antibody-transfection-into-neurons-as-tool-to-study-disease

Antibody Transfection into Neurons as a Tool to Study Disease Pathogenesis

Antibodies provide the ability to gain novel insight into various events taking place in living systems.  The ability to produce highly specific ...

A fundamental question in biology is how the various motifs in G protein-coupled receptors participate in the divergent functions orchestrated by these molecules. Here we describe a fundamental role for a serine residue at position 312 in the third intracellular loop of the human beta(1)-adrenergic receptor (beta(1)-AR) in endocytic recycling of the agonist-internalized receptor. In receptor recycling experiments that were monitored by confocal microscopy, the agonist-internalized wild-type (WT) beta(1)-AR recycled with a t(0.5) of 14 +/- 3 min. Mutagenesis of Ser(312) to alanine (Ser(312) --> Ala beta(1)-AR) or to the phosphoserine mimic aspartic acid (Ser(312) --> Asp beta(1)-AR) resulted in beta(1)-AR constructs that were pharmacologically indistinguishable from the WT beta(1)-AR. The internalized Ser(312) --> Asp beta(1)-AR recycled efficiently with a t(0.5) of 11 +/- 3 min, whereas the internalized Ser(312) --> Ala beta(1)-AR was not recycled or functionally resensitized through the endosomal pathway. Because this serine is a putative residue for phosphorylation by the cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA), we examined the role of this kinase in recycling of the internalized beta(1)-AR. Inhibition of PKA biochemically or genetically using a dominant negative PKA construct blocked the recycling of the internalized WT beta(1)-AR. Phosphorylation studies revealed that the beta(1)-AR is partially phosphorylated by PKA and that phosphorylation of the beta(1)-AR by the catalytic subunit of PKA occurs exclusively at Ser(312). Our results identify a new signaling paradigm in which homologous activation of a kinase provides a reversible modification that shifts the itinerary of the internalized receptor toward recycling and resensitization. Therefore, PKA-mediated phosphorylation of G protein-coupled receptors might result in motif-dependent desensitization or resensitization.

Role of the cyclic AMP-dependent protein kinase in homologous resensitization of the beta1-adrenergic receptor.

Eine grundlegende Frage in der Biologie ist, wie die verschiedenen Motive G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in den unterschiedlichen Funktionen, orchestriert von dieser Molek&uuml;le teilnehmen. Hier beschreiben wir eine grundlegende Rolle f&uuml;r eine Serin-R&uuml;ckstand an Position 312 in der dritten intrazellul&auml;ren Schleife des menschlichen Beta (1)-adrenerge Rezeptor (beta(1)-AR) in endocytic recycling von den Rezeptor Agonist-verinnerlicht. Rezeptor-recycling-Experimente waren, die durch konfokale Mikroskopie, der Agonist-verinnerlicht Wildtyp (WT) Beta 1-AR Recycling mit einer t(0.5) von 14 +/-3 min. Mutagenese des Ser(312) von Alanin (Ser(312)--&gt; Ala beta(1)-AR) oder Phosphoserinphosphatase mimischer Asparagins&auml;ure (Ser(312)--&gt; Asp beta(1)-AR) resultierte in Beta-1-AR-Konstrukte, die pharmakologisch ununterscheidbar von den WT Beta 1-AR. waren &uuml;berwacht Die verinnerlichten Ser(312)--&gt; Asp Beta 1-AR Recycling effizient mit einer t(0.5) von 11 +/-3 min, w&auml;hrend die verinnerlichten Ser(312)--&gt; Ala Beta 1-AR nicht recycelt oder funktional durch die Endosomen-Pathway nationalstaatlicher wurde. Da diese Serin vermeintlichen R&uuml;ckst&auml;nde f&uuml;r die Phosphorylierung von der zyklischem AMP-abh&auml;ngige Proteinkinase (PKA) ist, untersucht die Rolle der diese Kinase des verinnerlichten Beta 1-AR. Hemmung der PKA biochemisch oder genetisch mit einer dominanten negative PKA-Konstrukt blockiert die verinnerlichten WT Beta 1-AR-recycling Recycling Phosphorylierung Studien belegten, dass die Beta-1-AR teilweise durch PKA und die Phosphorylierung der Beta 1-AR durch die katalytische Untereinheit des PKA phosphoryliert ist erfolgt ausschlie&szlig;lich auf Ser(312). Unsere Ergebnisse identifiziert ein neues Signal Paradigma, in dem homologe Aktivierung einer Kinase eine reversible &Auml;nderung bereitstellt, die die Reiseroute des verinnerlichten Rezeptors in Richtung recycling und Resensitization verschiebt. Daher kann PKA-vermittelte Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelter Rezeptoren Motiv-abh&auml;ngige Desensibilisierung oder Resensitization f&uuml;hren.

Rolle der zyklischem AMP-abh&auml;ngigen Proteinkinase in homologe Resensitization die beta1-adrenerge Rezeptor.

Several key amino acids within amphipathic helix 8 of the human beta1-adrenergic receptor (beta1-AR) were mutagenized to characterize their role in signaling by G protein-coupled receptors. Mutagenesis of phenylalanine at position 383 in the hydrophobic interface to histidine (F383H) prevented the biosynthesis of the receptor, indicating that the orientation of helix 8 is important for receptor biosynthesis. Mutagenesis of aspartic acid at position 382 in the hydrophilic interface to leucine (D382L) reduced the binding and uncoupled the receptor from G protein activation. Mutagenesis of the basic arginine residue at position 384 to glutamine (R384Q) or to glutamic acid (R384E) increased basal and agonist-stimulated adenylyl cyclase activities. R384Q and R384E displayed features associated with constitutively active receptors because inverse agonists markedly reduced their elevated basal adenylyl cyclase activities. Isoproterenol increased the phosphorylation and promoted the desensitization of the Gly389 or Arg389 allelic variants of the wild type beta1-AR but failed to produce these effects in R384Q and R384E, because these receptors were maximally phosphorylated and desensitized under basal conditions. In contrast to the membranous distribution of the wild type beta1-AR, R384Q and R384E were localized mostly within intracellular punctate structures. Inverse agonists restored the membranous distribution of R384Q and R384E, indicating that they recycled normally when their constitutive internalization was blocked by inverse agonists. These data combined with computer modeling of the putative three-dimensional organization of helix 8 indicated that the amphipathic character of helix 8 and side chain projections of Asp382 and Arg384 within the hydrophilic interface might serve as a tethering site for the G protein.

Characterization of the residues in helix 8 of the human beta1-adrenergic receptor that are involved in coupling the receptor to G proteins.

Mehrere wichtige Aminos&auml;uren innerhalb amphipathische Helix 8 von den menschlichen beta1-adrenerge Rezeptor (beta1-AR) wurden mutagenized, um ihre Rolle bei der Signalisierung durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren zu charakterisieren. Mutagenese von Phenylalanin an Position 383 in der hydrophoben Oberfl&auml;che, Histidin (F383H) verhindert die Biosynthese des Rezeptors, darauf hinweist, dass die Ausrichtung der Helix 8 f&uuml;r Rezeptor-Biosynthese wichtig. Mutagenese von Asparagins&auml;ure an Position 382 in der hydrophile Oberfl&auml;che, Leucin (D382L) reduziert die Bindung und losgel&ouml;st von der G-Protein-Aktivierung des Rezeptors. Mutagenese des R&uuml;ckstands grundlegende Arginin an Position 384 Glutamin (R384Q) oder Glutamins&auml;ure (R384E) erh&ouml;hte basale und Agonist stimuliert Fehlfunktion Guanylatcyclase Aktivit&auml;ten. R384Q und R384E angezeigt Funktionen konstitutiv aktiven Rezeptoren zugeordnet, weil inverse Agonisten ihre erh&ouml;hten basalen Fehlfunktion Guanylatcyclase Aktivit&auml;ten deutlich reduziert. Isoproterenol erh&ouml;ht die Phosphorylierung und f&ouml;rderte die Desensibilisierung der Gly389 oder Arg389 allelischen Varianten der Wildtyp beta1-AR aber vers&auml;umt, diese Effekte in R384Q und R384E, zu produzieren, da diese Rezeptoren wurden maximal phosphoryliert und basalen Bedingungen desensibilisiert. Im Gegensatz zu der membran&ouml;se Verteilung der Wildtyp beta1-AR wurden R384Q und R384E meist in intrazellul&auml;ren punctata Strukturen lokalisiert. Inverse Agonisten restauriert die membran&ouml;se Verteilung von R384Q und R384E, darauf hinweist, dass sie normalerweise recycelt, wenn ihre konstitutive Internalisierung durch inverse Agonisten blockiert wurde. Diese Daten zusammen mit Computer-Modellierung der vermeintlichen dreidimensionale Organisation der Helix 8 darauf hingewiesen, dass die AMPHIPHILE Charakter der Helix 8 und Seite Kette Projektionen von Asp382 und Arg384 die hydrophile Oberfl&auml;che als begrenzende Website f&uuml;r das G-Protein dienen k&ouml;nnte.

Charakterisierung der R&uuml;ckst&auml;nde in Helix 8 von den menschlichen beta1-adrenerge Rezeptor, die Ankopplung des Rezeptors an G-Proteine beteiligt sind.

Competition binding isotherms for agonists to G protein-coupled receptors (GPCR) display high and low binding affinities. Mutagenesis of lysine at position 324 in helix 6 of the wild-type (WT) human beta1-adrenergic receptor (beta1-AR) generated mutant receptors that had GTP-insensitive single low-affinity binding sites for agonists and reduced potencies of full or partial agonists in stimulating adenylyl cyclase. Unlike the WT beta1-AR, intrinsic activities of full and partial agonists in activating the Lys324-->Ala beta1-AR (K324A) mutant were correlated with their binding affinities to the K324A mutant. In assays, such as agonist-mediated phosphorylation and recycling, the K324A mutant and the WT beta1-AR behaved similarly. However, in fluorescence resonance energy transfer assays that determined the proximity between the WT beta1-AR or the K324A mutant to G(s)alpha, there were significant differences. The conceptual framework of the ternary complex model could not adequately account for the behavior of the K324A mutant except under assumptions of low receptor-G protein binding affinities. The single low-affinity binding site of the K324A mutant to isoproterenol was converted by the C-terminal 11-amino-acid peptide of G(s)alpha, which acts a GDP-bound G(s)alpha mimic, to high- and low-affinity sites. Based upon the three-dimensional architecture of the human beta1-AR, the distance between Lys324 and the Asp/Glu-Arg-Tyr motif in helix 3 was the shortest among the various amino acids in helix 6. These findings indicate that Lys324 lies in a groove between helices 3 and 6, and its mutagenesis generates a mutant receptor with very low binding affinity for the GDP-bound isoform of G(s).

Mutagenesis within helix 6 of the human beta1-adrenergic receptor identifies Lysine324 as a residue involved in imparting the high-affinity binding state of agonists.

Wettbewerb Bindung Isothermen f&uuml;r Agonisten an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) zeigen hohe und niedrige verbindliche Affinit&auml;ten. Mutagenese von Lysin an Position 324 Helix 6 der Wildtyp (WT) menschlichen beta1-adrenerge Rezeptor (beta1-AR) generiert mutierten Rezeptoren, die GTP-unempfindliche einzelne niedrige Affinit&auml;t Bindungsstellen f&uuml;r Agonisten und reduzierte Potenzen der vollst&auml;ndigen oder partiellen Agonisten in anregenden Fehlfunktion Guanylatcyclase hatte. Im Gegensatz zu den WT-beta1-AR wurden systeminterne Aktivit&auml;ten von voll- und -Agonisten in der Aktivierung der Lys324--&gt; Ala beta1-AR (K324A) Mutant korreliert mit ihren verbindlichen Affinit&auml;ten zu den K324A-Mutanten. In Tests, wie Agonist-vermittelte Phosphorylierung und recycling verhielt sich der K324A-Mutant und der WT-beta1-AR &auml;hnlich. Bei Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer Assays, die die N&auml;he zwischen der WT-beta1-AR oder den K324A-Mutanten zu G(s) Alpha bestimmt, gab es jedoch erhebliche Unterschiede. Der konzeptionelle Rahmen der tern&auml;ren komplexes Modell k&ouml;nnte das Verhalten der K324A-Mutant au&szlig;er unter Annahmen der niedrigen Rezeptor-G-Protein-Bindung Affinit&auml;ten nicht angemessen ber&uuml;cksichtigt. Die einzelnen geringer Affinit&auml;t-Bindungsstelle von den K324A-Mutanten zu Isoproterenol wurde von der C-terminalen 11-amino-S&auml;ure-Peptid von G(s) Alpha, umgewandelt, die ein BIP gebundene G(s) alpha-Nach&auml;ffer, zu hoher und niedriger Affinit&auml;t Websites fungiert. Auf der Grundlage der dreidimensionalen Architektur der menschlichen beta1-AR, war der Abstand zwischen Lys324 und dem Asp/Glu-Arg-Tyr-Motiv in Helix 3 die k&uuml;rzeste unter den verschiedenen Aminos&auml;uren in Helix 6. Diese Befunde zeigen, dass Lys324 in den Falz zwischen Helices 3 und 6 liegt, und seine Mutagenese einen mutierten Rezeptor mit sehr niedrige Bindungsaffinit&auml;t f&uuml;r das BIP gebundene Isoform von G(s) erzeugt.

Mutagenese innerhalb Helix 6 von den menschlichen beta1-adrenerge Rezeptor identifiziert Lysine324 als einen R&uuml;ckstand in der Vermittlung der hoher Affinit&auml;t Bindungszustand Agonisten beteiligt.

Resensitization of G protein-coupled receptors (GPCR) following prolonged agonist exposure is critical for restoring the responsiveness of the receptor to subsequent challenges by agonist. The 3'-5' cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA) and serine 312 in the third intracellular loop of the human beta(1)-adrenergic receptor (beta(1)-AR) were both necessary for efficient recycling and resensitization of the agonist-internalized beta(1)-AR (Gardner, L. A., Delos Santos, N. M., Matta, S. G., Whitt, M. A., and Bahouth, S. W. (2004) J. Biol. Chem. 279, 21135-21143). Because PKA is compartmentalized near target substrates by interacting with protein kinase A anchoring proteins (AKAPs), the present study was undertaken to identify the AKAP involved in PKA-mediated phosphorylation of the beta(1)-AR and in its recycling and resensitization. Here, we report that Ht-31 peptide-mediated disruption of PKA/AKAP interactions prevented the recycling and functional resensitization of heterologously expressed beta(1)-AR in HEK-293 cells and endogenously expressed beta(1)-AR in SK-N-MC cells and neonatal rat cortical neurons. Whereas several endogenous AKAPs were identified in HEK-293 cells, small interfering RNA-mediated down-regulation of AKAP79 prevented the recycling of the beta(1)-AR in this cell line. Co-immunoprecipitations and fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy experiments in HEK-293 cells revealed that the beta(1)-AR, AKAP79, and PKA form a ternary complex at the carboxyl terminus of the beta(1)-AR. This complex was involved in PKA-mediated phosphorylation of the third intracellular loop of the beta(1)-AR because disruption of PKA/AKAP interactions or small interfering RNA-mediated down-regulation of AKAP79 both inhibited this response. Thus, AKAP79 provides PKA to phosphorylate the beta(1)-AR and thereby dictate the recycling and resensitization itineraries of the beta(1)-AR.

AKAP79-mediated targeting of the cyclic AMP-dependent protein kinase to the beta1-adrenergic receptor promotes recycling and functional resensitization of the receptor.

Resensitization von G Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) nach l&auml;ngerer Agonist Exposition ist entscheidend f&uuml;r die Wiederherstellung der Reaktionsf&auml;higkeit des Rezeptors auf nachfolgende Herausforderungen von Agonist. Die 3&#39;-5&#39; zyklischem AMP-abh&auml;ngige Proteinkinase (PKA) und Serin 312 in der dritten intrazellul&auml;ren Schleife des menschlichen Beta (1)-adrenerge Rezeptor (beta(1)-AR) waren beide notwendig f&uuml;r effizientes recycling und Resensitization der Agonist-verinnerlicht Beta 1-AR (Gardner, L. A., Delos Santos, N. M., Matta, S. G., Whitt, M. A. und Bahouth, S. W. (2004) J. Biol. Chem. 27921135-21143). Da PKA durch die Interaktion mit Protein Kinase A verankern Proteine (AKAPs) in der N&auml;he deiner Substrate aufgeteilt ist, wurde die vorliegende Studie unternommen, um die AKAP PKA-vermittelte Phosphorylierung der Beta 1-AR und der seine recycling und Resensitization zu identifizieren. Hier berichten wir, dass Ht-31 Peptid-vermittelte St&ouml;rung der PKA/AKAP Interaktionen der Recycling- und funktionelle Resensitization heterologously exprimierten Beta 1-AR in den HEK-293-Zellen und endogen exprimierten Beta 1-AR in SK-N-MC Zellen und neonatalen Ratte kortikale Neuronen verhindert. W&auml;hrend mehrere endogene AKAPs in HEK-293-Zellen identifiziert wurden, verhindert kleine interferierender RNA-vermittelte Herunterregulation AKAP79 das recycling der Beta 1-AR in dieser Zelle. Co-Immunpr&auml;zipitation und Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Mikroskopie Experimente in HEK-293-Zellen ergab, dass die Beta 1-AR, AKAP79 und PKA einen tern&auml;ren Komplex im Karboxyl-Terminus von der Beta 1-AR bilden. Komplex beteiligte sich an PKA-vermittelte Phosphorylierung der dritten intrazellul&auml;ren Schleife der Beta 1-AR, weil die Unterbrechung der PKA/AKAP Interaktionen oder kleine interferierender RNA-vermittelte Herunterregulation AKAP79 beide diese Reaktion gehemmt. Daher bietet AKAP79 PKA phosphoryliert die Beta 1-AR und damit diktieren die Recycling- und Resensitization Routen von der Beta 1-AR.

AKAP79-vermittelte Ausrichtung der die zyklischem AMP-abh&auml;ngigen Proteinkinase an die beta1-adrenerge Rezeptor f&ouml;rdert recycling und funktionalen Resensitization des Rezeptors.

Appropriate trafficking of the beta(1)-adrenergic receptor (beta(1)-AR) after agonist-promoted internalization is crucial for the resensitization of its signaling pathway. Efficient recycling of the beta(1)-AR required the binding of the protein kinase A anchoring protein-79 (AKAP79) to the carboxyl terminus of the beta(1)-AR (Gardner, L. A., Tavalin, S. A., Goehring, A., Scott, J. D., and Bahouth, S. W. (2006) J. Biol. Chem. 281, 33537-33553). In this study we show that AKAP79 forms a complex with the type 1 PDZ-binding sequence (ESKV) at the extreme carboxyl terminus of the beta(1)-AR, which is mediated by the membrane-associated guanylate kinase (MAGUK) protein SAP97. Thus, the PDZ and its associated SAP97-AKAP79 complex are involved in targeting the cyclic AMP-dependent protein kinase (PKA) to the beta(1)-AR. The PDZ and its scaffold were required for efficient recycling of the beta(1)-AR and for PKA-mediated phosphorylation of the beta(1)-AR at Ser(312). Overexpression of the catalytic subunit of PKA or mutagenesis of Ser(312) to the phosphoserine mimic aspartic acid both rescued the recycling of the trafficking-defective beta(1)-ARDelta PDZ mutant. Thus, trafficking signals transmitted from the PDZ-associated scaffold in the carboxyl terminus of the beta(1)-AR to Ser(312) in the 3rd intracellular loop (3rd IC) were paramount in setting the trafficking itinerary of the beta(1)-AR. The data presented here show that a novel beta(1)-adrenergic receptosome is organized at the beta(1)-AR PDZ to generate a scaffold essential for trafficking and networking of the beta(1)-AR.

Assembly of an SAP97-AKAP79-cAMP-dependent protein kinase scaffold at the type 1 PSD-95/DLG/ZO1 motif of the human beta(1)-adrenergic receptor generates a receptosome involved in receptor recycling and networking.

Entsprechenden Handel mit der Beta (1)-adrenerge Rezeptor (beta(1)-AR) nach Internalisierung Agonist-Promotion f&uuml;r die Resensitization von den Signalweg von entscheidender Bedeutung ist. Effiziente Recyclen der Beta 1-AR die Bindung der Proteinkinase A Verankerung Protein-79 (AKAP79) ben&ouml;tigt, um das Karboxyl-Terminus der Beta 1-AR (Gardner, L. A., Tavalin, S. A., Goehring, A., Scott, J. D. und Bahouth, S. W. (2006) J. Biol. Chem. 281, 33537-33553). In dieser Studie zeigen wir, dass AKAP79 einen Komplex mit der Typ-1-PDZ-Bindung-Sequenz (ESKV bildet) im extremen Karboxyl-Terminus der Beta 1-AR, die durch die Membran-assoziierte Guanylate Kinase (MAGUK) Protein SAP97 vermittelt wird. So sind die PDZ und die damit verbundenen SAP97-AKAP79-Komplex beteiligt bei der Ausrichtung von zyklischem AMP-abh&auml;ngige Proteinkinase (PKA) f&uuml;r die Beta 1-AR. Das PDZ und seine Ger&uuml;st waren f&uuml;r das effiziente Recyclen der Beta 1-AR und PKA-vermittelte Phosphorylierung der Beta 1-AR an Ser(312) erforderlich. Eine &Uuml;berexpression von die katalytische Untereinheit des PKA oder Mutagenese von Ser(312) auf die Phosphoserinphosphatase imitieren Asparagins&auml;ure, die beide gerettet, das recycling von den Menschenhandel-Genen Beta 1-ARDelta-PDZ-Mutanten. Damit Menschenhandel Signale &uuml;bertragen aus dem PDZ-assoziierte Ger&uuml;st in das Karboxyl-Terminus der Beta 1-AR an Ser(312) in der 3. intrazellul&auml;ren Schleife (3. IC) wurden vorrangig bei der Festlegung der Menschenhandel Reiseroute die Beta 1-AR. Die hier vorgestellten Daten zeigen, dass eine neue Beta (1)-adrenerge Receptosome gliedert sich in die Beta 1-AR PDZ generieren ein Ger&uuml;st notwendig f&uuml;r Menschenhandel und Vernetzung von der Beta 1-AR.

Montage von einem SAP97-AKAP79-Lager-abh&auml;ngige Protein Kinase Ger&uuml;st an Typ 1-PSD-95/DLG/ZO1-Motiv der menschlichen Beta (1)-adrenerge Rezeptor generiert eine Receptosome-Rezeptor-recycling und Vernetzung beteiligt.

We exploited the fact that leukemic cells utilize significantly higher levels of S-adenosylmethionine (SAMe) than normal lymphocytes and developed tools that selectively diminished their survival under physiologic conditions. Using RNA interference gene silencing technology, we modulated the kinetics of methionine adenosyltransferase-II (MAT-II), which catalyzes SAMe synthesis from ATP and l-Met. Specifically, we silenced the expression of the regulatory MAT-IIbeta subunit in Jurkat cells and accordingly shifted the K(m L-Met) of the enzyme 10-15-fold above the physiologic levels of l-Met, thereby reducing enzyme activity and SAMe pools, inducing excessive apoptosis and diminishing leukemic cell growth in vitro and in vivo. These effects were reversed at unphysiologically high l-Met (>50 microm), indicating that diminished leukemic cell growth at physiologic l-Met levels was a direct result of the increase in MAT-II K(m L-Met) due to MAT-IIbeta ablation and the consequent reduction in SAMe synthesis. In our NOD/Scid IL-2Rgamma(null) humanized mouse model of leukemia, control shRNA-transduced Jurkat cells exhibited heightened engraftment, whereas cells lacking MAT-IIbeta failed to engraft for up to 5 weeks post-transplant. These stark differences in malignant cell survival, effected by MAT-IIbeta ablation, suggest that it may be possible to use this approach to disadvantage leukemic cell survival in vivo with little to no harm to normal cells.

Selective targeting of leukemic cell growth in vivo and in vitro using a gene silencing approach to diminish S-adenosylmethionine synthesis.

Wir nutzen die Tatsache, dass leuk&auml;mischen Zellen nutzen deutlich h&ouml;here S-Adenosylmethionine (gleiche) als normale Lymphozyten und entwickelten Tools, die ihr &Uuml;berleben unter physiologischen Bedingungen selektiv vermindert. RNA Interferenz-gen-silencing-Technologie verwenden, moduliert wir die Kinetik von Methionin Adenosyltransferase-II (MAT-II), die gleichen Synthese von ATP katalysiert und l-Met. Insbesondere wir schweigen Ausdruck der regulatorischen Untereinheit der MAT-IIbeta in Jurkat-Zellen und dementsprechend verlagerte die K (m L-Met) der Enzym 10-15-Falte &uuml;ber das physiologische Ausma&szlig; der l-Met, wodurch Enzymaktivit&auml;t und gleichen Pools, &uuml;berm&auml;&szlig;ige Apoptose induzieren und abnehmender leuk&auml;mischen Zellen Wachstum in vitro und in vivo. Diese Effekte wurden umgekehrt bei unphysiologically hoch l-Met (&gt; 50 Microm), angibt, das verminderte Wachstum der leuk&auml;mischen Zellen auf physiologische l-Met Ebenen war eine direkte Folge der Zunahme der MAT-II K(m L-Met) aufgrund von MAT-IIbeta abtragen und die konsequente Reduktion in der gleichen Synthese. Nach Transplantation in unsere NOD/Scid-IL-2Rgamma(null) humanisierten Mausmodell an Leuk&auml;mie, Kontrolle ShRNA-septischen Jurkat Zellen erh&ouml;hte Verteilung, ausgestellt, w&auml;hrend fehlt MAT-IIbeta Fehler beim Raft Zellen f&uuml;r bis zu 5 Wochen. Diese krassen Unterschiede in b&ouml;sartige Zelle &uuml;berleben, bedingt durch die MAT-IIbeta Ablation, schlage vor, dass es m&ouml;glich ist, diesen Ansatz zu verwenden, um zu leuk&auml;mischen Zellen &Uuml;berleben in-vivo mit wenig bis kein Schaden, zum normalen Zellen zu benachteiligen.

Selektive Ausrichtung der leuk&auml;mischen Zellwachstum in vivo und in vitro mithilfe eines Gens Unterdr&uuml;ckender Ansatz, um S-Adenosylmethionine Synthese zu verringern.

ÃŸ1-adrenergic receptors (ÃŸ1-AR) are internalized in response to agonists and then recycle back for another round of signaling. The serine 312 to alanine mutant of the ÃŸ1-AR (S312A) is internalized but does not recycle. We determined that WT ÃŸ1-AR and S312A were internalized initially to an early sorting compartment because they colocalized by >70% with the early endosomal markers rab5a and early endosomal antigen-1 (EEA1). Subsequently, the WT ÃŸ1-AR trafficked via rab4a-expressing sorting endosomes to recycling endosomes. In recycling endosomes WT ÃŸ1-AR were colocalized by >70% with the rab11 GTPase. S312A did not colocalize with either rab4a or rab11, instead they exited from early endosomes to late endosomes/lysosomes in which they were degraded. Rab11a played a prominent role in recycling of the WT ÃŸ1-AR because dominant negative rab11a inhibited, while constitutively active rab11a accelerated the recycling of the ÃŸ1-AR. Next, we determined the effect of each of the rab11-interacting proteins on trafficking of the WT ÃŸ1-AR. The recycling of the ÃŸ1-AR was markedly inhibited when myosin Vb, FIP2, FIP3 and rabphillin were knocked down. These data indicate that rab11a and a select group of its binding partners play a prominent role in recycling of the human ÃŸ1-AR.

Rab11a and its binding partners regulate the recycling of the ÃŸ1-adrenergic receptor.

&szlig;1-adrenerge Rezeptoren (&szlig;1-AR) sind als Antwort auf Agonisten verinnerlicht und dann wieder f&uuml;r eine weitere Runde der Signalisierung zu recyceln. Die Serin-312, Alanin Mutant der &szlig;1-AR (S312A) verinnerlicht ist aber nicht zu recyceln. Wir festgestellt, dass WT &szlig;1-AR und S312A zun&auml;chst zu einer fr&uuml;hen Sortierung Fach verinnerlicht wurden weil sie durch colocalized &gt; 70 % mit den fr&uuml;hen Endosomen Marker rab5a und fr&uuml;hen Endosomen Antigen-1 (EEA1). Anschlie&szlig;end verschleppt die WT &szlig;1-AR &uuml;ber rab4a-Ausdruck Sortierung Endosomen Recycling Endosomen. Recycling Endosomen WT wurden &szlig;1-AR von colocalized &gt; 70 % mit der rab11-GTPase. S312A nicht mit rab4a oder rab11 colocalize, stattdessen verlassen sie aus fr&uuml;hen Endosomen zu sp&auml;ten Endosomen/Lysosomen, in denen sie degradiert wurden. Rab11a spielte eine wichtige Rolle im recycling der WT &szlig;1-AR, da dominant negative rab11a gehemmt, w&auml;hrend konstitutiv aktive rab11a beschleunigt der &szlig;1-AR-recycling, Als n&auml;chstes bestimmt wir die Auswirkungen der rab11-Interaktion Proteine zum Handel mit den WT &szlig;1-AR. Das recycling der &szlig;1-AR war deutlich gehemmt, wenn Myosin Vb, FIP2, FIP3 und Rabphillin abgerissen wurden. Diese Daten deuten darauf hin, dass rab11a und einer ausgew&auml;hlten Gruppe von seiner Bindung-Partner eine herausragende Rolle im recycling von der menschlichen &szlig;1-AR spielen.

Article	Year
Role of the cyclic AMP-dependent protein kinase in homologous resensitization of the beta1-adrenergic receptor. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 14990580	2004
Characterization of the residues in helix 8 of the human beta1-adrenergic receptor that are involved in coupling the receptor to G proteins. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 16500896	2006
Mutagenesis within helix 6 of the human beta1-adrenergic receptor identifies Lysine324 as a residue involved in imparting the high-affinity binding state of agonists. Molecular pharmacology\| PubMed ID: 16760361	2006
AKAP79-mediated targeting of the cyclic AMP-dependent protein kinase to the beta1-adrenergic receptor promotes recycling and functional resensitization of the receptor. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 16940053	2006
Assembly of an SAP97-AKAP79-cAMP-dependent protein kinase scaffold at the type 1 PSD-95/DLG/ZO1 motif of the human beta(1)-adrenergic receptor generates a receptosome involved in receptor re... The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 17170109	2007
Selective targeting of leukemic cell growth in vivo and in vitro using a gene silencing approach to diminish S-adenosylmethionine synthesis. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 18753136	2008
Rab11a and its binding partners regulate the recycling of the ÃŸ1-adrenergic receptor. Cellular signalling\| PubMed ID: 20727405	2011

Lidia A. Gardner

Biography

JoVE Journal Publications

Other Publications