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Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Many of the antigen targets of adaptive immune response, recognized by B and T cells, have not been defined 1. This is particularly true in autoimmune ...

Carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule-1 (CEACAM1) is a surface glycoprotein expressed on various blood cells, epithelial cells, and vascular cells. CEACAM1 possesses adhesive and signaling properties mediated by its intrinsic immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs that recruit SHP-1 protein-tyrosine phosphatase. In this study, we demonstrate that CEACAM1 is expressed on the surface and in intracellular pools of platelets. In addition, CEACAM1 serves to negatively regulate signaling of platelets by collagen through the glycoprotein VI (GPVI)/Fc receptor (FcR)-gamma-chain. ceacam1(-/-) platelets displayed enhanced type I collagen and GPVI-selective ligand, collagen-related peptide (CRP), CRP-mediated platelet aggregation, enhanced platelet adhesion on type I collagen, and elevated CRP-mediated alpha and dense granule secretion. Platelets derived from ceacam1(-/-) mice form larger thrombi when perfused over a collagen matrix under arterial flow compared with wild-type mice. Furthermore, using intravital microscopy to ferric chloride-injured mesenteric arterioles, we show that thrombi formed in vivo in ceacam1(-/-) mice were larger and were more stable than those in wild-type mice. GPVI depletion using monoclonal antibody JAQ1 treatment of ceacam1(-/-) mice showed a reversal in the more stable thrombus growth phenotype. ceacam1(-/-) mice were more susceptible to type I collagen-induced pulmonary thromboembolism than wild-type mice. Thus, CEACAM1 acts as a negative regulator of platelet-collagen interactions and of thrombus growth involving the collagen GPVI receptor in vitro and in vivo.

CEACAM1 negatively regulates platelet-collagen interactions and thrombus growth in vitro and in vivo.

Carcinoembryonales Antigen Zelle Adh&auml;sion Molek&uuml;l-1 (CEACAM1) ist ein Oberfl&auml;che Glykoprotein auf verschiedenen Blutzellen, Epithelzellen und vaskul&auml;re Zellen. CEACAM1 besitzt Kleber und Signalisierung Eigenschaften vermittelt durch seine systeminternen Aramburuzabala Tyrosin-basierte hemmenden Motive, die SHP-1-Protein-Tyrosin-Phosphatase zu rekrutieren. In dieser Studie demonstriert, dass CEACAM1 auf der Oberfl&auml;che und in intrazellul&auml;re Pools von Thrombozyten ausgedr&uuml;ckt wird. Dar&uuml;ber hinaus dient CEACAM1, negativ zu regulieren, Signalisierung der Thrombozyten durch Kollagen durch den Glykoprotein VI (GPVI) / FC-Rezeptor (FcR) - Gamma - Kette. ceacam1(-/-) Pl&auml;ttchen angezeigt Verbesserte Typ ich Kollagen und GPVI-selektive Liganden, Kollagen-related-Peptide (CRP), CRP-vermittelten Thrombozytenaggregation verst&auml;rkt Pl&auml;ttchen Adh&auml;sion auf Typ I Kollagen, und erh&ouml;hten CRP-vermittelte Alpha und dichten Untermodul Sekretion. Thrombozyten, die von ceacam1(-/-) M&auml;use Form gr&ouml;&szlig;ere Thromben wenn perfused &uuml;ber eine Kollagen-Matrix unter arteriellen Fluss im Vergleich zu Wildtyp M&auml;usen abgeleitet werden. Dar&uuml;ber hinaus zeigen mit intravital-Mikroskopie, mesenterica Arteriolen Eisenchlorid-verletzt, wir, dass Thromben gebildet in vivo ceacam1(-/-) M&auml;use waren gr&ouml;&szlig;er und stabiler als die Wildtyp M&auml;usen. GPVI Raubbau mit monoklonalen Antik&ouml;rper JAQ1 Behandlungvon ceacam1(-/-) M&auml;use zeigten eine Umkehr in der stabileren Thrombus Wachstum Ph&auml;notyp. ceacam1(-/-) M&auml;use wurden anf&auml;lliger f&uuml;r Typ I Kollagen-induzierten pulmonalen Thromboembolien als Wildtyp M&auml;usen. So wirkt CEACAM1 als einen negativen Regulator der Thrombozyten-Collagen-Interaktionen und der Thrombus Wachstum mit den Kollagen-GPVI-Rezeptor, in-vitro und in vivo.

CEACAM1 regelt negativ Thrombozyten-Collagen-Interaktionen und Thrombus Wachstum in vitro und in vivo.

Pancreatic islets, transplanted into recipients with type 1 diabetes, are exposed to allogenic and auto-immune T-cell responses. We set out to develop an assay to measure these responses using PBMC. Our approach was to prepare spleen extract from the islet donors (allo-antigen) and islet extracts (auto-antigen). To our surprise, we found that spleen extracts potently inhibited the proliferation of human T cells driven by antigen (tetanus toxoid) and mitogen (anti-CD3 mAb, OKT3), whereas extracts prepared from pancreatic islets from the same donor did not suppress T-cell proliferation. Suppression mediated by spleen extracts was unaffected by blocking mAbs against the IL-10R, transforming growth factor-Î² or CD152 (CTLA-4). It was also unaffected by denaturing the spleen extracts by heating, exposing to reducing agents or protease digestion. Because deceased organ donors are commonly given the immunosuppressive glucocorticoid methylprednisolone prior to death, we hypothesized that suppression was due to residual methylprednisolone in the spleen extracts. Methylprednisolone could be detected by mass spectrometry in spleen extracts at concentrations that suppress T-cell proliferation. Finally, the glucocorticoid receptor antagonist mifepristone completely reversed the suppression caused by the spleen extracts. We conclude that extracts of human spleen, but not islets, from deceased organ donors contain sufficient residual methylprednisolone to suppress the proliferation of T-cells in vitro.

Residual methylprednisolone suppresses human T-cell responses to spleen, but not islet, extracts from deceased organ donors.

Pankreas Inselchen, transplantierte in Empf&auml;nger mit Typ 1-Diabetes sind allogene und autoimmune T-Zell-Reaktionen ausgesetzt. Wir uns vorgenommen, um ein Assay zur Messung dieser Antworten mit PBMC zu entwickeln. Unser Ansatz war Milz Auszug aus dem Inselchen Spender (allo-Antigen) vorbereiten und Inselchen extrahiert (Auto-Antigen). Zu unserer &Uuml;berraschung fanden wir, dass die Milz Extrakte stark gehemmt, die Verbreitung von menschlichen T-Zellen, die angetrieben von Antigen (Tetanustoxoid) und Mitogen (Anti-CD3 mAb, OKT3), w&auml;hrend Extrakte aus Pankreas Inseln vom gleichen Spender vorbereitet T-Zellproliferation nicht unterdr&uuml;ckt wurden. Unterdr&uuml;ckung von Milz Extrakte vermittelt verschont von blockieren mAbs gegen den IL-10R, transforming Growth Factor-&beta; oder CD152 (CTLA-4). Es war auch durch Denaturierung der Milz Extrakte von Heizung, Verf&uuml;gbarmachen von Reduktionsmitteln oder Protease Verdauung unber&uuml;hrt. Weil verstorbenen Organspender die immunsuppressive Glukokortikoid-Methylprednisolon vor Tod h&auml;ufig gegeben sind, Hypothese wir, dass verbleibende Methylprednisolon in der Milz Extrakte Unterdr&uuml;ckung zur&uuml;ckzuf&uuml;hren. Methylprednisolon konnte durch Massenspektrometrie in Milz Extrakte bei Konzentrationen erkannt werden, die T-Zellproliferation zu unterdr&uuml;cken. Die Glukokortikoid-Rezeptor-Antagonist Mifepriston umgekehrt schlie&szlig;lich vollst&auml;ndig die Unterdr&uuml;ckung durch die Milz Extrakte verursacht. Wir schlie&szlig;en, dass Ausz&uuml;ge der menschlichen Milz, aber nicht Inselchen aus verstorbenen Organspender ausreichend verbleibende Methylprednisolon enthalten um die Vermehrung von T-Zellen in vitro zu unterdr&uuml;cken.

Article	Year
CEACAM1 negatively regulates platelet-collagen interactions and thrombus growth in vitro and in vivo. Blood\| PubMed ID: 19008452	2009
Residual methylprednisolone suppresses human T-cell responses to spleen, but not islet, extracts from deceased organ donors. International immunology\| PubMed ID: 22378502	2012

Rochna Chand

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