sequenzanalyse wurde an alle positiven Proben durchgef&uuml;hrt. Phylogenetische Analyse von 33 erfolgreich sequenzierte Isolaten der SSUrRNA PCR-Produkte ergab, dass alle au&szlig;er einem Cryptosporidium Parvum Infektionen waren. Die verbleibenden Einzelfall war Cryptosporidium Bovis. Diese Forschungsergebnisse legen nahe, dass C. Parvum ist weit verbreitet in diarrheic pre-weaned K&auml;lber und kann eine Quelle von Cryptosporidial Infektionen f&uuml;r Menschen und Tiere in Hokkaido.

Erste Beschreibung des Cryptosporidium Bovis in Japan und Diagnose und Genotypisierung von Cryptosporidium spp. in diarrheic pre-weaned K&auml;lber in Hokkaido.

HC-Pro is a helper component-proteinase which acts as a multifunctional protein in the potyviral life cycle. Apart from its proteolytic activity, HC-Pro has the capacity to bind duplex small RNAs (sRNAs). To investigate HC-Pro-mediated sRNA binding in vitro, high amounts of purified protein are required. For this purpose, the Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) HC-Pro was expressed as a fusion with hexa-histidine (6xHis) or maltose-binding protein (MBP) in Escherichia coli. The expressed fusion proteins were purified by affinity chromatography. 6xHis:HC-Pro and MBP:HC-Pro were partially soluble. Electrophoretic mobility-shift assays demonstrated that only MBP:HC-Pro exhibits the sRNA binding activity. The recombinant HC-Pro bound 21 bp siRNAs as well as 19 bp and 24 bp siRNAs. A point mutation in the highly conserved FRNK box produced the HC-Pro(FINK) protein, previously shown to be associated with reduced viral symptoms and weak sRNA binding. In this study, sRNA binding of the MBP:HA-HC-Pro(FINK) was not detectable. The high yield of purified HC-Pro offers the possibility to study the biochemistry of the protein in detail.

Expression, purification and functional characterization of recombinant Zucchini yellow mosaic virus HC-Pro.

HC-Pro ist ein Helfer-Komponente-Proteinase fungiert als multifunktionale Protein im Lebenszyklus Potyviral. Abgesehen von seiner proteolytische Aktivit&auml;t hat HC-Pro duplex kleine RNAs (sRNAs) zu verpflichten. HC-Pro-vermittelter sRNA Bindung in-vitro-Untersuchung, werden hohe Mengen an gereinigtes Protein ben&ouml;tigt. Zu diesem Zweck die Zucchini gelb Mosaik-Virus (ZYMV) HC-Pro wurde ausgedr&uuml;ckt als eine Fusion mit Hexa-Histidin (6xHis) oder Maltose-verbindliches Protein (MBP) in Escherichia coli. Die ausdr&uuml;ckliche Schmelzverfahrensproteine wurden durch Affinit&auml;tschromatographie gereinigt. 6xHis:HC-Pro und MBP:HC-Pro wurden teilweise l&ouml;slich. Elektrophoretische Mobilit&auml;t-UMSCHALT-Assays gezeigt, dass nur MBP:HC-Pro stellt die sRNA-Bindung-Aktivit&auml;t. Das rekombinante HC-Pro gebunden 21 bp SiRNAs sowie 19 bp und 24 bp SiRNAs. Eine Punktmutation im Feld stark konservierten FRNK produziert das HC-Pro(FINK)-Protein, das zuvor gezeigte reduzierte virale Symptome und schwache sRNA-Bindung zugeordnet werden. In dieser Studie wurde sRNA Bindung von der MBP:HA-HC-Pro(FINK) nicht nachweisbar. Der hohe Ertrag von gereinigtem HC-Pro bietet die M&ouml;glichkeit die Biochemie des Proteins im Detail zu studieren.

Ausdruck, Reinigung und Funktionelle Charakterisierung von rekombinanten Zucchini gelb Mosaik-Virus HC-Pro.

The helper component-proteinase (HC-Pro) is a multifunctional protein found among potyviruses. With respect to its silencing suppressor function, small RNA binding appears to be the major activity of HC-Pro. HC-Pro could also exhibit other suppressor activities. HC-Pro may inhibit the Hua Enhancer 1 (HEN1) activity. There is indirect evidence showing that either transient or stable expression of HC-Pro in plants results in an increase of non-methylated small RNAs. Here, we demonstrated that recombinant Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) HC-Pro inhibited the methyltransferase activity of HEN1 in vitro. Moreover, we found that the HC-Pro(FINK) mutant, which has lost small RNA-binding activity, inhibited HEN1 activity, while the truncated proteins and total soluble bacterial proteins did not. Using the ELISA-binding assay, we provided evidence that the HC-Pro(FRNK) wild-type and HC-Pro(FINK) both bound to HEN1, with HC-Pro(FRNK) binding stronger than HC-Pro(FINK). Motif mapping analysis revealed that the amino acids located between positions 139 and 320 of ZYMV HC-Pro were associated with HEN1 interaction.

The helper component-proteinase of the Zucchini yellow mosaic virus inhibits the Hua Enhancer 1 methyltransferase activity in vitro.

Die Helfer-Komponente-Proteinase (HC-Pro) ist ein multifunktionales Protein unter Potyviruses gefunden. In Bezug auf seine silencing Tumorsuppressor-Funktion scheint kleine RNA-Bindung die Hauptaktivit&auml;t des HC-Pro. HC-Pro k&ouml;nnte auch andere Tumorsuppressor-Aktivit&auml;ten zeigen. HC-Pro kann die Hua-Enhancer-1 (Huhns1)-Aktivit&auml;t hemmen. Es gibt indirekte Beweise daf&uuml;r, dass entweder vor&uuml;bergehend oder stabile Ausdruck des HC-Pro in Pflanzen f&uuml;hrt zu einem Anstieg von kleine RNAs nicht methyliert. Hier wir bewiesen, dass rekombinante Zucchini yellow Mosaic Virus (ZYMV) HC-Pro hemmte die Methyltransferase-Aktivit&auml;t von in-vitro-Huhns1. Dar&uuml;ber hinaus fanden wir, dass die HC-Pro(FINK)-Mutant, die kleine RNS-bindene Aktivit&auml;t verloren hat, Huhns1 Aktivit&auml;t, gehemmt, w&auml;hrend die abgeschnittene Proteine und total l&ouml;sliche bakterielle Proteine nicht. Unter Verwendung der ELISA-Bindung-Probe, haben wir Beweise, die sowohl die HC-Pro(FRNK) Wild-Typ als auch HC-Pro(FINK) an Huhns1, mit HC-Pro(FRNK) binden st&auml;rker als HC-Pro(FINK) gebunden. Motiv-Zuordnung-Analyse ergab, dass die Aminos&auml;uren, gelegen zwischen Positionen 139 und 320 von ZYMV HC-Pro Huhns1 Interaktion zugeordnet waren.

Die Helfer-Komponente-Proteinase des Zucchini yellow Mosaic Virus hemmt die Hua Enhancer 1-Methyltransferase-Aktivit&auml;t in-vitro.

In plants, transgenes frequently become spontaneously silenced for unknown reasons. Typically, transgene silencing involves the generation of small interfering RNAs (siRNAs) that directly or indirectly target cognate DNA and mRNA sequences for methylation and degradation, respectively. In this report, we compared spontaneous silencing of a transgene in Nicotiana benthamiana and Nicotiana tabacum. In both species, abundant siRNAs were produced. In N. benthamiana, the self-silencing process involved mRNA degradation and dense DNA methylation of the homologous coding region. In N. tabacum, self-silencing occurred without complete mRNA degradation and with low methylation of the cognate coding region. Our data indicated that in plants, siRNA-mediated spontaneous silencing is, in addition to mRNA degradation, based on translational inhibition. Differences in the initiation and establishment of self-silencing together with marked differences in the degree of de novo DNA methylation showed that the mechanistic details of RNA silencing, although largely conserved, may vary also in genetically close plant species.

Diverse spontaneous silencing of a transgene among two Nicotiana species.

Bei Pflanzen werden transgene h&auml;ufig spontan aus unbekannten Gr&uuml;nden verstummt. In der Regel beinhaltet die Transgene Schweigen zu die Generation von kleinen interferierender RNAs (SiRNAs), die direkt oder indirekt cognate DNA und mRNA-Sequenzen f&uuml;r Methylierung und Erniedrigung, bzw. Ziel. In diesem Bericht verglichen wir spontan zum Schweigen, der ein Transgen in Nicotiana Benthamiana und Nicotiana Tabacum. Beide Arten wurden reichlich SiRNAs produziert. N. Benthamiana beteiligt der self-silencing Prozess mRNA Abbau- und dichten DNA-Methylierung der homologen kodierende Region. In N. Tabacum kam die self-silencing ohne vollst&auml;ndiger Abbau der mRNA und mit niedrigen Methylierung von das Cognate Kodierung der Region. Unsere Daten zeigten, dass in Pflanzen, SiRNA-vermittelte spontane Unterdr&uuml;ckender neben mRNA Abbau, auf translational Hemmung basiert. Unterschiede in der Initiierung und Etablierung eines self-silencing zusammen mit deutliche Unterschiede im Grad der de Novo DNA-Methylierung zeigte, dass die mechanistischen Details RNA silencing, schlie&szlig;en Obwohl weitgehend konserviert, variieren auch genetisch Pflanzenarten.

Diverse spontane Unterdr&uuml;ckender von eine Transgene unter zwei Nicotiana-Arten.

The multifunctional helper component proteinase (HC-Pro) of potyviruses contains an autoproteolytic function that, together with the protein 1 (P1) and NIa proteinase, processes the polyprotein into mature proteins. In this study, we analysed the autoproteolytic active domain of zucchini yellow mosaic virus (ZYMV) HC-Pro. Several Escherichia coli-expressed MBP:HC-Pro:GFP mutants containing deletions or point mutations at either the N- or C-terminus of the HC-Pro protein were examined. Our results showed that amino acids essential for the proteolytic activity of ZYMV HC-Pro are distinct from those of the tobacco etch virus HC-Pro, although the amino acid sequences in the proteolytic active domain are conserved among potyviruses.

Analysis of the autoproteolytic activity of the recombinant helper component proteinase from zucchini yellow mosaic virus.

Die multifunktionale Helfer Komponente Proteinase (HC-Pro) des Potyviruses enth&auml;lt eine Autoproteolytic Funktion, die zusammen mit dem Protein 1 (P1) und NIa Proteinase, verarbeitet das Polyprotein in Reife Proteine. In dieser Studie analysierten wir Autoproteolytic active Dom&auml;ne Zucchini yellow Mosaic Virus (ZYMV) HC-Pro. Mehrere Escherichia-coli-ausgedr&uuml;ckt-MBP:HC-Pro: GFP-Mutanten mit L&ouml;schungen oder Punktmutationen auf entweder die N - oder Carboxyl-Terminus des Proteins HC-Pro wurden untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten, dass Aminos&auml;uren essenziell f&uuml;r die proteolytische Aktivit&auml;t der ZYMV HC-Pro unterscheiden sich von denen des Tabaks etch Virus HC-Pro, obwohl in der Aminos&auml;ure-Sequenzen sind proteolytische active-Dom&auml;ne unter Potyviruses konserviert.

Article	Year
Single-chain antibodies against a plant viral RNA-dependent RNA polymerase confer virus resistance. Nature biotechnology\| PubMed ID: 15195103	2004
Prevalence and molecular characterization of human and bovine Cryptosporidium isolates in Thailand. Parasitology research\| PubMed ID: 18709387	2008
Analysis of an autoproteolytic activity of rice yellow mottle virus silencing suppressor P1. Biological chemistry\| PubMed ID: 20030588	2010
First description of Cryptosporidium bovis in Japan and diagnosis and genotyping of Cryptosporidium spp. in diarrheic pre-weaned calves in Hokkaido. Veterinary parasitology\| PubMed ID: 20149546	2010
Expression, purification and functional characterization of recombinant Zucchini yellow mosaic virus HC-Pro. Protein expression and purification\| PubMed ID: 20674747	2011
The helper component-proteinase of the Zucchini yellow mosaic virus inhibits the Hua Enhancer 1 methyltransferase activity in vitro. The Journal of general virology\| PubMed ID: 21593273	2011
Diverse spontaneous silencing of a transgene among two Nicotiana species. Planta\| PubMed ID: 21617990	2011
Analysis of the autoproteolytic activity of the recombinant helper component proteinase from zucchini yellow mosaic virus. Biological chemistry\| PubMed ID: 21871010	2011

Kajohn Boonrod

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