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Mass Cytometry: Protocol for Daily Tuning and Running Cell Samples on a CyTOF Mass Cytometer

In recent years, the rapid analysis of single cells has commonly been performed using flow cytometry and fluorescently-labeled antibodies. However, the ...

In vitro work in this laboratory has identified new DNA lesions resulting from further oxidation of a common biomarker of oxidative damage, 8-oxo-7,8-dihydroguanine (OG). The major product of oxidation of OG in a nucleoside, nucleotide, or single-stranded oligodeoxynucleotide using metal ions that act as one-electron oxidants is the new nucleoside derivative spiroiminodihydantoin (Sp). In duplex DNA an equilibrating mixture of two isomeric products, guanidinohydantoin (Gh) and iminoallantoin (Ia), is produced. These products are also formed by the overall four-electron oxidation of guanosine by photochemical processes involving O(2). DNA template strands containing either Sp or Gh/Ia generally acted as a block to DNA synthesis with the Klenow exo(-) fragment of pol I. However, when nucleotide insertion did occur opposite the lesions, only 2'-deoxyadenosine 5-triphosphate and 2'-deoxyguanine 5-triphosphate were used for primer extension. The Escherichia coli DNA repair enzyme Fpg was able to remove the Sp and Gh/Ia lesions from duplex DNA substrates, although the efficiency was depended on the base opposite the lesion.

Structure and potential mutagenicity of new hydantoin products from guanosine and 8-oxo-7,8-dihydroguanine oxidation by transition metals.

In-vitro-arbeiten in diesem Labor hat neue DNA-L&auml;sionen infolge weiterer Oxidation von gemeinsamen Biomarker der oxidative Sch&auml;den, 8-Oxo-7, 8-Dihydroguanine (OG) identifiziert. Das Hauptprodukt der Oxidation der OG in einem Nukleosid, Nukleotid oder einzelstr&auml;ngige Oligodeoxynucleotide mit Metallionen, die als ein-Elektron-Oxidantien wirken ist die neue Nukleosid Derivative Spiroiminodihydantoin (Sp). In duplex DNA wird eine dieen ausgleichenden Mischung der beiden Isomeren Produkte Guanidinohydantoin (Gh) und Iminoallantoin (Ia), produziert. Diese Produkte werden auch durch die insgesamt vier-Elektronen-Oxidation von Guanosin durch photochemische Prozesse mit O(2) gebildet. DNA Schablone Litzen mit SPS oder Gh/Ia agierte im Allgemeinen als Block zu DNA-Synthese mit dem Klenow-exo(-)-Fragment von Pol I. Jedoch wenn Nukleotid Einf&uuml;gemarke gegen&uuml;ber der L&auml;sionen auftreten, waren nur 2&#39;-Deoxyadenosine 5-Triphosphat und 2&#39;-Deoxyguanine 5-Triphosphat f&uuml;r Z&uuml;ndkapselextension verwendet. Escherichia coli DNA-Reparatur-Enzym Fpg konnte sich duplex DNA-Substrate, die Sp und Gh/Ia L&auml;sionen entziehen, obwohl die Effizienz auf der Basis gegen&uuml;ber der L&auml;sion angewiesen war.

Struktur und Potential Mutagenit&auml;t Hydantoin-Neuheiten von Guanosin und 8-Oxo-7, 8-Dihydroguanine Oxidation von &Uuml;bergangsmetalle.

8-Oxo-7,8-dihydroguanine (OG) is susceptible to further oxidation in vitro to form two secondary oxidation products, guanidinohydantoin (Gh) and spiroiminodihydantoin (Sp). Previous work from this laboratory has shown that OG, Gh, and Sp are recognized and excised from duplex DNA substrates by the Escherichia coli DNA repair enzyme Fpg. In this report, we extend these studies to the functionally related eukaryotic OG glycosylases (OGG) from yeast and humans: yOGG1, yOGG2, and hOGG1. The hOGG1 enzyme was active only toward the removal of 8-oxoguanine, exhibiting a 1000-fold faster rate of removal of 8-oxoguanine from OG.C-containing duplexes relative to their OG.A counterparts. Duplexes containing Gh or Sp opposite any of the four natural bases were not substrates for the hOGG1 enzyme. In contrast, both yOGG1 and yOGG2 enzymes removed Gh and Sp in a relatively efficient manner from an 18 bp duplex. No significant difference was observed in the rate of reaction of Gh- and Sp-containing duplexes with yOGG1. However, yOGG2 removed Sp at a faster rate than Gh. Both yOGG enzymes exhibit a negligible dependence on the base opposite the lesion, suggesting that the activity of these enzymes may be promutagenic. Surprisingly, in the 18 bp sequence context, both yOGG enzymes did not exhibit OG removal activity. However, both removed OG in a 30 bp duplex with a different sequence surrounding the OG. The wide range of repair efficiencies observed by these enzymes with different substrates in vitro suggests that this could greatly affect the mutagenicity of these lesions in vivo. Indeed, the greater efficiency of the yOGG proteins for removal of the further oxidized products, Gh and Sp, over their 8-oxoguanine parent, suggests that these lesions may be the preferred substrates in vivo.

Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2.

8-Oxo-7, 8-Dihydroguanine (OG) ist anf&auml;llig f&uuml;r weitere Oxydation in-vitro zwei sekund&auml;re Oxidationsprodukten, Guanidinohydantoin (Gh) und Spiroiminodihydantoin (Sp) zu bilden. Fr&uuml;here Arbeiten von diesem Labor ergab, dass OG, Gh und Sp erkannt und von duplex DNA-Substrate von Escherichia coli DNA-Reparatur-Enzym Fpg herausgeschnitten werden. In diesem Bericht, wir erweitern diese Studien zu den verwandeten eukaryotischen OG Glycosylases (OGG) von Hefe und Menschen: yOGG1, yOGG2, und hOGG1. Das hOGG1 Enzym war erst gegen die Abschaffung der 8-OGG1, 1000-fold schneller Entfernung des 8-OGG1 von OG ausstellen.C-haltigen Duplices relativ zu ihrer OG.Einen Kollegen. Duplex mit Gh oder Sp gegen&uuml;ber jeder der vier nat&uuml;rlichen Grundlagen waren nicht Substrate f&uuml;r das Enzym hOGG1. Im Gegensatz dazu entfernt sowohl die yOGG1 als auch die yOGG2 Enzyme Gh und Sp in einem relativ effiziente Weise aus einer 18 bp-Duplex. Kein signifikanter Unterschied war die Rate der Reaktion des Gh - und Sp-haltigen Duplexe mit yOGG1 beobachtet. Jedoch entfernt yOGG2 Sp mit einer schnelleren Rate als Gh. Beide yOGG-Enzyme weisen eine vernachl&auml;ssigbare Abh&auml;ngigkeit auf der Basis gegen&uuml;ber der L&auml;sion, was darauf hindeutet, dass die Aktivit&auml;t dieser Enzyme Promutagenic sein kann. &Uuml;berraschenderweise im Zusammenhang mit 18 bp Sequenz, beide yOGG-Enzyme nicht OG Entfernung Aktivit&auml;t aufweisen. Jedoch entfernt beide OG im 30 bp Duplex mit eine andere Sequenz, die rund um die OG. Das breite Spektrum der Reparatur Wirkungsgrade von diese Enzyme mit unterschiedlichen Substraten in-vitro beobachtet legt nahe, dass dies die Mutagenit&auml;t diese L&auml;sionen in-vivo stark beeintr&auml;chtigen k&ouml;nnten. Die gr&ouml;&szlig;ere Effizienz der yOGG-Proteine f&uuml;r die Entfernung der weiteren oxidierte Produkte, Gh und Sp, &uuml;ber Eltern 8-OGG1 deutet, an, dass diese L&auml;sionen k&ouml;nnen die bevorzugten Substrate in-vivo.

Erkennung und Entfernung von oxidierten Guanines in duplex DNA durch die base Exzision reparieren Enzyme hOGG1, yOGG1 und yOGG2.

The waaJ gene encodes an alpha-1,2-glucosyltransferase involved in the synthesis of the outer core region of the lipopolysaccha-ride of some Escherichia coli and Salmonella isolates. WaaJ belongs to glycosyltransferase CAZy family 8, characterized by the GT-A fold, a DXD motif, and by retention of configuration at the anomeric carbon of the donor sugar. Detailed kinetic and structural information for bacterial family 8 glycosyltransferases has resulted from studies of Neisseria meningitidis LgtC. As many as 28 amino acids could be deleted from the C terminus of LgtC without affecting its in vitro catalytic behavior. This C-terminal domain has a high ratio of positively charged and hydrophobic residues, a feature conserved in WaaJ and some other family 8 representatives. Unexpectedly, deletion of as few as five residues from the C terminus of WaaJ resulted in substantially reduced in vivo activity. With deletions of 15 residues or less, activity was only detected when levels of expression were elevated. No in vivo activity was detected after the removal of 20 amino acids, regardless of expression levels. Longer deletions (20 residues and greater) compromised the ability of WaaJ to associate with the membrane. However, the reduced in vivo activity in enzymes lacking 5-12 C-terminal residues also reflected a dramatic drop in catalytic activity in vitro (a 294-fold decrease in the apparent kcat/Km,LPS). Deletions removing 20 or more residues resulted in a protein showing no detectable in vitro activity. Therefore, the C-terminal domain of WaaJ plays a critical role in enzyme function.

The C-terminal Domain of the Escherichia coli WaaJ glycosyltransferase is important for catalytic activity and membrane association.

Das WaaJ-Gen codiert f&uuml;r eine Alpha-1,2-Glucosyltransferase beteiligt bei der Synthese von der &auml;u&szlig;eren Kernregion der Lipopolysaccha-Fahrt einige Escherichia coli und Salmonellen isoliert. WaaJ geh&ouml;rt zur Glycosyltransferase CAZy Familie 8, gekennzeichnet durch die GT-A-Klappe, ein Motiv DXD und Aufbewahrung der Konfiguration am Anomere Kohlenstoffatom des Zuckers Spender. Kinetische und strukturelle Detailinformationen f&uuml;r bakterielle Familie 8 Glycosyltransferasen ist aus Studien von Neisseria Meningitidis LgtC resultiert. Mehr als 28 Aminos&auml;uren konnte von der C-Terminus von LgtC gel&ouml;scht werden, ohne seine in-vitro-katalytische Verhalten. Diese C-terminalen Dom&auml;ne hat einen hohen Anteil an positiv geladenen und hydrophoben R&uuml;ckst&auml;nden, ein Feature in WaaJ und einige andere Vertreter der Familie 8 konserviert. L&ouml;schen von so wenig wie f&uuml;nf R&uuml;ckst&auml;nde aus der Carboxyl-Terminus der WaaJ f&uuml;hrte unerwartet, betr&auml;chtlich reduzierten in-vivo-Aktivit&auml;t. Mit L&ouml;schungen von 15 R&uuml;ckst&auml;nde oder weniger wurde die Aktivit&auml;t nur erkannt, wenn Ebenen des Ausdrucks erhoben wurden. Keine in-vivo-Aktivit&auml;t wurde nach der Entfernung der 20 Aminos&auml;uren, unabh&auml;ngig von Ausdruck erkannt. L&auml;ngere Deletionen (20 R&uuml;ckst&auml;nde und gr&ouml;&szlig;er) beeintr&auml;chtigt die F&auml;higkeit der WaaJ Membran zugeordnet. Jedoch die reduzierte in-vivo-Aktivit&auml;t im Enzyme fehlen 5-12 C-terminal R&uuml;ckst&auml;nde spiegelt auch einen dramatischen R&uuml;ckgang in in-vitro-katalytische Aktivit&auml;t (eine 294-fold Abnahme der scheinbaren Kcat/km, LPS). L&ouml;schungen Entfernen von 20 oder mehr R&uuml;ckst&auml;nde ergab ein Protein zeigen keine nachweisbaren in-vitro-Aktivit&auml;t. Die C-terminalen Dom&auml;ne des WaaJ spielt daher eine wichtige Rolle in Enzym-Funktion.

Die C-terminalen Dom&auml;ne von der Escherichia coli WaaJ Glycosyltransferase ist wichtig f&uuml;r die katalytische Aktivit&auml;t und Membran-Vereinigung.

The waaJ, waaT, and waaR genes encode alpha-1,2-glycosyltransferases involved in synthesis of the outer core region of the lipopolysaccharide of Escherichia coli. They belong to the glycosyltransferase CAZy family 8, characterized by the GT-A fold, DXD motifs, and by retention of configuration at the anomeric carbon of the donor sugar. Each enzyme adds a hexose residue at the same stage of core oligosaccharide backbone extension. However, they differ in the epimers for their donor nucleotide sugars, and in their acceptor residues. WaaJ is a UDP-glucose: (galactosyl) LPS alpha-1,2-glucosyltransferase, whereas WaaR and WaaT have UDP-glucose:(glucosyl) LPS alpha-1,2-glucosyltransferase and UDP-galactose:(glucosyl) LPS alpha-1,2-galactosyltransferase activities, respectively. The objective of this work was to examine their ability to utilize alternate donors and acceptors. When expressed in the heterologous host, each enzyme was able to extend the alternate LPS acceptor in vivo but they retained their natural donor specificity. In vitro assays were then performed to test the effect of substituting the epimeric donor sugar on incorporation efficiency with the natural LPS acceptor of the enzyme. Although each enzyme could utilize the alternate donor epimer, activity was compromised because of significant decreases in k(cat) and corresponding increases in K(m)(donor). Finally, in vitro assays were performed to probe acceptor preference in the absence of the cellular machinery. The results were enzyme-dependent: while an alternate acceptor had no significant effect on the kinetic behavior of His(6)-WaaT, His(6)-WaaJ showed a significantly decreased k(cat) and increased K(m)(acceptor). These results illustrate the differences in behavior between closely related glycosyltransferase enzymes involved in the synthesis of similar glycoconjugates and have implications for glycoengineering applications.

Glycosyltransferases involved in biosynthesis of the outer core region of Escherichia coli lipopolysaccharides exhibit broader substrate specificities than is predicted from lipopolysaccharide structures.

Der WaaJ, WaaT und WaaR Gene codieren Alpha-1,2-Glycosyltransferasen Synthese der Region &auml;u&szlig;eren Kern das Lipopolysaccharid von Escherichia coli beteiligt. Sie geh&ouml;ren zu den Glycosyltransferase CAZy Familie 8, gekennzeichnet durch die GT-A-Klappe, DXD Motiven und Aufbewahrung der Konfiguration am Anomere Kohlenstoffatom des Zuckers Spender. Jedes Enzym f&uuml;gt eine Hexose-R&uuml;ckst&auml;nde auf der gleichen Stufe der Kern-Oligosaccharid-R&uuml;ckgrat-Erweiterung. Jedoch unterscheiden sie sich in die Epimers f&uuml;r ihre Spender-Nukleotid-Zucker und in ihre Akzeptor-R&uuml;ckst&auml;nde. WaaJ ist ein UDP-Glukose: (Galaktosyltransferase) LPS Alpha-1,2-Glucosyltransferase, wohingegen WaaR und WaaT UDP-glucose:(glucosyl) LPS Alpha-1,2-Glucosyltransferase und UDP-galactose:(glucosyl) LPS Alpha-1,2-Galaktosyltransferase Aktivit&auml;ten, bzw. haben. Ziel dieser Arbeit war, ihre F&auml;higkeit, Alternativen Spendern und Acceptors nutzen zu pr&uuml;fen. Wenn im heterologen Host ausgedr&uuml;ckt, konnte jedes Enzym der alternativen LPS-Akzeptor in-vivo verl&auml;ngern, aber behielten sie ihre nat&uuml;rliche Spender-Spezifit&auml;t. In-vitro-Tests wurden dann durchgef&uuml;hrt, um die Auswirkungen der Substitution des Epimeric Spender Zuckers auf Einbeziehung Effizienz mit der nat&uuml;rlichen LPS-Akzeptor des Enzyms testen. Obwohl jedes Enzym der alternativen Spender-Epimer nutzen konnte, war T&auml;tigkeit wegen erheblichen R&uuml;ckgang der k(cat) und entsprechende Erh&ouml;hungen der K(m)(donor) gef&auml;hrdet. Schlie&szlig;lich wurden in-vitro-Tests durchgef&uuml;hrt, um die Sonde Akzeptor Pr&auml;ferenz in Ermangelung der zellul&auml;ren Maschinerie. Die Ergebnisse waren Enzym-abh&auml;ngig: w&auml;hrend eine Alternative Akzeptor keinen signifikanten Einfluss auf das kinetische Verhalten seiner 6-WaaT hatte, seine 6-WaaJ zeigte eine deutlich verminderte k(cat) und erh&ouml;hte K(m)(acceptor). Diese Ergebnisse zeigen die Unterschiede im Verhalten zwischen eng verwandten Glycosyltransferase Enzyme die Synthese von &auml;hnlichen Glykokonjugate beteiligt und haben Auswirkungen auf Glykan-Anwendungen.

Glykosyltransferasen beteiligt bei der Biosynthese von der &auml;u&szlig;eren Kernregion von Escherichia coli Lipopolysaccharide weisen breitere Substrat Besonderheiten als von Lipopolysaccharid Strukturen vorhergesagt ist.

Lectins have been increasingly important in the study of glycoproteins. Here, we report a glycoprofiling method based on the covalent attachment of metal-chelating polymers to lectins for use in an ICP-MS-based assay. The labeled lectins are able to distinguish between glycoproteins covalently attached to a microtiter plate and their binding can be directly quantified by ICP-MS. Since each conjugate contains a different lanthanide, the assays can be conducted in a single or multiplex fashion, and may be readily elaborated to many different assay formats.

ICP-MS-based multiplex profiling of glycoproteins using lectins conjugated to lanthanide-chelating polymers.

Lektine wurden in der Studie von Glykoproteinen zunehmend an Bedeutung. Hier berichten wir &uuml;ber eine Glycoprofiling-Methode, basierend auf die kovalente Anlage Metall-Chelat-Polymere auf Lektine f&uuml;r den Einsatz in einer ICP-MS-gegr&uuml;ndeten Probe. Die beschrifteten Lektine sind zu unterscheiden von Glykoproteinen kovalent gebunden zu einer Mikrotiterplatte und ihre Bindung direkt quantifiziert werden kann, von ICP-MS. Da jede Konjugat eines anderen Lanthanoide enth&auml;lt, die Assays in Einzel- oder multiplex Weise durchgef&uuml;hrt werden k&ouml;nnen, und k&ouml;nnen auf viele verschiedene Assay-Formate leicht erarbeitet werden.

ICP-MS-basierte multiplex Profilerstellung von Glykoproteinen Lektine mit konjugierten Lanthanide Chelat-Polymere.

Fluoreszierende Durchflusszytometrie ist die Methode der Wahl f&uuml;r die Befragung des bakteriellen Bev&ouml;lkerungen auf der Ebene der einzelnen Zelle geworden. Einschr&auml;nkungen dieser Technik umfassen jedoch Fragen der Dynamikbereich, spektrale &Uuml;berlappung, Photobleaching und insgesamt niedrige Signalintensit&auml;t aufgrund der geringen Gr&ouml;&szlig;e der Bakterien. Die aktuelle Entwicklung der Masse Cytometry erlaubt einzellige Analyse mit der Aufl&ouml;sung von Induktiv gekoppelte Plasma-Massenspektrometrie, multiparametric Analyse zu erleichtern. Mit einer Kombination aus einem metallbasierte Membran-Fleck und Lektine Konjugation mit LANTHANIDEN-Chelat-Polymere, zeigen wir, dass einzelne Escherichia coli Zellen basierend auf ihrer Zelle-Oberfl&auml;che Polysaccharide mit mass Cytometry unterschieden werden k&ouml;nnen. Das Modell E. Coli System betrifft die Bewertung von drei verschiedenen Oberfl&auml;che Polysaccharide mit Element-Tags Concanavalin A und Weizenkeime Agglutinin Lektine. Schlie&szlig;lich ersetzt diese Technik aktiviert-Experimente entwickelt, um den Export von O-Antigen folgen Lipopolysaccharid in eine bedingte Mutante. Diese Studien ergeben, dass die Kultur als eine einheitliche Bev&ouml;lkerung reagiert und Lipopolysaccharid-Export ist ungef&auml;hr 10-mal schneller als die logarithmische bakteriell dauert.

Entwicklung von Masse Cytometry Methoden f&uuml;r bakterielle Diskriminierung.

Fluorescent flow cytometry has become the method of choice for interrogation of bacterial populations at the single-cell level. However, limitations of this technique include issues of dynamic range, spectral overlap, photobleaching, and overall low signal intensity due to the small size of bacteria. The recent development of mass cytometry allows single-cell analysis with the resolution of inductively coupled plasma mass spectrometry, facilitating multiparametric analysis. Using a combination of a metal-based membrane stain and lectins conjugated to lanthanide-chelating polymers, we demonstrate that individual Escherichia coli cells can be differentiated based on their cell surface polysaccharides using mass cytometry. The model E. coli system involves evaluation of three different surface polysaccharides using element-tagged concanavalin A and wheat germ agglutinin lectins. Finally, this technique enabled experiments designed to follow the export of O-antigen substituted lipopolysaccharide in a conditional mutant. These studies revealed that the culture responds as a uniform population and that lipopolysaccharide export is approximately 10 times faster than the logarithmic bacterial doubling time.

Article	Year
Structure and potential mutagenicity of new hydantoin products from guanosine and 8-oxo-7,8-dihydroguanine oxidation by transition metals. Environmental health perspectives\| PubMed ID: 12426118	2002
Recognition and removal of oxidized guanines in duplex DNA by the base excision repair enzymes hOGG1, yOGG1, and yOGG2. Biochemistry\| PubMed ID: 14503888	2003
The C-terminal Domain of the Escherichia coli WaaJ glycosyltransferase is important for catalytic activity and membrane association. The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 17090541	2007
Glycosyltransferases involved in biosynthesis of the outer core region of Escherichia coli lipopolysaccharides exhibit broader substrate specificities than is predicted from lipopolysacchari... The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 17631498	2007
ICP-MS-based multiplex profiling of glycoproteins using lectins conjugated to lanthanide-chelating polymers. Journal of proteome research\| PubMed ID: 19072657	2009
Development of mass cytometry methods for bacterial discrimination. Analytical biochemistry\| PubMed ID: 21871432	2011

Michael D. Leipold

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