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Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

The present study was designed to analyse whether continuous overexpression of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in the striatum by a recombinant lentiviral vector can provide improved cell survival and additional long-term functional benefits after transplantation of fetal ventral mesencephalic cells in Parkinsonian rats. A four-site intrastriatal 6-hydroxydopamine lesion resulted in an 80-90% depletion of nigral dopamine cells and striatal fiber innervation, leading to stable motor impairments. Histological analysis performed at 4 weeks after grafting into the GDNF-overexpressing striatum revealed a twofold increase in the number of surviving tyrosine hydroxylase (TH)-positive cells, as compared with grafts placed in control (green fluorescent protein-overexpressing) animals. However, in animals that were allowed to survive for 6 months, the numbers of surviving TH-positive cells in the grafts were equal in both groups, suggesting that the cells initially protected at 4 weeks failed to survive despite the continued presence of GDNF. Although cell survival was similar in both grafted groups, the TH-positive fiber innervation density was lower in the GDNF-treated grafted animals (30% of normal) compared with animals with control grafts (55% of normal). The vesicular monoamine transporter-2-positive fiber density in the striatum, by contrast, was equal in both groups, suggesting that long-term GDNF overexpression induced a selective down-regulation of TH in the grafted dopamine neurons. Behavioral analysis in the long-term grafted animals showed that the control grafted animals improved their performance in spontaneous motor behaviors to approximately 50% of normal, whereas the GDNF treatment did not provide any additional recovery.

Dissociation between short-term increased graft survival and long-term functional improvements in Parkinsonian rats overexpressing glial cell line-derived neurotrophic factor.

Die vorliegende Studie soll analysieren, ob die kontinuierliche eine &Uuml;berexpression von Gliazelle Linie-derived Neurotrophic Factor (GDNF) im Striatum durch einen rekombinanten Lentiviralen Vektor nach der Transplantation von fetalen ventralen Aquaeductus Zellen bei Parkinson Ratten Verbesserte Zelle &uuml;berleben und zus&auml;tzliche langfristige funktionelle Vorteile bieten kann. Eine vier-Website-Intrastriatal-6-Hydroxydopamine-L&auml;sion f&uuml;hrte eine 80-90 % Ersch&ouml;pfung Nigral Dopamin-Zellen und Striatale Faser Innervation, zu stabilen motorischen Beeintr&auml;chtigungen f&uuml;hrt. Histologische Analyse durchgef&uuml;hrt, 4 Wochen nach Pfropfen in der GDNF-&uuml;berexprimierenden Striatum eine Verdoppelung der Zahl offenbart der &Uuml;berlebenden Tyrosin-Hydroxylase (TH)-positive Zellen im Vergleich zu Transplantate in Kontrolltieren (gr&uuml;n fluoreszierendes Protein-&uuml;berexprimierenden) platziert. Jedoch bei Tieren, die f&uuml;r 6 Monate &uuml;berleben durften, die Zahl der &Uuml;berlebenden TH-positiven Zellen in die Grafts wurden in beiden Gruppen, was darauf hindeutet, dass die Zellen zun&auml;chst auf 4 Wochen gesch&uuml;tzt gegen trotz die weitere Pr&auml;senz der GDNF &uuml;berleben gleich. Zelle &Uuml;berleben in beiden Aufgepfropfte Gruppen &auml;hnlich war, war die TH-Positive Faser Innervation Dichte niedriger in den veredelt GDNF-behandelten Tieren (30 % der normalen) verglichen mit Tieren mit Steuerelement-Prothesen (55 % des normalen). Die Dichte die vesikul&auml;ren Monoamin-Transporter-2-positiven Faser in Striatum, war dagegen gleich in beiden Gruppen, was darauf hindeutet, dass dieser langfristigen GDNF eine &Uuml;berexpression induziert eine selektive Herunterregulation TH in die Aufgepfropfte Dopamin-Neuronen. Verhaltensanalyse in den langfristigen Aufgepfropfte Tieren zeigte, dass die Kontrolltiere veredelt ihre verbessert in spontane motorische Verhaltensweisen zu etwa 50 % der normalen, w&auml;hrend die GDNF Behandlung zus&auml;tzliche Entsch&auml;digungszahlung nicht bieten konnte.

Dissoziation zwischen kurzfristigen erh&ouml;ht Transplantat-&uuml;berleben und langfristige funktionelle Verbesserungen bei Parkinson Ratten &uuml;berexprimierenden Gliazelle Linie-derived Neurotrophic Factor.

Ligands of the glial cell line-derived neurotrophic factors (GDNF)-family are trophic factors for the development and survival of multiple cell types, however their effects on non-neuronal stem cells are unknown. We examined the action of neurturin on a candidate stem cell population isolated from adult skeletal muscles. When grown as spheres, these cells expressed mRNAs for GDNF, persephin, GFR-alpha2, GFR-alpha4 (neurturin receptor), and Ret. Exposure of these cells to neurturin significantly augmented cell numbers via increased cell proliferation. After addition of retinoic acid, the cells exited the cell cycle, developed thin processes, and became immunoreactive for betaIII-tubulin, while Ret mRNA expression decreased, without changes in the level of GFR-alpha2 mRNA. Neurturin induced an outgrowth of processes on these betaIII-tubulin positive cells. Neurturin may therefore be beneficial in the use of these multipotent cells isolated from adult muscles for autologous transplants in neurological applications.

Effect of neurturin on multipotent cells isolated from the adult skeletal muscle.

Liganden der Gliazelle Linie-derived Neurotrophic Faktoren (GDNF)-Familie sind trophische Faktoren f&uuml;r die Entwicklung und das &Uuml;berleben mehrerer Zelltypen, aber ihre Auswirkungen auf nicht-neuronale Stammzellen unbekannt sind. Wir untersuchten die Aktion des Neurturin auf ein Kandidat Stammzelle Bev&ouml;lkerung isoliert von Erwachsenen Skelettmuskeln. Wenn als Kugeln gewachsen, erg&auml;nzt diese Zellen ausgedr&uuml;ckt mRNAs f&uuml;r GDNF, Persephin, GFR-alpha2, GFR-alpha4 (Neurturin-Rezeptor) und i.r.-Gef&auml;hrdung dieser Zellen das Neurturin deutlich Zelle Zahlen &uuml;ber erh&ouml;hte Zellproliferation. Nach Zusatz von Vitamin a-S&auml;ure die Zellen verlassen den Zellzyklus, d&uuml;nne Prozesse entwickelt und wurde immunreaktivem f&uuml;r BetaIII-Tubulin, w&auml;hrend Ret mRNA Ausdruck, ohne &Auml;nderungen in der Ebene der GFR-alpha2-mRNA sank. Neurturin induziert ein Auswuchs der Prozesse auf diese BetaIII-Tubulin-positiven Zellen. Neurturin kann daher bei der Verwendung dieser multipotenten Zellen isoliert von Erwachsenen Muskeln f&uuml;r autologe Transplantationen in neurologische Anwendungen n&uuml;tzlich sein.

Wirkung der Neurturin auf multipotenten Zellen isoliert von den Erwachsenen Skelettmuskulatur.

The neurotransmitter GABA exerts a strong negative influence on the production of adult-born olfactory bulb interneurons via tightly regulated, non-synaptic GABAergic signaling. After discussing some findings on GABAergic signaling in the neurogenic subventricular zone (SVZ), we provide data suggesting ambient GABA clearance via two GABA transporter subtypes and further support for a non-vesicular mechanism of GABA release from neuroblasts. While GABA works in cooperation with the neurotransmitter glutamate during embryonic cortical development, the role of glutamate in adult forebrain neurogenesis remains obscure. Only one of the eight metabotropic glutamate receptors (mGluRs), mGluR5, has been reported to tonically increase the number of proliferative SVZ cells in vivo, suggesting a local source of glutamate in the SVZ. We show here that glutamate antibodies strongly label subventricular zone (SVZ) astrocytes, some of which are stem cells. We also show that some SVZ neuroblasts express one of the ionotropic glutamate receptors, AMPA/kainate receptors, earlier than previously thought. Collectively, these findings suggest that neuroblast-to-astrocyte GABAergic signaling may cooperate with astrocyte-to-neuroblast glutamatergic signaling to provide strong homeostatic control on the production of adult-born olfactory bulb interneurons.

GABA and glutamate signaling: homeostatic control of adult forebrain neurogenesis.

Neurotransmitters GABA &uuml;bt einen starken negativen Einfluss auf die Produktion von Riechkolben Erwachsener-US-amerikanischer Interneuronen &uuml;ber streng geregelte, nicht-synaptische GABAergic signalisieren. Nach der Diskussion einige Ergebnisse auf GABAergic signalisieren in der neurogenen subventrikul&auml;re Zone (SVZ), wir liefern Daten, die vorschlagen Umgebungstemperatur GABA-Abfertigung &uuml;ber zwei Untertypen der GABA-Transporter und weitere Unterst&uuml;tzung f&uuml;r einen nicht-vesikul&auml;ren Mechanismus der GABA-Freisetzung von Neuroblasten. GABA in Zusammenarbeit mit dem Neurotransmitter Glutamat w&auml;hrend der Embryonalentwicklung kortikale funktioniert, zwar bleibt die Rolle von Glutamat in Erwachsenen Stirnhirn Neurogenese obskuren. Nur einer von den acht Metabotropic Glutamat-Rezeptoren (mGluRs), mGluR5, wurde berichtet, tonisch, die Zahl der proliferative SVZ-Zellen in vivo eine lokale Quelle von Glutamat in der SVZ vorschlagen. Wir zeigen hier, dass Glutamat Antik&ouml;rper stark subventrikul&auml;re Zone (SVZ) Astrozyten, Beschriften von die einige sind Stammzellen. Wir zeigen auch, dass einige SVZ Neuroblasten eines der ionotrope Glutamatrezeptoren, AMPA/Kainate-Rezeptoren, fr&uuml;her Ausdr&uuml;cken als bisher angenommen. Diese Feststellungen zufolge gemeinsam Blast (Biologie)-zu-Gliazelle GABAergic Signalisierung mit Gliazelle, Blast (Biologie) Glutamat signalisiert starke hom&ouml;ostatischen Kontrolle auf die Produktion von Erwachsenen-US-amerikanischer Riechkolben Interneuronen zusammenarbeiten kann.

GABA und Glutamat zu signalisieren: hom&ouml;ostatischen Kontrolle der Erwachsenen Stirnhirn Neurogenese.

Schon vor der Integration in vorhandene Schaltung, Erwachsener geboren Neuronen schnelles Rezeptoren f&uuml;r Neurotransmitter, die interzellul&auml;ren Mechanismen und deren Auswirkung auf die Neurogenese bleiben jedoch weitgehend unerforscht. Hier zeigen wir, dass Neuroblasten, geboren in der postnatalen subventrikul&auml;re Zone (SVZ) w&auml;hrend ihrer Migration in den Riechkolben NMDA-Rezeptoren (NMDARs) erwerben. Entlang ihrer Route sind Neuroblasten Ensheathed durch Gliazelle-&auml;hnlichen Zellen vesikul&auml;ren Glutamat Freisetzung Maschinen zum Ausdruck zu bringen. Zunehmender Kalzium in diesen spezialisierten Astrozyten induziert NMDAR Aktivit&auml;t in Neuroblasten, und blockieren astrozytische vesikul&auml;ren Version beseitigt spontane NMDAR-Aktivit&auml;t. Einzeller-ko von NMDARs mit Neugeborenen Electroporation f&uuml;hrte Blast (Biologie) Apoptose bei NMDAR-Erwerb. Dies kumuliert in einem 40 % Verlust von Neuroblasten entlang ihrer Migrationsroute, demonstrieren, dass NMDAR-Erwerb f&uuml;r Blast (Biologie) &uuml;berleben vor der Einfahrt eines synaptischen Netzes von entscheidender Bedeutung ist. Dar&uuml;ber hinaus schlagen unsere Erkenntnisse einen unerwarteten Mechanismus, worin SVZ Astrozyten Glutamat Signalisierung durch NMDARs verwenden, um die Zahl der Erwachsenen-US-amerikanischer Neuronen ihren Bestimmungsort zu steuern.

NMDA-Rezeptoren durch subventrikul&auml;re Zone astrozytische Glutamat aktiviert sind entscheidend f&uuml;r das &Uuml;berleben der Blast (Biologie) vor der Einfahrt eines synaptischen Netzes.

Even before integrating into existing circuitry, adult-born neurons express receptors for neurotransmitters, but the intercellular mechanisms and their impact on neurogenesis remain largely unexplored. Here, we show that neuroblasts born in the postnatal subventricular zone (SVZ) acquire NMDA receptors (NMDARs) during their migration to the olfactory bulb. Along their route, neuroblasts are ensheathed by astrocyte-like cells expressing vesicular glutamate release machinery. Increasing calcium in these specialized astrocytes induced NMDAR activity in neuroblasts, and blocking astrocytic vesicular release eliminated spontaneous NMDAR activity. Single-cell knockout of NMDARs using neonatal electroporation resulted in neuroblast apoptosis at the time of NMDAR acquisition. This cumulated in a 40% loss of neuroblasts along their migratory route, demonstrating that NMDAR acquisition is critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. In addition, our findings suggest an unexpected mechanism wherein SVZ astrocytes use glutamate signaling through NMDARs to control the number of adult-born neurons reaching their final destination.

NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.

The subventricular zone (SVZ) is one of two regions where neurogenesis persists in the postnatal brain. The SVZ, located along the lateral ventricle, is the largest neurogenic zone in the brain that contains multiple cell populations including astrocyte-like cells and neuroblasts. Neuroblasts migrate in chains to the olfactory bulb where they differentiate into interneurons. Here, we discuss the experimental approaches to record the electrophysiology of these cells and image their migration and calcium activity in acute slices. Although these techniques were in place for studying glial cells and neurons in mature networks, the SVZ raises new challenges due to the unique properties of SVZ cells, the cellular diversity, and the architecture of the region. We emphasize different methods, such as the use of transgenic mice and in vivo electroporation that permit identification of the different SVZ cell populations for patch clamp recording or imaging. Electroporation also permits genetic labeling of cells using fluorescent reporter mice and modification of the system using either RNA interference technology or floxed mice. In this review, we aim to provide conceptual and technical details of the approaches to perform electrophysiological and imaging studies of SVZ cells.

Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.

Die subventrikul&auml;re Zone (SVZ) ist eine von zwei Regionen, wo die Neurogenese im postnatalen Gehirn weiterhin besteht. Die SVZ, befindet sich entlang der seitlichen Ventrikel ist die gr&ouml;&szlig;te neurogene Zone im Gehirn, das mehrere Zelle Bev&ouml;lkerungen einschlie&szlig;lich Gliazelle-wie Zellen und Neuroblasten enth&auml;lt. Neuroblasten migrieren in Ketten zu den Riechkolben, wo sie in Interneuronen zu unterscheiden. Hier diskutieren wir die experimentellen Ans&auml;tze um die Elektrophysiologie dieser Zellen und Bild ihre Migration und Kalzium-Aktivit&auml;t in akuten Scheiben zu notieren. Obwohl diese Techniken f&uuml;r die Untersuchung von Gliazellen und Neuronen im Reifen Netzwerke waren, l&ouml;st die SVZ neue Herausforderungen aufgrund der einzigartigen Eigenschaften des SVZ Zellen, die zellul&auml;re Vielfalt und die Architektur der Region. Wir betonen verschiedene Methoden, z. B. die Verwendung von transgenen M&auml;usen und in-vivo Elektroporation, die Identifizierung der verschiedenen SVZ Zelle Bev&ouml;lkerungen f&uuml;r Patch Clamp aufnehmen oder imaging erm&ouml;glichen. Elektroporation l&auml;sst auch genetische Kennzeichnung von Zellen mit fluoreszierenden Reporter M&auml;usen und &Auml;nderung des Systems verwenden entweder RNA-Interferenz-Technologie oder Floxed-M&auml;use. In diesem Bericht wollen wir bieten konzeptionelle und technische Informationen &uuml;ber die Ans&auml;tze, elektrophysiologische und bildgebende Untersuchungen der SVZ Zellen durchzuf&uuml;hren.

Bildgebung und subventrikul&auml;re Zone Progenitorzellen bei Aufnahme Leben Gewebe der postnatalen M&auml;use.

In the postnatal neurogenic niche, two populations of astrocyte-like cells (B cells) persist, one acting as neural progenitor cells (NPCs, B1 cells) and one forming a structural boundary between the neurogenic niche and the striatum (B2 cells, niche astrocytes). Despite being viewed as two distinct entities, we found that B1 and B2 cells express the gap junction protein connexin 43 and display functional coupling involving 50-60 cells. Using neonatal electroporation to label slowly cycling radial glia-derived B1 cells, which send a basal process onto blood vessels, we further confirmed dye coupling between NPCs. To assess the functionality of the coupling, we used calcium imaging in a preparation preserving the three-dimensional architecture of the subventricular zone. Intercellular calcium waves were observed among B cells. These waves travelled bidirectionally between B1 and B2 cells and propagated on blood vessels. Inter-B-cell calcium waves were absent in the presence of a gap junction blocker but persisted with purinergic receptor blockers. These findings show that privileged microdomains of communication networks exist among NPCs and niche astrocytes. Such functional coupling between these two cell types suggests that niche astrocytes do not merely have a structural role, but may play an active role in shaping the behavior of NPCs.

Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells.

In der postnatalen neurogene Nische beibehalten zwei Populationen von Gliazelle-&auml;hnlichen Zellen (B), eine als neuronalen Vorl&auml;uferzellen (NPCs, B1-Zellen) und eine strukturelle Barriere zwischen der neurogenen Nische und Striatum (B2-Zellen, Nische Astrozyten) bilden. Trotz als zwei unterschiedliche Entit&auml;ten angezeigt wird, fanden wir, dass die Zellen B1 und B2 express die L&uuml;cke Kreuzung Protein Connexin 43 und funktionelle Kopplung mit 50-60 Zellen angezeigt. Neonatale Electroporation Label langsam Radfahren radiale Glia abgeleitete B1 Zellen, die einen basalen Prozess auf Blutgef&auml;&szlig;e zu senden verwenden, best&auml;tigt wir Farbstoff Kupplung zwischen NPCs weiter. Um die Funktionalit&auml;t der Verbindung zu bewerten, haben wir Kalzium Bildgebung verwendet, in einer Zubereitung, die Erhaltung der dreidimensionalen Architektur der subventrikul&auml;re Zone. Interzellul&auml;re Kalzium Wellen wurden unter den B-Zellen beobachtet. Diese Wellen reiste bidirektional zwischen B1 und B2-Zellen und auf die Blutgef&auml;&szlig;e weitergegeben. Inter-B-Zell-Kalzium, die Wellen waren abwesend in der Gegenwart eine L&uuml;cke-Kreuzung-Blocker aber beibehalten mit Purinergic-Rezeptor-Blocker. Diese Ergebnisse zeigen, dass privilegierte Microdomains Kommunikationsnetze unter NPCs und Nischen Astrozyten vorhanden sind. Solche funktionalen Kopplung zwischen diesen beiden Zelltypen legt nahe, dass die Nische Astrozyten haben nicht nur eine strukturelle Rolle, sondern k&ouml;nnen eine aktive Rolle bei der Gestaltung des Verhaltens der NPCs.

Gap Junction-vermittelte Kalzium Wellen definieren Kommunikationsnetze unter murinen postnatale neuronalen Vorl&auml;uferzellen.

The postnatal subventricular zone (SVZ) contains proliferating neural progenitor cells in close proximity to blood vessels. Insults and drug treatments acutely stimulate cell proliferation in the SVZ, which was assessed by labeling cells entering S phase. Although G1-to-S progression is metabolically demanding on a minute-to-hour time scale, it remains unknown whether increased SVZ cell proliferation is accompanied by a local hemodynamic response. This neurovascular coupling provides energy substrates to active neuronal assemblies. Transcardial dye perfusion revealed the presence of capillaries throughout the SVZ that constrict upon applications of the thromboxane A(2) receptor agonist U-46119 in acute brain slice preparations. We then monitored in vivo blood flow using laser Doppler flowmetry via a microprobe located either in the SVZ or a mature network. U-46119 injections into the lateral ventricle decreased blood flow in the SVZ and the striatum, which are near the ventricle. A 1-hour ventricular injection of epidermal and basic fibroblast growth factor (EGF and bFGF) significantly increased the percentage of Sox2 transcription factor-positive cells in S phase 1.5 hours post-injection. This increase was accompanied by a sustained rise in blood flow in the SVZ but not in the striatum. Direct growth factor injections into the cortex did not alter local blood flow, ruling out direct effects on capillaries. These findings suggest that an acute increase in the number of G1-to-S cycling SVZ cells is accompanied by neurometabolic-vascular coupling, which may provide energy and nutrient for cell cycle progression.

S phase entry of neural progenitor cells correlates with increased blood flow in the young subventricular zone.

Die postnatale subventrikul&auml;re Zone (SVZ) enth&auml;lt wuchernden neuronalen Vorl&auml;uferzellen in unmittelbarer N&auml;he zum Blutgef&auml;&szlig;e. Beleidigungen und medikament&ouml;se Behandlungen f&ouml;rdern akut Zellproliferation in der SVZ, die durch Kennzeichnung Zellen in S Phase beurteilt wurde. Obwohl G1--s Fortschreiten metabolisch auf einer Zeitskala von Minuten bis Stunden verlangt, ist es unbekannt, ob erh&ouml;hte SVZ Zellproliferation durch eine lokale h&auml;modynamische Antwort begleitet wird. Diese Neurovaskul&auml;re Kopplung bietet Energie-Substrate auf aktive neuronale Assemblys. Transcardial Farbstoff Perfusion ergab das Vorhandensein von Kapillaren in der SVZ, die auf Anwendungen der Thromboxan A(2)-Rezeptoragonist U-46119 bei akuten Gehirn Segment Vorbereitungen zu verengen. Wir &uuml;berwachten dann in-vivo Blutfluss mit Laser-Doppler-Flu&szlig;messung &uuml;ber eine Mikrosonde befindet sich entweder in der SVZ oder ausgereifte Netzwerk. U-46119-Injektionen in der seitlichen Ventrikel verringerte Blutfluss in der SVZ und Striatum, die in der N&auml;he der Ventrikel. Eine Stunde ventrikul&auml;re Injektion von epidermalen und basic Fibroblast Growth Factor (EGF und bFGF) deutlich erh&ouml;ht den Prozentsatz des Sox2 Transkription Faktor-positiven Zellen in S Phase 1,5 Stunden Post-injection. Dieser Anstieg war durch einen anhaltenden Anstieg der Blutfluss in der SVZ aber nicht im Striatum begleitet. Direkte Wachstumsfaktor-Injektionen in der Hirnrinde lokale Durchblutung, direkte Auswirkungen auf die Kapillaren auszuschlie&szlig;en nicht ge&auml;ndert werden. Diese Forschungsergebnisse legen nahe, dass eine akute Zunahme der Zahl der G1-S-Radfahren SVZ Zellen Neurometabolische-Kreislauf Kupplung, beigef&uuml;gt ist, die Energie- und N&auml;hrstoff Zellzyklusprogression vorsehen.

Article	Year
Dissociation between short-term increased graft survival and long-term functional improvements in Parkinsonian rats overexpressing glial cell line-derived neurotrophic factor. The European journal of neuroscience\| PubMed ID: 15579166	2004
Effect of neurturin on multipotent cells isolated from the adult skeletal muscle. Biochemical and biophysical research communications\| PubMed ID: 15896320	2005
GABA and glutamate signaling: homeostatic control of adult forebrain neurogenesis. Journal of molecular histology\| PubMed ID: 17554632	2007
GABA and glutamate signaling: homeostatic control of adult forebrain neurogenesis. Journal of molecular histology\| PubMed ID: 18309566	2007
NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron\| PubMed ID: 20346761	2010
Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in neuroscience\| PubMed ID: 20700392	2010
Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. The European journal of neuroscience\| PubMed ID: 22098557	2011
S phase entry of neural progenitor cells correlates with increased blood flow in the young subventricular zone. PloS one\| PubMed ID: 22359646	2012

Benjamin Lacar

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