protease-acid-catalyzed-labeling-workflows-employing-18o-enriched

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing <sup>18</sup>O-enriched Water

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions.

Zymogram mit Remazol brilliant blau-markierten Micrococcus Lysodeikticus Zellen f&uuml;r den Nachweis von Lysozymes: Beispiel f&uuml;r eine neue Lysozym-Aktivit&auml;t in formosische Termiten Verteidigung Absonderungen.

A fluorescent binding assay was developed to investigate the effects of mutagenesis on the binding affinity and substrate specificity of the chitin-binding domain of chitinase A1 from Bacillus circulans WL-12. The chitin-binding domain was genetically fused to the N-terminus of a green fluorescent protein, and the polyhistidine-tagged hybrid protein was expressed in Escherichia coli. Residues likely to be involved in the binding site were mutated and their contributions to binding and substrate specificity were evaluated by affinity electrophoresis and depletion assays. The experimental binding isotherms were analyzed by non-linear regression using a modified Langmuir equation. Non-conservative substitution of tryptophan residue (W687) nearly abolished chitin-binding affinity and dramatically lowered chitosan binding while retaining the original level of curdlan binding. Double mutation E668K/P689A had altered specificity for several substrates and also impaired chitin binding significantly. Other substitutions in the binding site altered substrate specificity but had little effect on overall affinity for chitin. Interestingly, mutation T682A led to a higher specificity towards chitinous substrates than the wildtype. Furthermore, the ChBD-GFP hybrid protein was tested for use in diagnostic staining of cell walls of fungi and yeast and for the detection of fungal infections in tissue samples.

Mutation of active site residues in the chitin-binding domain ChBDChiA1 from chitinase A1 of Bacillus circulans alters substrate specificity: use of a green fluorescent protein binding assay.

Eine fluoreszierende Bindung-Assay wurde entwickelt, um die Auswirkungen der Mutagenese auf die verbindliche Affinit&auml;t und Substrat Spezifit&auml;t der Chitin-Bindung-Dom&auml;ne des Chitinase A1 aus Bacillus Circulans WL-12 zu untersuchen. Die Chitin-bindende Dom&auml;ne wurde genetisch zu den N-Terminus des gr&uuml;n fluoreszierenden Proteins verschmolzen, und das Polyhistidine-Tags Hybrid-Protein fand ihren Niederschlag in Escherichia coli. R&uuml;ckst&auml;nde, die in die Bindungsstelle einbezogen wurden mutiert und ihren Beitrag zur Bindung und Substrat Spezifit&auml;t von Affinit&auml;t Elektrophorese und Ersch&ouml;pfung ausgewertet wurden Proben. Die experimentelle Bindung Isothermen wurden durch nicht-lineare Regression mit eine modifizierte Langmuir Gleichung analysiert. Nicht-konservative Substitution von Tryptophan R&uuml;ckst&auml;nde (W687) abgeschafft fast Chitin-Bindungsaffinit&auml;t und drastisch gesenkten Chitosan unter Beibehaltung der urspr&uuml;nglichen Ebene Curdlan Bindung Binden. Doppelte Mutation E668K/P689A hatte ver&auml;ndert Spezifit&auml;t f&uuml;r verschiedene Untergr&uuml;nde und auch Chitin binden erheblich beeintr&auml;chtigt. Weiteren Substitutionen in die Bindungsstelle ver&auml;ndert Substratspezifit&auml;t aber hatte kaum Auswirkungen auf die gesamte Affinit&auml;t f&uuml;r Chitin. Interessanterweise f&uuml;hrte Mutation T682A eine h&ouml;here Spezifit&auml;t gegen&uuml;ber Chitinpanzer Substrate als der Wildtyp. Dar&uuml;ber hinaus wurde das ChBD-GFP-Hybrid-Protein f&uuml;r diagnostische Anf&auml;rben der Zellw&auml;nde der Pilze und Hefe und zum Nachweis von Pilzinfektionen im Gewebe-Proben getestet.

Mutation der aktiven Site R&uuml;ckst&auml;nde in der Chitin-bindende Dom&auml;ne ChBDChiA1 aus Chitinase A1 von Bacillus Circulans &auml;ndert Substratspezifit&auml;t: Verwenden Sie ein gr&uuml;n fluoreszierendes Protein-Bindung-Assay.

Saliva plays many biological roles, from lubrication and digestion to regulating bacterial and leukocyte adhesion. To understand the functions of individual components and families of molecules, it is important to identify as many salivary proteins as possible. Toward this goal, we used a proteomic approach as the first step in a global analysis of this important body fluid. We collected parotid saliva as the ductal secretion from three human donors and separated the protein components by two-dimensional SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (2D SDS-PAGE). Proteins in gel spots were identified by peptide mass fingerprinting, and the results were confirmed by tandem mass spectrometry of selected peptides. Complementing this approach we used ultrafiltration to prepare a low-molecular-weight fraction of parotid saliva, which was analyzed directly or after reversed phase high-performance liquid chromatography separation by using mass spectrometric approaches. MS analyses of 2D SDS-PAGE spots revealed known components of saliva, including cystatins, histatins, lysozyme, and isoforms and/or fragments of alpha-amylase, albumin, and proline-rich proteins. We also discovered novel proteins, such as several isoforms of Zn-alpha-2-glycoprotein and secretory actin-binding protein. MS analyses of the ultrafiltrate showed that the low-molecular-weight fraction of parotid saliva was peptide-rich, with novel fragments of proline-rich proteins and histatins in abundance. Experiments using Candida albicans as the test organism showed that at least one of the novel peptides had antifungal activity. Our results show that saliva is a rich source of proteins and peptides that are potential diagnostic and therapeutic targets.

Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry.

Gegen die Definition des menschlichen Proteoms Ohrspeicheldr&#xFC;se Speicheldr&#xFC;se und Peptidoms: Identifizierung und Charakterisierung mittels 2D-SDS-PAGE, Ultrafiltration, HPLC und Massenspektrometrie.

Beurteilung der Auswirkungen der Tagesgang &#xFC;ber die Zusammensetzung des menschlichen Parotisspeichel: quantitative Analyse von nativen Peptiden mit iTRAQ Reagenzien.

Changes in salivary composition correlate with disease susceptibility, disease state, or both. However, use of saliva for diagnostic purposes is complicated by the gland-specific effects of circadian rhythm or diurnal variation. We recently characterized a suite of peptides in the < or =10-kDa fraction of human parotid saliva that included many novel species. In this study, we used novel iTRAQ labeling chemistry to investigate possible diurnal effects on peptide generation. We collected samples produced by gustatory stimulation as the ductal secretions at four time points under conditions that minimized proteolysis, pooled them according to collection time, and isolated the LMW fractions. Samples collected at each collection time were derivatized with a different isobaric iTRAQ reagent. The labeled samples were combined, separated by reversed-phase HPLC, co-spotted with matrix on MALDI targets, and analyzed by MALDI TOF/TOF mass spectrometry. With this approach, we achieved relative quantification of the parotid peptides at four time points. In several cases, abundance during the day changed dramatically. iTRAQ tagging improved the efficiency of MS/MS fragmentation, which in turn allowed the identification of several novel peptides. Our results demonstrated both the utility of this method and the importance of diurnal effects on the composition of the human parotid saliva peptidome.

Assessing the effects of diurnal variation on the composition of human parotid saliva: quantitative analysis of native peptides using iTRAQ reagents.

Endogenous proteinases in biological fluids such as human saliva produce a rich peptide repertoire that reflects a unique combination of enzymes, substrates, and inhibitors/activators. Accordingly, this subproteome is an interesting source of biomarkers for disease processes that either directly or indirectly involve proteolysis. However, the relevant proteinases, typically very low abundance molecules, are difficult to classify and identify. We hypothesized that a sensitive technique for monitoring accumulated peptide products in an unbiased, global manner would be very useful for detecting and profiling proteolytic activities in complex biological samples. Building on the longstanding use of 18O isotope-based approaches for the classification of proteolytic and other enzymatic processes we devised a new method for evaluating endogenous proteinases. Specifically, we showed that upon ex vivo incubation endogenous proteinases in human parotid saliva introduced 18O from isotopically enriched water into the C-terminal carboxylic groups of their peptide products. Subsequent peptide sequence determination and inhibitor profiling enabled the detection of discrete subsets of proteolytic products that were generated by different enzymes. As a proof-of-principle we used one of these fingerprints to identify the relevant activity as tissue kallikrein. We termed this technique PALeO. Our results suggest that PALeO is a rapid and highly sensitive method for globally assessing proteinase activities in complex biological samples.

A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples.

Endogene Proteinasen in biologischen Fl&uuml;ssigkeiten, wie menschliche Speichel produzieren ein Reich Peptid-Repertoire, das eine einzigartige Kombination der Enzyme, Substrate und Inhibitoren/Aktivatoren widerspiegelt. Dementsprechend ist diese Subproteome eine interessante Quelle f&uuml;r Biomarker f&uuml;r Krankheitsprozesse, die direkt oder indirekt Proteolyse betreffen. Allerdings sind die relevanten Proteinasen, in der Regel sehr niedrig F&uuml;lle Molek&uuml;le, schwer zu klassifizieren und zu identifizieren. Wir die Hypothese, dass eine sensible Technik zur &Uuml;berwachung von angesammelten Peptid Produkte unvoreingenommene global kosteng&Atilde;&frac14;nstig sehr n&uuml;tzlich w&auml;re f&uuml;r die Erkennung und Profilerstellung proteolytische Aktivit&auml;ten in komplexen biologischen Proben. Aufbauend auf die langj&auml;hrige Verwendung von 18O Isotop-basierte Ans&auml;tze f&uuml;r die Einstufung von proteolytischen und andere enzymatische Prozesse, die wir entwickelt eine neue Methode zur Bewertung von endogener Proteinasen. Insbesondere haben wir gezeigt, dass bei ex Vivo Inkubation endogene Proteinasen im menschlichen Ohrspeicheldr&uuml;senlymphknoten Speichel 18O aus isotopischer angereichertes Wasser in der C-terminalen carboxylic Gruppen ihrer Peptid-Produkte eingef&uuml;hrt. Nachfolgende Peptid Sequenz Entschlossenheit und Inhibitor Profilerstellung aktiviert die Erkennung von diskrete Teilmengen der proteolytische Produkte, die durch verschiedene Enzyme generiert wurden. Als Beweis-des-Prinzip haben wir eines dieser Fingerabdr&uuml;cke identifizieren die relevante T&auml;tigkeit als Gewebe Kallikrein. Wir bezeichnet diese Technik PALeO. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass PALeO eine schnelle und hochempfindlichen Methode zur Bewertung von Global Proteinase Aktivit&auml;ten in komplexen biologischen Proben ist.

Eine Massen-Spektrometrie-basierte Strategie f&uuml;r die Erkennung und Charakterisierung von endogenen Proteinase Aktivit&auml;ten in komplexen biologischen Proben.

Saliva is a body fluid with important functions in oral and general health. A consortium of three research groups catalogued the proteins in human saliva collected as the ductal secretions: 1166 identifications--914 in parotid and 917 in submandibular/sublingual saliva--were made. The results showed that a high proportion of proteins that are found in plasma and/or tears are also present in saliva along with unique components. The proteins identified are involved in numerous molecular processes ranging from structural functions to enzymatic/catalytic activities. As expected, the majority mapped to the extracellular and secretory compartments. An immunoblot approach was used to validate the presence in saliva of a subset of the proteins identified by mass spectrometric approaches. These experiments focused on novel constituents and proteins for which the peptide evidence was relatively weak. Ultimately, information derived from the work reported here and related published studies can be used to translate blood-based clinical laboratory tests into a format that utilizes saliva. Additionally, a catalogue of the salivary proteome of healthy individuals allows future analyses of salivary samples from individuals with oral and systemic diseases, with the goal of identifying biomarkers with diagnostic and/or prognostic value for these conditions; another possibility is the discovery of therapeutic targets.

The proteomes of human parotid and submandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions.

Speichel ist eine K&ouml;rperfl&uuml;ssigkeit mit wichtigen Funktionen im Mund-, Kiefer- und allgemeine Gesundheit. Ein Konsortium aus drei Forschergruppen katalogisiert die Proteine im menschlichen Speichel als die Tr&auml;nendr&uuml;se Sekrete gesammelt: 1166-Identifikationen--914 in Ohrspeicheldr&uuml;se und 917 in submandibular/Sublingual Speichel--wurden gemacht. Die Ergebnisse zeigten, dass ein hoher Anteil von Proteinen, die in Plasma und/oder Tr&auml;nen gefunden werden auch im Speichel zusammen mit einzigartigen Komponenten vorhanden. Die Proteine identifiziert sind zahlreiche Molekulare Prozesse von strukturellen Funktionen bis hin zu enzymatische katalytische Aktivit&auml;ten beteiligt. Wie zu erwarten, die meisten, die extrazellul&auml;re und sekretorischen F&auml;cher zugeordnet. Ein Immunoblot-Ansatz wurde verwendet, um die Pr&auml;senz im Speichel einer Teilmenge der Proteine identifiziert durch massenspektrometrische Ans&auml;tze zu &uuml;berpr&uuml;fen. Diese Experimente konzentrierten sich auf neuartige Mitgliedsgruppen und Proteine, die die Peptid-Beweise f&uuml;r die relativ schwach war. Letztlich Informationen aus der Arbeit berichtet hier und verwandte ver&ouml;ffentlichte Studien einsetzbar, Blut-basierten klinischen Labortests in ein Format zu &uuml;bersetzen, der Speichel verwendet. Dar&uuml;ber hinaus erm&ouml;glicht ein Katalog des Speichel-Proteome von gesunden Personen zuk&uuml;nftige Analysen der Speicheldr&uuml;sen Proben von Personen, die mit oralen und systemische Erkrankungen, mit dem Ziel der Identifizierung von Biomarkern mit diagnostischer bzw. prognostischer Wert f&uuml;r diese Bedingungen; eine andere M&ouml;glichkeit ist die Entdeckung der therapeutischen Ziele.

Die Proteome von menschlichen Ohrspeicheldr&uuml;se und submandibular/Sublingual Dr&uuml;se Salivas als die Tr&auml;nendr&uuml;se Sekrete gesammelt.

In enzymatic (18)O-labeling strategies for quantitative proteomics, the exchange of carboxyl oxygens at low pH is a common, undesired side reaction. We asked if acid-catalyzed back exchange could interfere with quantitation and whether the reaction itself could be used as method for introducing (18)O label into peptides. Several synthetic peptides were dissolved in dilute acid containing 50% (v/v) H(2)(18)O and incubated at room temperature. Aliquots were removed over a period of 3 weeks and analyzed by tandem mass spectrometry (MS/MS). (18)O-incorporation ratios were determined by linear regression analysis that allowed for multiple stable-isotope incorporations. At low pH, peptides exchanged their carboxyl oxygen atoms with the aqueous solvent. The isotope patterns gradually shifted to higher masses until they reached the expected binomial distribution at equilibrium after approximately 11 days. Reaction rates were residue- and sequence-specific. Due to its slow nature, the acid-catalyzed back exchange is expected to minimally interfere with enzymatic (18)O-labeling studies provided that storage and analysis conditions minimize low-pH exposure times. On its own, acid-catalyzed (18)O labeling is a general tagging strategy that is an alternative to the chemical, metabolic, and enzymatic isotope-labeling schemes currently used in quantitative proteomics.

Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides.

Enzymatische (18) O-Kennzeichnung Strategien f&uuml;r quantitative Proteomik ist der Austausch von Karboxyl-Sauerstoffatome bei niedrigem pH-Wert eine h&auml;ufige, unerw&uuml;nschte Seite-Reaktion. Wir fragten, ob S&auml;ure-katalysierte zur&uuml;ck Austausch k&ouml;nnte st&ouml;ren, Quantisierung und ob die Reaktion selbst als Methode f&uuml;r die Einf&uuml;hrung von (18) O-Etikett in Peptide verwendet werden k&ouml;nnten. Mehrere synthetische Peptide wurden in verd&uuml;nnter S&auml;ure mit 50 % (V/V) H(2) (18) O gel&ouml;st und bei Raumtemperatur inkubiert. Aliquoten wurden &uuml;ber einen Zeitraum von 3 Wochen entfernt und von Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) analysiert. (18)O-Gesellschaftsgr&uuml;ndung Verh&auml;ltnisse wurden durch lineare Regressionsanalyse bestimmt, die f&uuml;r mehrere testing-Isotop-Gr&uuml;ndungen zul&auml;ssig. Bei einem niedrigen pH-Wert ausgetauscht Peptide ihre Karboxyl-Sauerstoffatome mit w&auml;ssrigen L&ouml;sungsmittels. Die Isotop-Muster verlagerte sich allm&auml;hlich auf h&ouml;here Massen bis zum Erreichen der erwarteten Binomialverteilung bei Gleichgewicht nach etwa 11 Tagen. Reaktion waren in R&uuml;ckstand und Sequenz-spezifische. Wegen seiner langsamen Natur soll der S&auml;ure-katalysierte zur&uuml;ck Austausch enzymatische (18) O-beschriften Studien minimal zu st&ouml;ren, sofern die Lagerungs-und Analyse niedrig-pH Belichtungszeiten minimieren. Allein verwendet in quantitative Proteomik S&auml;ure-katalysierte (18) O labeling ist eine allgemeine Kennzeichnung Strategie, die eine Alternative zu chemischen, metabolische, und enzymatische Isotop-Kennzeichnung der derzeit Systeme.

S&auml;ure-katalysierte Sauerstoff-18 Kennzeichnung von Peptiden.

The Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3 degrade host hemoglobin to provide free amino acids for parasite protein synthesis. Hemoglobin hydrolysis has been described as an ordered process initiated by aspartic proteases, but cysteine protease inhibitors completely block the process, suggesting that cysteine proteases can also initiate hemoglobin hydrolysis. To characterize the specific roles of falcipains, we used three approaches. First, using random P(1) - P(4) amino acid substrate libraries, falcipain-2 and falcipain-3 demonstrated strong preference for cleavage sites with Leu at the P(2) position. Second, with overlapping peptides spanning alpha and beta globin and proteolysis-dependent (18)O labeling, hydrolysis was seen at many cleavage sites. Third, with intact hemoglobin, numerous cleavage products were identified. Our results suggest that hemoglobin hydrolysis by malaria parasites is not a highly ordered process, but rather proceeds with rapid cleavage by falcipains at multiple sites. However, falcipain-2 and falcipain-3 show strong specificity for P(2) Leu in small peptide substrates, in agreement with the specificity in optimized small molecule inhibitors that was identified previously. These results are consistent with a principal role of falcipain-2 and falcipain-3 in the hydrolysis of hemoglobin by P. falciparum and with the possibility of developing small molecule inhibitors with optimized specificity as antimalarial agents.

Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3.

Die Plasmodium Falciparum-Cystein-Proteasen Falcipain-2 und Falcipain-3 verschlechtern Host H&auml;moglobin um Freie Aminos&auml;uren f&uuml;r Parasit Proteinsynthese bereitzustellen. Hydrolyse H&auml;moglobin ist als ein geordneter Prozess initiierten Aspartic Proteasen beschrieben worden, aber Cystein-Protease-Inhibitoren vollst&auml;ndig blockieren den Prozess, die darauf hindeutet, dass Cystein-Proteasen auch H&auml;moglobin Hydrolyse initiieren k&ouml;nnen. Um die spezifischen Rollen von Falcipains zu charakterisieren, haben wir drei Ans&auml;tze verwendet. Zuerst verwenden zuf&auml;llige P(1) - P(4) Aminos&auml;ure Substrat Bibliotheken, Falcipain-2 und Falcipain-3 starke Vorliebe f&uuml;r Spaltung Websites mit Leu an der P(2)-Position gezeigt. Zweitens spanning mit &uuml;berlappenden Peptide Alpha- und Beta-Globin und Proteolyse-abh&auml;ngige (18) O beschriften, Hydrolyse an vielen Standorten der Spaltung gesehen wurde. Drittens wurden mit intakten H&auml;moglobin, zahlreiche Zerfallsprodukte identifiziert. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass H&auml;moglobin Hydrolyse von Malaria-Parasiten ist kein h&ouml;chst geordneten Prozess, sondern vielmehr f&auml;hrt mit schnellen Spaltung von Falcipains an mehreren Standorten. Allerdings zeigen Falcipain-2 und Falcipain-3 starke Spezifit&auml;t f&uuml;r P(2) Leu in kleinen Peptid-Substrate, im Einvernehmen mit der Besonderheit im optimierten niedermolekularer Hemmer, die zuvor identifiziert wurde. Diese Ergebnisse sind konsistent mit einer Hauptrolle Falcipain-2 und Falcipain-3 bei der Hydrolyse von H&auml;moglobin durch p. Falciparum und mit der M&ouml;glichkeit der Entwicklung niedermolekularer Hemmer mit optimierten Spezifit&auml;t gegen Malaria Agenturt&auml;tigkeit.

H&auml;moglobin Spaltung Site-specificity von der Plasmodium Falciparum-Cystein-Proteasen Falcipain-2 und Falcipain-3.

Neuropeptide signaling at the cell surface is regulated by metalloendopeptidases, which degrade peptides in the extracellular fluid, and beta-arrestins, which interact with G protein-coupled receptors (GPCRs) to mediate desensitization. beta-Arrestins also recruit GPCRs and mitogen-activated protein kinases to endosomes to allow internalized receptors to continue signaling, but the mechanisms regulating endosomal signaling are unknown. We report that endothelin-converting enzyme-1 (ECE-1) degrades substance P (SP) in early endosomes of epithelial cells and neurons to destabilize the endosomal mitogen-activated protein kinase signalosome and terminate signaling. ECE-1 inhibition caused endosomal retention of the SP neurokinin 1 receptor, beta-arrestins, and Src, resulting in markedly sustained ERK2 activation in the cytosol and nucleus, whereas ECE-1 overexpression attenuated ERK2 activation. ECE-1 inhibition also enhanced SP-induced expression and phosphorylation of the nuclear death receptor Nur77, resulting in cell death. Thus, endosomal ECE-1 attenuates ERK2-mediated SP signaling in the nucleus to prevent cell death. We propose that agonist availability in endosomes, here regulated by ECE-1, controls beta-arrestin-dependent signaling of endocytosed GPCRs.

Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling.

Neuropeptid Signalisierung an der Zelloberfl&auml;che wird durch Metalloendopeptidases, die Peptide in der extrazellul&auml;ren Fl&uuml;ssigkeit zu beeintr&auml;chtigen, und Beta-Arrestins, die mit G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) Desensibilisierung zu vermitteln. Beta-Arrestins auch zu rekrutieren, GPCRs und Mitogen-aktivierte Proteinkinasen in Endosomen verinnerlichte Rezeptoren erm&ouml;glichen, um den Vorgang fortzusetzen, Signalisierung, aber die Regulierungsmechanismen Endosomen Signalisierung sind unbekannt. Wir berichten, dass Endothelin-konvertierende Enzym-1 (ECE-1) Substanz P (SP) beeintr&auml;chtigt in fr&uuml;hen Endosomen Epithelzellen und Neuronen zu destabilisieren die Endosomen Mitogen-aktivierte Protein-Kinase-Signalosome und Signalisierung zu beenden. ECE-1-Hemmung verursacht Endosomen Eigentumsvorbehalt der SP Neurokinin-1-Rezeptor, Beta-Arrestins und Src, wodurch deutlich nachhaltiger ERK2-Aktivierung im Zytosol und Kern, w&auml;hrend die ECE-1 eine &Uuml;berexpression ERK2 Aktivierung abgeschw&auml;cht. ECE-1-Hemmung verbesserte auch SP-induzierte Expression und Phosphorylierung des nuklearen Tod Rezeptors Nur77, die Zellentod. So d&auml;mpft Endosomen ECE-1, ERK2-vermittelte SP signalisieren in den Zellkern Zelltod zu verhindern. Wir schlagen Agonist Verf&uuml;gbarkeit in Endosomen, hier von ECE-1, reguliert steuert Beta-arrestin-abh&auml;ngigen Signalisierung der Endocytosed GPCRs.

Endosomen Endothelin-konvertierende Enzym-1: ein Regulator der Beta-arrestin-abh&auml;ngigen ERK signalisieren.

Proteases play prominent roles in many physiological processes and the pathogenesis of various diseases, which makes them interesting drug targets. To fully understand the functional role of proteases in these processes, it is necessary to characterize the target specificity of the enzymes, identify endogenous substrates and cleavage products as well as protease activators and inhibitors. The complexity of these proteolytic networks presents a considerable analytic challenge. To comprehensively characterize these systems, quantitative methods that capture the spatial and temporal distributions of the network members are needed. Recently, activity-based workflows have come to the forefront to tackle the dynamic aspects of proteolytic processing networks in vitro, ex vivo and in vivo. In this review, we will discuss how mass spectrometry-based approaches can be used to gain new insights into protease biology by determining substrate specificities, profiling the activity-states of proteases, monitoring proteolysis in vivo, measuring reaction kinetics and defining in vitro and in vivo proteolytic events. In addition, examples of future aspects of protease research that go beyond mass spectrometry-based applications are given.

Profiling protease activities by dynamic proteomics workflows.

Proteasen spielen prominente Rollen in vielen physiologischen Prozessen und die Pathogenese von verschiedenen Krankheiten, die Ihnen interessante Droge-Ziele macht. Um die funktionale Rolle der Proteasen in diese Prozesse vollst&auml;ndig zu verstehen, ist es notwendig, die Ziel-Spezifit&auml;t der Enzyme zu charakterisieren, endogene Substrate und Zerfallsprodukte sowie Protease-Aktivatoren und Inhibitoren zu identifizieren. Die Komplexit&auml;t dieser proteolytische Netze stellt eine erhebliche analytische Herausforderung. Quantitative Methoden, die die r&auml;umlichen und zeitlichen Verteilungen der Netzwerk-Mitglieder zu erfassen sind erforderlich, um diese Systeme umfassend zu charakterisieren. Aktivit&auml;t-basierten Workflows sind vor kurzem in den Vordergrund, die dynamischen Aspekte der proteolytische Verarbeitung Netze in-vitro, ex Vivo und in-vivo anzugehen gekommen. In diesem Bericht werden wir diskutieren, wie Masse Spektrometrie-basierte Ans&auml;tze verwendet werden k&ouml;nnen, neue Einblicke in Protease Biologie zu erlangen, indem Bestimmung Substrat Besonderheiten, Profilerstellung die Aktivit&auml;t-Staaten von Proteasen, &Uuml;berwachung Proteolyse in Vivo, Messung der Reaktionskinetik und in-vitro und in vivo proteolytische Ereignisse definieren. Dar&uuml;ber hinaus erhalten die Beispiele f&uuml;r zuk&uuml;nftige Aspekte der Protease-Forschung, die Massen-Spektrometrie-basierten Anwendungen hinausgehen.

Profilerstellung Protease-Aktivit&auml;ten von dynamischen Proteomics-Workflows.

We present a strategy to survey proteolytic processes that occur in human cancer microenvironments.

Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry.

Wir pr&auml;sentieren Ihnen eine Strategie zur proteolytische Prozesse-Umfrage, die im menschlichen Krebs Mikroumgebungen auftreten.

Vermessung proteolytische Prozesse im menschlichen Krebs Mikroumgebungen Microdialysis und t&auml;tigkeitsbezogene Massenspektrometrie.

Targeting proteases in cardiovascular diseases by mass spectrometry-based proteomics.

Spektrometrie-basierten Massen-Proteomics Targeting Proteasen bei Herz-Kreislauf-Krankheiten.

Current methods of generating rat induced pluripotent stem cells are based on viral transduction of pluripotency inducing genes (Oct4, Sox2, c-myc and Klf4) into somatic cells. These activate endogenous pluripotency genes and reprogram the identity of the cell to an undifferentiated state. Epigenetic silencing of exogenous genes has to occur to allow normal iPS cell differentiation. To gain more control over the expression of exogenous reprogramming factors, we used a novel doxycycline-inducible plasmid vector encoding Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4. To ensure efficient and controlled generation of iPS cells by plasmid transfection we equipped the reprogramming vector with a bacteriophage Ï†C31 attB site and used a Ï†C31 integrase expression vector to enhance vector integration. A series of doxycycline-independent rat iPS cell lines were established. These were characterized by immunocytochemical detection of Oct4, SSEA1 and SSEA4, alkaline phosphatase staining, methylation analysis of the endogenous Oct4 promoter and RT-PCR analysis of endogenous rat pluripotency genes. We also determined the number of vector integrations and the extent to which reprogramming factor gene expression was controlled. Protocols were developed to generate embryoid bodies and rat iPS cells demonstrated as pluripotent by generating derivatives of all three embryonic germ layers in vitro, and teratoma formation in vivo. All data suggest that our rat iPS cells, generated by plasmid based reprogramming, are similar to rat ES cells. Methods of DNA transfection, protein transduction and feeder-free monolayer culture of rat iPS cells were established to enable future applications.

Efficient generation of rat induced pluripotent stem cells using a non-viral inducible vector.

Aktuelle Methoden der Generierung von Ratte induzierte pluripotente Stammzellen basieren auf virale Transduktion von Pluripotenz induzierende Gene (Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4) in somatischen Zellen. Diese endogene Pluripotenz Gene zu aktivieren und die Identit&auml;t der Zelle zu einem undifferenzierten Zustand neu zu programmieren. Epigenetische silencing exogenen Gene muss auftreten, um normale iPS Zelldifferenzierung zu erm&ouml;glichen. Um mehr Kontrolle &uuml;ber den Ausdruck der exogenen Neuprogrammierung Faktoren erhalten, haben wir eine neuartige Doxycyclin-inducible Plasmid Vektor Codierung Oct4, Sox2, c-Myc und Klf4 verwendet. Effiziente und kontrollierte Erzeugung von iPS-Zellen durch Plasmid Transfektion zu gew&auml;hrleisten wir ausgestattet den Neuprogrammierung Vektor mit einer Bakteriophage &phi;C31 AttB Website und einen &phi;C31 Integrase Ausdruck Vektor zur Verbesserung der Vektor-Integration verwendet. Eine Reihe von Doxycyclin-unabh&auml;ngige Ratte iPS Zelllinien wurden gegr&uuml;ndet. Diese zeichneten sich durch den Nachweis des Prozesses Immunocytochemical Oct4, SSEA1 und SSEA4, alkalische Phosphatase, F&auml;rbung, Methylierung der endogenen Oct4-Projekttr&auml;ger und RT-PCR-Analyse der endogenen Ratte Pluripotenz Gene. Wir bestimmt auch die Anzahl der Vektor-Integrationen und der Umfang an dem Neuprogrammierung Faktor-Genexpression kontrolliert wurde. Protokolle wurden entwickelt, um Embryoid K&ouml;rper und Ratte-iPS-Zellen, die durch die Generierung von Derivaten aller drei embryonalen Keim Schichten in Vitro und in-vivo Teratom Bildung als Pluripotent gezeigt zu generieren. Alle Daten zeigen, dass unsere Ratte iPS-Zellen, generiert von Plasmid basierte Neuprogrammierung, Ratte ES Zellen &auml;hnlich sind. Methoden der DNA Transfektion, Protein Signaltransduktion und Zubringer-freie Monolayer Kultur der Ratte iPS-Zellen wurden gegr&uuml;ndet, um zuk&uuml;nftige Anwendungen zu erm&ouml;glichen.

Article	Year
Zymogram with Remazol brilliant blue-labeled Micrococcus lysodeikticus cells for the detection of lysozymes: example of a new lysozyme activity in Formosan termite defense secretions. Analytical biochemistry\| PubMed ID: 12479837	2003
Mutation of active site residues in the chitin-binding domain ChBDChiA1 from chitinase A1 of Bacillus circulans alters substrate specificity: use of a green fluorescent protein binding assay... Archives of biochemistry and biophysics\| PubMed ID: 15158679	2004
Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry\| PubMed ID: 15723531	2005
Assessing the effects of diurnal variation on the composition of human parotid saliva: quantitative analysis of native peptides using iTRAQ reagents. Analytical chemistry\| PubMed ID: 16053308	2005
A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics\| PubMed ID: 18186022	2008
The proteomes of human parotid and submandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. Journal of proteome research\| PubMed ID: 18361515	2008
Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical chemistry\| PubMed ID: 19243188	2009
Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PloS one\| PubMed ID: 19357776	2009
Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 19531493	2009
Profiling protease activities by dynamic proteomics workflows. Proteomics\| PubMed ID: 22246865	2012
Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics. Clinical applications\| PubMed ID: 22262628	2011
Targeting proteases in cardiovascular diseases by mass spectrometry-based proteomics. Circulation. Cardiovascular genetics\| PubMed ID: 22511707	2012
Efficient generation of rat induced pluripotent stem cells using a non-viral inducible vector. PloS one\| PubMed ID: 23383095	2013

Markus Hardt

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