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Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

We have demonstrated previously that new blood vessel formation induced by angiogenic growth factors in onplants placed on the chorioallantoic membrane (CAM) of the chick embryos is critically dependent on the cleavage of fibrillar collagen by a previously unidentified interstitial collagenase. In the present study we have used a quantitative CAM angiogenesis system to search for and functionally characterize host avian collagenases responsible for the collagen remodeling associated with angiogenesis. Among the matrix metalloproteinases (MMPs) identified in the CAM onplant tissue, the chicken MMP-13 (chMMP-13) was the only enzyme whose induction and expression coincided with the onset of angiogenesis and blood vessel formation. The chMMP-13 cDNA has been cloned and recombinantly expressed. The chMMP-13 protein has been purified, characterized in vitro, and examined in situ in the CAM. MMP-13-positive cells appear in the CAM shortly after angiogenic stimulation and then accumulate in the collagen onplant tissue. Morphologically, the chMMP-13-containing cells appear as hematopoietic cells of monocyte/macrophage lineage. In vitro, the chMMP-13 proenzyme is rapidly and efficiently activated through the urokinase plasminogen activator/plasminogen/plasmin cascade into a collagenase capable of cleaving native but not the (r/r) mutant collagenase-resistant collagen. Surprisingly, nanogram levels of purified chMMP-13 elicit an angiogenic response in the CAM onplants comparable with that induced by the angiogenic growth factors. The chMMP-13-mediated response was efficiently blocked by select protease inhibitors indicating that plasmin-activated chMMP-13 can function as an angiogenic factor in vivo. Altogether, the results of this study extend the physiological role of MMP-13, previously associated with cartilage/bone resorption, to the collagen remodeling involved in the angiogenic cascade.

Collagenolysis-dependent angiogenesis mediated by matrix metalloproteinase-13 (collagenase-3).

Kollagenolyse-abh&#xE4;ngigen Angiogenese durch Matrix-Metalloproteinase-13 (Kollagenase-3) vermittelt.

A quantitative in vivo angiogenesis model employing collagen onplants placed on the chick embryo chorioallantoic membrane (CAM) has been used in this study to assess the spatial and temporal associations between neutrophil-like inflammatory cells, namely chicken heterophils, and the development of new blood vessels. Previously we have demonstrated that monocytes/macrophages infiltrating the onplants were associated with extracellular matrix remodeling and angiogenesis, in particular by delivering MMP-13 collagenase. By introducing chicken gelatinase B (chMMP-9) as a specific marker for heterophils, we now show that the onset and extent of angiogenesis induced by purified growth factors or by human HT-1080 fibrosarcoma cells correlated with the initial influx of chMMP-9-positive heterophils. This early heterophil arrival was followed by the infiltration of monocytes/macrophages and appeared to sustain further blood vessel formation. The disruption of inflammatory cell influx by 2 mechanistically distinct anti-inflammatory drugs, cortisone and ibuprofen, significantly inhibited angiogenesis, indicating a functional involvement of these inflammatory cells in new blood vessel development. A direct addition of isolated heterophils or purified chMMP-9 into the HT-1080 onplants engrafted into cortisone- or ibuprofen-treated embryos reversed the antiangiogenic effects of the drugs. The exogenously added heterophils induced in vivo a further infiltration of endogenous heterophils and monocytes and dramatically rescued the impaired angiogenesis, highlighting the importance of early inflammatory leukocytes in tumor-induced angiogenesis. Moreover, purified heterophils incorporated into onplants lacking growth factors or tumor cells induced angiogenesis in nontreated embryos, further indicating a direct proangiogenic role for neutrophil-like leukocytes.

Proangiogenic role of neutrophil-like inflammatory heterophils during neovascularization induced by growth factors and human tumor cells.

Ein Modell des quantitativen in-vivo-Angiogenese besch&auml;ftigt Kollagen Onplants platziert auf der K&uuml;ken Embryos chorioallantoic Membrane (CAM) wurde in dieser Studie verwendet um die r&auml;umlichen und zeitlichen Zuordnungen zwischen Neutrophilen-wie Entz&uuml;ndungszellen, n&auml;mlich Huhn Heterophils, und die Entwicklung neuer Blutgef&auml;&szlig;e zu bewerten. Zuvor haben wir bewiesen, dass Monozyten/Makrophagen infiltrieren die Onplants Umgestaltung der extrazellul&auml;ren Matrix und Angiogenese, insbesondere zugeordnet wurden durch die Bereitstellung von MMP-13 Collagenase. Durch die Einf&uuml;hrung von Huhn Gelatinase B (ChMMP-9) als spezifische Marker f&uuml;r Heterophils, zeigen wir nun, dass den Beginn und den Umfang der Angiogenese durch gereinigte Wachstumsfaktoren oder HT-1080 Fibrosarkom Humanzellen korreliert mit dem anf&auml;nglichen Zustrom von ChMMP-9-Positive Heterophils induziert. Diese fr&uuml;hen Heterophil Ankunft war folgte die Infiltration von Monozyten/Makrophagen und schien blutgef&auml;&szlig;anordnung weiter aufrecht zu erhalten. Die Unterbrechung der entz&uuml;ndlichen Zelle Zustrom von 2 mechanistisch verschiedene entz&uuml;ndungshemmende Medikamente, Kortison und Ibuprofen, gehemmt deutlich Angiogenese, angibt, eine funktionelle Einbeziehung dieser entz&uuml;ndlichen Zellen in New Blood-Schiff-Entwicklung. Ein Direktzugabe isolierten Heterophils oder gereinigtes ChMMP-9 in der HT-1080 Onplants Abbau in Cortison oder Ibuprofen-behandelten Embryonen umgekehrt die Antiangiogenetische Effekte der Drogen. Die exogen hinzugef&uuml;gt Heterophils in Vivo induziert eine weitere Infiltration des endogenen Heterophils und Monozyten und drastisch die gest&ouml;rte Angiogenese, die Bedeutung des fr&uuml;hen entz&uuml;ndlichen Leukozyten im Tumor-induzierte Angiogenese gerettet. Dar&uuml;ber hinaus induzierte gereinigten Heterophils in Onplants in Ermangelung Wachstumsfaktoren oder Tumorzellen aufgenommen Angiogenesis in unbehandelten Embryonen, weiter, die eine direkte Proangiogenic-Rolle f&uuml;r die Neutrophilen-wie Leukozyten angibt.

Proangiogenic Rolle der Neutrophilen-wie entz&uuml;ndliche Heterophils w&auml;hrend Neovaskularisation induziert durch Wachstumsfaktoren und menschlichen Tumorzellen.

The activity of sunitinib against gastrointestinal stromal tumor seems to be distinct from its antiangiogenic effects.

Die Aktivit&auml;t von Sunitinib gegen Gastrointestinaler Stromatumor scheint seine antiangiogenetische Wirkung unterscheiden.

Adult mammalian testis is a source of pluripotent stem cells. However, the lack of specific surface markers has hampered identification and tracking of the unrecognized subset of germ cells that gives rise to multipotent cells. Although embryonic-like cells can be derived from adult testis cultures after only several weeks in vitro, it is not known whether adult self-renewing spermatogonia in long-term culture can generate such stem cells as well. Here, we show that highly proliferative adult spermatogonial progenitor cells (SPCs) can be efficiently obtained by cultivation on mitotically inactivated testicular feeders containing CD34+ stromal cells. SPCs exhibit testicular repopulating activity in vivo and maintain the ability in long-term culture to give rise to multipotent adult spermatogonial-derived stem cells (MASCs). Furthermore, both SPCs and MASCs express GPR125, an orphan adhesion-type G-protein-coupled receptor. In knock-in mice bearing a GPR125-beta-galactosidase (LacZ) fusion protein under control of the native Gpr125 promoter (GPR125-LacZ), expression in the testis was detected exclusively in spermatogonia and not in differentiated germ cells. Primary GPR125-LacZ SPC lines retained GPR125 expression, underwent clonal expansion, maintained the phenotype of germline stem cells, and reconstituted spermatogenesis in busulphan-treated mice. Long-term cultures of GPR125+ SPCs (GSPCs) also converted into GPR125+ MASC colonies. GPR125+ MASCs generated derivatives of the three germ layers and contributed to chimaeric embryos, with concomitant downregulation of GPR125 during differentiation into GPR125- cells. MASCs also differentiated into contractile cardiac tissue in vitro and formed functional blood vessels in vivo. Molecular bookmarking by GPR125 in the adult mouse and, ultimately, in the human testis could enrich for a population of SPCs for derivation of GPR125+ MASCs, which may be employed for genetic manipulation, tissue regeneration and revascularization of ischaemic organs.

Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.

Erwachsene S&auml;ugetier-Hoden ist eine Quelle von pluripotenten Stammzellen. Jedoch hat der Mangel an spezifischen Oberfl&auml;che Marker behindert, Identifikation und Verfolgung der unbekannte Teilmenge von Keimzellen, die multipotenten Zellen entstehen. Obwohl embryonalen-&auml;hnlichen Zellen von Erwachsenen Hoden Kulturen nach nur einigen Wochen in-vitro abgeleitet werden k&ouml;nnen, ist nicht bekannt, ob Erwachsener selbstverl&auml;ngerndes Spermatogonien in Langzeitkultur solche Stammzellen als auch erzeugen kann. Hier zeigen wir, dass stark proliferativ-Erwachsene Spermatogonien Vorl&auml;uferzellen (SPCs) effizient durch Anbau auf mitotically inaktivierte testikul&auml;re Feeder mit CD34 + Stromale Zellen abgerufen werden k&ouml;nnen. F&ouml;rderzentren zeigen testikul&auml;re repopulating in-vivo und pflegen die F&auml;higkeit in Langzeitkultur zu multipotenten adulten Spermatogonien gewonnenen Stammzellen (MASCs) f&uuml;hren. Dar&uuml;ber hinaus schnelles F&ouml;rderzentren und MASCs GPR125, ein verwaistes Adh&auml;sion-Typ G-Protein-gekoppelter Rezeptor. Knock-in M&auml;usen ein Fusionsprotein GPR125-Beta-Galaktosidase (LacZ) unter Kontrolle des systemeigenen Gpr125 Projekttr&auml;gers (GPR125-LacZ) Lager Ausdruck in den Hoden wurde ausschlie&szlig;lich in Spermatogonien ermittelt und nicht in differenzierte Keimzellen. Prim&auml;rer GPR125-LacZ SPC Linien beibehalten GPR125 Ausdruck, unterzog klonalen Expansion, beibehalten der Ph&auml;notyp der Keimbahn-Stammzellen und rekonstituierten Spermatogenese Busulphan-behandelten M&auml;usen. Langfristige Kulturen der GPR125 + ESZ (GSPCs) auch in GPR125 + MASC Kolonien umgewandelt. GPR125 + MASCs generiert Derivate aus den drei Schichten der Keim und trug zur chimaeric Embryonen, mit begleitenden Heraufregulation des GPR125 w&auml;hrend der Differenzierung in GPR125-Zellen. MASCs auch unterschieden in KONTRAKTILER Herzgewebe in Vitro und bildete funktionale Blutgef&auml;&szlig;e in-vivo. Molekulare bookmarking von GPR125 in der adulten Maus und letztlich in den menschlichen Hoden k&ouml;nnte f&uuml;r eine Bev&ouml;lkerung von F&ouml;rderzentren f&uuml;r Ableitung der GPR125 + MASCs, bereichern die Genmanipulation, Geweberegeneration und Revascularization isch&auml;mische Organe eingesetzt werden kann.

Generation von funktionalen multipotenten adulten Stammzellen aus GPR125 + Germline Vorl&auml;uferzellen.

The undifferentiated spermatogonia of adult mouse testes are composed of both true stem cells and committed progenitors. It is unclear what normally prevents these adult germ cells from manifesting multipotency. The critical elements of the spermatogonial stem cell niche, while poorly understood, are thought to be composed of Sertoli cells with several other somatic cell types in close proximity. We recently discovered a novel orphan G-protein coupled receptor (GPR125) that is restricted to undifferentiated spermatogonia within the testis. GPR125 expression was maintained when the progenitor cells were extracted from the in vivo niche and propagated under growth conditions that recapitulate key elements of the niche. Such conditions preserved the ability of the cells to generate multipotent derivatives, known as multipotent adult spermatogonial derived progenitor cells (MASCs). Upon differentiation, the latter produced a variety tissues including functional endothelium, illustrating the potential applications of such cells. Thus, GPR125 represents a novel target for purifying adult stem and progenitors from tissues, with the goal of developing autologous multipotent cell lines.

Niche players: spermatogonial progenitors marked by GPR125.

Die undifferenzierten Spermatogonien der adulten Maus Hoden bestehen beide wahre Stammzellen und Vorl&auml;uferzellen begangen. Es ist unklar, was normalerweise diese Erwachsenen Keimzellen verhindert Multipotenz manifestieren. Die kritischen Elemente der Spermatogonien Stammzelle Nische, sind zwar oft missverstanden, Gedanken, Sertoli-Zellen mit mehreren anderen somatischen Zellen in der N&auml;he bestehen. K&uuml;rzlich entdeckten wir eine neuartige Waise, G-Protein-Rezeptor (GPR125) gekoppelt, die auf undifferenzierte Spermatogonien innerhalb der Hoden beschr&auml;nkt ist. GPR125 Ausdruck wurde beibehalten, wenn die Vorl&auml;uferzellen wurden aus der in-vivo-Nische extrahiert und propagiert unter Wachstumsbedingungen, die Schl&uuml;sselelemente der Nische zu rekapitulieren. Solche Bedingungen erhalten die F&auml;higkeit der Zellen, multipotenten Derivate, bekannt als multipotenten Erwachsenen Spermatogonien abgeleiteten Vorl&auml;uferzellen (MASCs) zu generieren. Auf Differenzierung produziert letzterer eine Vielzahl Gewebe einschlie&szlig;lich funktionale Endothel, zur Veranschaulichung der m&ouml;glichen Anwendungen solcher Zellen. Daher steht der GPR125 ein Roman vorbei zur Reinigung von Erwachsenen Stamm- und Vorl&auml;uferzellen von Geweben, mit dem Ziel der Entwicklung von autologen multipotenten Zelllinien.

Nischen-Spieler: Spermatogonien Vorfahre von GPR125 gepr&auml;gt.

Small numbers of proangiogenic bone marrow-derived cells (BMDCs) can play pivotal roles in tumor progression. In this issue of Cancer Cell, two papers, utilizing different tumor angiogenesis models, both find that activated MMP-9 delivered by BMDCs modulates neovessel remodeling, thereby promoting tumor growth. The changes in microvascular anatomy induced by MMP-9-expressing BMDCs are strikingly different between the preirradiated tumor vascular bed model employed by Ahn and Brown and the invasive glioblastoma model utilized by Du et al., likely mirroring the complexity of the real tumor microenvironment and the intricacy of roles of different BMDC populations in mediating tumor neoangiogenesis.

A catalytic role for proangiogenic marrow-derived cells in tumor neovascularization.

Eine kleine Gruppe Proangiogenic Knochenmark gewonnenen Zellen (BMDCs) k&ouml;nnen im Tumor Fortschreiten entscheidende Rollen spielen. In dieser Ausgabe der Krebszelle, zwei Papiere, unter Verwendung verschiedener Tumor Angiogenesis Modelle moduliert beide suchen, die MMP-9 geliefert von BMDCs aktiviert Neovessel Umbau, so f&ouml;rdern Tumorwachstum. Die &Auml;nderungen in mikrovaskul&auml;re Anatomie von MMP-9-Ausdruck BMDCs induziert unterscheiden sich auffallend zwischen die preirradiated Tumor vaskul&auml;re Bett von Ahn und Brown besch&auml;ftigt und dem invasiven Glioblastom Modell von Du Et Al., wahrscheinlich spiegeln die Komplexit&auml;t der realen Tumor-Untersuchungsverfahren und die Kompliziertheit der Rollen der verschiedenen Populationen der BMDC bei der Vermittlung von Tumor-Neoangiogenesis genutzt.

Als Katalysator f&uuml;r Proangiogenic Knochenmark gewonnenen Zellen im Tumor Neovaskularisation.

Stem cells reside in specialized microenvironments created by supporting stromal cells that orchestrate self-renewal and lineage-specific differentiation. However, the precise identity of the cellular and molecular pathways that support self-renewal of stem cells is not known. For example, long-term culture of prototypical stem cells, such as adult spermatogonial stem and progenitor cells (SPCs), in vitro has been impeded by the lack of an optimal stromal cell line that initiates and sustains proliferation of these cells. Indeed, current methods, including the use of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), have not been efficient and have generally led to inconsistent results. Here, we report the establishment of a novel CD34-positive cell line, referred to as JK1, derived from mouse testicular stromal cells that not only facilitated long-term SPC culture but also allowed faithful generation of SPCs and multipotent stem cells. SPCs generated on JK1 maintained key features of germ line stem cells, including expression of PLZF, DAZL, and GCNA. Furthermore, these feeders also promoted the long-term cultivation of other types of primitive cells including multipotent adult spermatogonial-derived stem cells, pluripotent murine embryonic stem cells, and embryonic germ cells derived from primordial germ cells. Stem cells could be passaged serially and still maintained expression of characteristic markers such as OCT4 and NANOG in vitro, as well as the ability to generate all three germ layers in vivo. These results indicate that the JK1 cell line is capable of promoting long-term culture of primitive cells. As such, this cell line allows for identification of stromal-derived factors that support long-term proliferation of various types of stem cells and constitutes a convenient alternative to other types of feeder layers. Disclosure of potential conflicts of interest is found at the end of this article.

CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.

Stammzellen befinden sich in spezialisierte Mikroumgebungen erstellt durch die Unterst&uuml;tzung von stromal Zellen, die Selbsterneuerung und Herkunfts-spezifische Differenzierung zu orchestrieren. Die genaue Identit&auml;t der zellul&auml;ren und molekularen Bahnen, die Selbsterneuerung von Stammzellen zu unterst&uuml;tzen ist jedoch nicht bekannt. Beispielsweise hat die Langzeitkultur prototypische Stammzellen, wie Erwachsene Stamm- und Vorl&auml;uferzellen Spermatogonien (SPCs), in-vitro-durch das Fehlen einer optimalen stromal Zelle-Linie behindert wurde, die initiiert und Vermehrung dieser Zellen tr&auml;gt. In der Tat aktuelle Methoden, einschlie&szlig;lich der Verwendung von M&auml;useembryonalen (MEFs), wurden nicht effizient und im Allgemeinen zu inkonsistenten Ergebnissen gef&uuml;hrt haben. Hier berichten wir &uuml;ber die Schaffung einer neuartigen CD34-positiven-Zelllinie, genannt JK1, abgeleitet von Maus testikul&auml;re stromal Zellen, die nicht nur SPC Langzeitkultur erleichtert aber auch treu Generation von F&ouml;rderzentren und multipotenten Stammzellen erlaubt. Erstellt am JK1 F&ouml;rderzentren gepflegt Key Features von Keim Linie Stammzellen, einschlie&szlig;lich Ausdruck PLZF DAZL und GCNA. Dar&uuml;ber hinaus f&ouml;rderte diese Feeder auch den langfristigen Anbau von anderen Arten von primitiven Zellen multipotenten adulten Spermatogonien gewonnenen Stammzellen Pluripotent murinen embryonalen Stammzellen und embryonalen Keimzellen von primordialen Keimzellen abgeleitet. Stammzellen k&ouml;nnten seriell und noch gepflegt Ausdruck des charakteristischen Marker wie OCT4 und NANOG in-vitro-, sowie die M&ouml;glichkeit, alle drei Keim-Schichten, die in-vivo generieren passaged werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die JK1-Zelllinie langfristige Kultur der primitiven Zellen f&ouml;rdern kann. So diese Zelllinie erm&ouml;glicht die Identifizierung der stromal abgeleiteten Faktoren, die langfristige Verbreitung der verschiedenen Arten von Stammzellen zu unterst&uuml;tzen und stellt eine bequeme Alternative zu anderen Arten von Zubringer-Schichten. Offenlegung von m&ouml;glichen Interessenkonflikten findet sich am Ende dieses Artikels.

CD34 + Hoden Stromale Zellen unterst&uuml;tzen langfristige Ausbau der embryonalen und adulten Stammzellen und Vorl&auml;uferzellen Zellen.

Vascular cells contribute to organogenesis and tumorigenesis by producing unknown factors. Primary endothelial cells (PECs) provide an instructive platform for identifying factors that support stem cell and tumor homeostasis. However, long-term maintenance of PECs requires stimulation with cytokines and serum, resulting in loss of their angiogenic properties. To circumvent this hurdle, we have discovered that the adenoviral E4ORF1 gene product maintains long-term survival and facilitates organ-specific purification of PECs, while preserving their vascular repertoire for months, in serum/cytokine-free cultures. Lentiviral introduction of E4ORF1 into human PECs (E4ORF1(+) ECs) increased the long-term survival of these cells in serum/cytokine-free conditions, while preserving their in vivo angiogenic potential for tubulogenesis and sprouting. Although E4ORF1, in the absence of mitogenic signals, does not induce proliferation of ECs, stimulation with VEGF-A and/or FGF-2 induced expansion of E4ORF1(+) ECs in a contact-inhibited manner. Indeed, VEGF-A-induced phospho MAPK activation of E4ORF1(+) ECs is comparable with that of naive PECs, suggesting that the VEGF receptors remain functional upon E4ORF1 introduction. E4ORF1(+) ECs inoculated in implanted Matrigel plugs formed functional, patent, humanized microvessels that connected to the murine circulation. E4ORF1(+) ECs also incorporated into neo-vessels of human tumor xenotransplants and supported serum/cytokine-free expansion of leukemic and embryonal carcinoma cells. E4ORF1 augments survival of PECs in part by maintaining FGF-2/FGF-R1 signaling and through tonic Ser-473 phosphorylation of Akt, thereby activating the mTOR and NF-kappaB pathways. Therefore, E4ORF1(+) ECs establish an Akt-dependent durable vascular niche not only for expanding stem and tumor cells but also for interrogating the roles of vascular cells in regulating organ-specific vascularization and tumor neo-angiogenesis.

Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene.

Vaskul&auml;re Zellen tragen zur Organogenese und Tumorentstehung durch die Herstellung von unbekannter Faktoren. Prim&auml;re Endothelzellen (PECs) bieten eine lehrreiche Plattform zur Identifizierung von Faktoren, die Stammzellen und Tumor-Hom&ouml;ostase zu unterst&uuml;tzen. Allerdings erfordert langfristige Wartung von PECs Stimulation mit Zytokinen und Serum, die zum Verlust ihrer Angiogenese-Eigenschaften. Um diese H&uuml;rde zu umgehen, haben wir entdeckt, dass die adenoviral E4ORF1 Genprodukt langfristiges &Uuml;berleben unterh&auml;lt und organspezifischen Reinigung von PECs, unter Beibehaltung der vaskul&auml;re Repertoire monatelang in Serum/Zytokin-freie Kulturen erleichtert. Lentivirale Einf&uuml;hrung von E4ORF1 in menschlichen PECs (E4ORF1(+) ECs) erh&ouml;ht das langfristige &Uuml;berleben dieser Zellen in Serum/Zytokin-freien Bedingungen, unter Wahrung ihrer in-vivo-angiogenen potential f&uuml;r Tubulogenesis und sprie&szlig;en. Obwohl E4ORF1, in Ermangelung von mitogenen Signale, nicht Verbreitung von ECs, Stimulation mit VEGF-A induzieren und/oder FGF-2 Erweiterung des E4ORF1(+) ECs in gewissem Sinne Kontakt-gehemmt induzierte. VEGF-A-induzierte Phospho MAPK Aktivierung des E4ORF1(+) ECs ist vergleichbar mit der naiven PECs, was darauf hindeutet, dass die VEGF-Rezeptoren funktionieren auf E4ORF1 Einf&uuml;hrung weiterhin. E4ORF1(+) ECs verimpft in implantierten Matrigel Stecker gebildet funktionell, patent, humanisierte Microvessels, die mit den murinen Kreislauf verbunden. E4ORF1(+) ECs auch Neo-Gef&auml;&szlig;e des menschlichen Tumor Xenotransplantate einverleibt und Serum/Zytokin-freie Ausbreitung einer leuk&auml;mischen und embryonal Karzinom-Zellen gef&ouml;rdert. E4ORF1 erweitert &Uuml;berleben von PECs teilweise durch die Aufrechterhaltung der FGF-2/FGF-R1 zu signalisieren und durch tonische Ser-473 Phosphorylierung von Akt, dadurch Aktivierung des mTOR und NF-KappaB Wege. Deshalb einrichten E4ORF1(+) ECs eine Akt-abh&auml;ngige haltbare gef&Atilde; &curren; Nische nicht nur f&uuml;r den Ausbau der Stamm- und Tumor-Zellen, sondern auch f&uuml;r die Abfrage der Rollen von vaskul&auml;ren Zellen bei der Regulierung der organspezifischen Vaskularisierung und Tumor Neo-Angiogenese.

Generation eine funktionale und langlebige gef&Atilde; &curren; Nische adenoviral E4ORF1 gen.

Previous efforts to differentiate human embryonic stem cells (hESCs) into endothelial cells have not achieved sustained expansion and stability of vascular cells. To define vasculogenic developmental pathways and enhance differentiation, we used an endothelial cell-specific VE-cadherin promoter driving green fluorescent protein (GFP) (hVPr-GFP) to screen for factors that promote vascular commitment. In phase 1 of our method, inhibition of transforming growth factor (TGF)beta at day 7 of differentiation increases hVPr-GFP(+) cells by tenfold. In phase 2, TGFbeta inhibition maintains the proliferation and vascular identity of purified endothelial cells, resulting in a net 36-fold expansion of endothelial cells in homogenous monolayers, which exhibited a transcriptional profile of Id1(high)VEGFR2(high)VE-cadherin(+) ephrinB2(+). Using an Id1-YFP hESC reporter line, we showed that TGFbeta inhibition sustains Id1 expression in hESC-derived endothelial cells and that Id1 is required for increased proliferation and preservation of endothelial cell commitment. Our approach provides a serum-free method for differentiation and long-term maintenance of hESC-derived endothelial cells at a scale relevant to clinical application.

Expansion and maintenance of human embryonic stem cell-derived endothelial cells by TGFbeta inhibition is Id1 dependent.

Fr&uuml;here Bem&uuml;hungen, menschlichen embryonalen Stammzellen (Zellkulturen) in Endothelzellen zu unterscheiden haben nicht nachhaltige Expansion und Stabilit&auml;t der vaskul&auml;ren Zellen erreicht. Um Vasculogenic entwicklungsbedingte Bahnen zu definieren und Differenzierung zu verbessern, haben wir eine endotheliale zellspezifische VE-Cadherin Projekttr&auml;ger fahren gr&uuml;nes fluoreszierendes Protein (GFP) (hVPr-GFP) Sie auf die Faktoren, die vaskul&auml;re Engagement f&ouml;rdern verwendet. In der ersten Phase unserer Methode erh&ouml;ht sich hVPr-GFP(+) Zellen durch Hemmung der transforming-Growth-Factor (TGF) Beta bei Tag 7 der Differenzierung verzehnfacht. In Phase 2, TGFbeta Hemmung der Proliferation und vaskul&auml;re Identit&auml;t des gereinigten Endothelzellen, wodurch eine net 36-fold Expansion der Endothelzellen in homogenen Monolayers unterh&auml;lt ausgestellt die transkriptionelle Profil von Id1(high)VEGFR2(high)VE-cadherin(+)-ephrinB2(+). &Uuml;ber eine Id1-YFP hESC-Reporter-Leitung, zeigten wir, dass TGFbeta Hemmung Id1 Ausdruck in Endothelzellen hESC abgeleitete zugezogen und Id1 f&uuml;r die Verbreitung und Erhaltung der endothelial Zelle Engagement erforderlich ist. Unser Ansatz stellt eine serumfreie Methode f&uuml;r Differenzierung und langfristige Erhaltung der hESC-abgeleitet von Endothelzellen im Ma&szlig;stab f&uuml;r klinische Anwendung.

Erweiterung und Wartung von menschlichen embryonalen Stammzellen Cell-derived Endothelzellen durch TGFbeta-Hemmung ist Id1 abh&auml;ngig.

Bone marrow endothelial cells (ECs) are essential for reconstitution of hematopoiesis, but their role in self-renewal of long-term hematopoietic stem cells (LT-HSCs) is unknown. We have developed angiogenic models to demonstrate that EC-derived angiocrine growth factors support in vitro self-renewal and in vivo repopulation of authentic LT-HSCs. In serum/cytokine-free cocultures, ECs, through direct cellular contact, stimulated incremental expansion of repopulating CD34(-)Flt3(-)cKit(+)Lineage(-)Sca1(+) LT-HSCs, which retained their self-renewal ability, as determined by single-cell and serial transplantation assays. Angiocrine expression of Notch ligands by ECs promoted proliferation and prevented exhaustion of LT-HSCs derived from wild-type, but not Notch1/Notch2-deficient, mice. In transgenic notch-reporter (TNR.Gfp) mice, regenerating TNR.Gfp(+) LT-HSCs were detected in cellular contact with sinusoidal ECs. Interference with angiocrine, but not perfusion, function of SECs impaired repopulation of TNR.Gfp(+) LT-HSCs. ECs establish an instructive vascular niche for clinical-scale expansion of LT-HSCs and a cellular platform to identify stem cell-active trophogens.

Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells.

Knochenmark Endothelzellen (ECs) sind wesentliche Neubildung der Blutbildung, aber ihre Rolle in der Selbsterneuerung von langfristigen hematopoietic Stammzellen (LT-HSCs) ist unbekannt. Wir entwickelten Angiogenese-Modelle, die zeigen, dass die EG-abgeleitete Angiocrine Wachstumsfaktoren in-vitro-Selbsterneuerung und in-vivo Neuauff&uuml;llung des authentischen LT-HSCs unterst&uuml;tzen. In/Cytokine serumfreie Kokulturen befl&uuml;gelt ECs, durch zellul&auml;re Directo, inkrementelle Erweiterung des repopulating CD34(-)Flt3(-)cKit(+)Lineage(-)Sca1(+) LT-HSCs, die ihre Selbsterneuerung F&auml;higkeit, festgelegt durch einzellige und serielle Transplantation Proben aufbewahrt. Angiocrine Expression von Notch-Liganden von ECs Verbreitung gef&ouml;rdert und verhindert Ersch&ouml;pfung der LT-HSCs von Wild-Typ, aber nicht Notch1/Notch2-defizienten, M&auml;usen abgeleitet. In transgenen Kerbe-Reporter (TNR.GFP) M&auml;use, regenerierende TNR.GFP(+) LT-HSCs wurden bei zellul&auml;ren Kontakt mit sinusf&ouml;rmigen ECs festgestellt. Interferenzen mit Angiocrine, aber nicht &uuml;bergie&szlig;en, beeintr&auml;chtigte Funktion der SECs Neuauff&uuml;llung des TNR.GFP(+) LT-HSCs. ECs schaffen eine lehrreiche vaskul&auml;re Nische f&uuml;r klinische operierenden Ausbau der LT-HSCs und eine zellul&auml;re Plattform Stammzell-aktive Trophogens zu identifizieren.

Endothelzellen sind essentiell f&uuml;r die Selbsterneuerung und Auff&uuml;llen des Notch-abh&auml;ngige hematopoietic Stammzellen.

Hyperactivity of mTORC1, a key mediator of cell growth, leads to stem cell depletion, although the underlying mechanisms are poorly defined. Using spermatogonial progenitor cells (SPCs) as a model system, we show that mTORC1 impairs stem cell maintenance by a negative feedback from mTORC1 to receptors required to transduce niche-derived signals. We find that SPCs lacking Plzf, a transcription factor essential for SPC maintenance, have enhanced mTORC1 activity. Aberrant mTORC1 activation in Plzf(-/-) SPCs inhibits their response to GDNF, a growth factor critical for SPC self-renewal, via negative feedback at the level of the GDNF receptor. Plzf opposes mTORC1 activity by inducing expression of the mTORC1 inhibitor Redd1. Thus, we identify the mTORC1-Plzf functional interaction as a critical rheostat for maintenance of the spermatogonial pool and propose a model whereby negative feedback from mTORC1 to the GDNF receptor balances SPC growth with self-renewal.

Plzf regulates germline progenitor self-renewal by opposing mTORC1.

Hyperaktivit&auml;t der mTORC1, ein wichtiger Vermittler von Zellwachstum, f&uuml;hrt zu Stammzellen Ersch&ouml;pfung, obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen schlecht definiert sind. Anhand Spermatogonien Vorl&auml;uferzellen (SPCs) als Modellsystem zeigen wir, dass diese mTORC1 Stammzell-Wartung durch ein negatives Feedback von mTORC1 an Rezeptoren ben&ouml;tigt, um die Nische abgeleitete Signale zur&uuml;ckwirken beeintr&auml;chtigt. Wir finden, die ESZ fehlt Plzf, einen Transkriptionsfaktor f&uuml;r SPC-Wartung, mTORC1 Aktivit&auml;t verbessert haben. Aberrant mTORC1 Aktivierung in Plzf(-/-) F&ouml;rderzentren hemmt ihre Reaktion auf GDNF, als Wachstumsfaktor f&uuml;r SPC Selbsterneuerung, &uuml;ber negatives Feedback auf der Ebene des Rezeptors GDNF entscheidend. Plzf gegen mTORC1 Aktivit&auml;t durch Ausdruck der mTORC1-Inhibitor Redd1 induzieren. So wir identifizieren die mTORC1-Plzf funktionelle Interaktion als eine kritische Rheostat f&uuml;r die Wartung der Spermatogonien Pool und schlagen ein Modell, wobei Negative R&uuml;ckkopplung von mTORC1 an den Rezeptor GDNF SPC Wachstum mit Selbsterneuerung gleicht.

Plzf regelt Germline Stammvater Selbsterneuerung abzielende mTORC1.

Reproductive biology: In vitro sperm maturation.

Reproduktionsbiologie: In-vitro Spermien Reifung.

The transcription factor Sox2 maintains the pluripotency of early embryonic cells and regulates the formation of several epithelia during fetal development. Whether Sox2 continues to play a role in adult tissues remains largely unknown. We show here that Sox2 marks adult cells in several epithelial tissues where its expression has not previously been characterized, including the stomach, cervix, anus, testes, lens, and multiple glands. Genetic lineage tracing and transplantation experiments demonstrate that Sox2-expressing cells continuously give rise to mature cell types within these tissues, documenting their self-renewal and differentiation potentials. Consistent with these findings, ablation of Sox2(+) cells in mice results in a disruption of epithelial tissue homeostasis and lethality. Developmental fate mapping reveals that Sox2(+) adult stem cells originate from fetal Sox2(+) tissue progenitors. Thus, our results identify Sox2 expression in numerous adult endodermal and ectodermal stem cell compartments, which are critical for normal tissue regeneration and survival.

Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.

Der Transkriptionsfaktor Sox2 unterh&auml;lt die Pluripotenz der fr&uuml;hen embryonalen Zellen und reguliert die Bildung von mehreren Epithelien w&auml;hrend der fetalen Entwicklung. Ob Sox2 weiterhin eine Rolle im Gewebe Erwachsener ist weitgehend unbekannt. Wir zeigen hier, dass Sox2 adulten Zellen in mehrere epitheliale Gewebe markiert wo seinen Ausdruck nicht zuvor, einschlie&szlig;lich Magen, Geb&auml;rmutterhals, Anus, Hoden, Objektiv und mehrere Dr&uuml;sen charakterisiert worden ist. Genetische Abstammung Ablaufverfolgung und Transplantation Experimente zeigen, dass Sox2 Ausdr&uuml;cken Zellen ununterbrochen Anlass zu Zelltypen in diesen Geweben, dokumentieren ihre Selbsterneuerung und Differenzierung Potentiale &auml;ltere geben. Im Einklang mit diesen Erkenntnissen, f&uuml;hrt eine St&ouml;rung der Hom&ouml;ostase Epithelgewebe und Letalit&auml;t Ablation von Sox2(+) Zellen in M&auml;usen. Entwicklungsbiologie Schicksal Zuordnung zeigt, dass die fetale Sox2(+) Gewebe Vorfahre Sox2(+) adulter Stammzellen stammen. So identifizieren unsere Ergebnisse Sox2 Ausdruck in zahlreichen adulte Stammzelle von endodermalen und ektodermale F&auml;cher, die f&uuml;r normale Geweberegeneration und &Uuml;berleben von entscheidender Bedeutung sind.

Article	Year
Collagenolysis-dependent angiogenesis mediated by matrix metalloproteinase-13 (collagenase-3). The Journal of biological chemistry\| PubMed ID: 15066996	2004
Proangiogenic role of neutrophil-like inflammatory heterophils during neovascularization induced by growth factors and human tumor cells. Blood\| PubMed ID: 16174763	2006
The activity of sunitinib against gastrointestinal stromal tumor seems to be distinct from its antiangiogenic effects. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research\| PubMed ID: 17062698	2006
Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature\| PubMed ID: 17882221	2007
Niche players: spermatogonial progenitors marked by GPR125. Cell cycle (Georgetown, Tex.)\| PubMed ID: 18256534	2008
A catalytic role for proangiogenic marrow-derived cells in tumor neovascularization. Cancer cell\| PubMed ID: 18328420	2008
CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells. Stem cells (Dayton, Ohio)\| PubMed ID: 18669907	2008
Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 19036927	2008
Expansion and maintenance of human embryonic stem cell-derived endothelial cells by TGFbeta inhibition is Id1 dependent. Nature biotechnology\| PubMed ID: 20081865	2010
Endothelial cells are essential for the self-renewal and repopulation of Notch-dependent hematopoietic stem cells. Cell stem cell\| PubMed ID: 20207228	2010
Plzf regulates germline progenitor self-renewal by opposing mTORC1. Cell\| PubMed ID: 20691905	2010
Reproductive biology: In vitro sperm maturation. Nature\| PubMed ID: 21430767	2011
Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice. Cell stem cell\| PubMed ID: 21982232	2011

Marco Seandel

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