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Visualizing Single Molecular Complexes <em>In Vivo</em> Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

We looked for a feedback system in Escherichia coli that might sense the rotational bias of flagellar motors and regulate the activity of the chemotaxis receptor kinase. Our search was based on the assumption that any machinery that senses rotational bias will be perturbed if flagellar rotation stops. We monitored the activity of the kinase in swimming cells by bioluminescence resonance energy transfer (BRET) between Renilla luciferase fused to the phosphatase, CheZ, and yellow fluorescent protein fused to the response regulator, CheY. Then we jammed the flagellar motors by adding an antifilament antibody that crosslinks adjacent filaments in flagellar bundles. At steady state, the rate of phosphorylation of CheY is equal to the rate of dephosphorylation of CheY-P, which is proportional to the degree of association between CheZ and CheY-P, the quantity sensed by BRET. No changes were observed, even upon addition of an amount of antibody that stopped the swimming of >95% of cells within a few seconds. So, the kinase does not appear to be sensitive to motor output. The BRET technique is complementary to one based on FRET, described previously. Its reliability was confirmed by measurements of the response of cells to the addition of attractants.

Monitoring bacterial chemotaxis by using bioluminescence resonance energy transfer: absence of feedback from the flagellar motors.

Wir suchten ein Feedbacksystem in Escherichia coli, die m&ouml;glicherweise sp&uuml;ren die rotatorische Verschiebung des Flimmerband Motoren und regulieren die Aktivit&auml;t der Chemotaxis-Rezeptor-Kinase. Unsere Suche basierte auf der Annahme, dass alle Maschinen, die rotatorischen Voreingenommenheit sp&uuml;rt gest&ouml;rt, wenn Flimmerband Drehung beendet werden. Wir &uuml;berwachten die Aktivit&auml;t der Kinase in Zellen von Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) schwimmen zwischen Renilla-Luciferase verschmolzen, die Phosphatase, CheZ, und gelb fluoreszierendes Protein zu der Antwort-Regler, CheY verschmolzen. Das gestaute wir dann der Flimmerband Motors durch Hinzuf&uuml;gen von einem antifilament Antik&ouml;rper, dass Querverbindungen angrenzenden Filamente in Flimmerband b&uuml;ndeln. Bei Steady-State, die Phosphorylierung von CheY liegt gleich um die Rate der Dephosphorylierung von CheY-P, die proportional zum Grad der Assoziation ist CheZ und CheY-P, die Menge von BRET sp&uuml;rte. Keine &Auml;nderungen wurden beobachtet, n&auml;mlich auf einer Menge von Antik&ouml;rpern, die das Schwimmen von gestoppt &gt; 95 % der Zellen innerhalb weniger Sekunden. Also scheint das Kinase nicht empfindlich auf Motorleistung. Die BRET-Technik ist eine Erg&auml;nzung zu einer FRET, zuvor beschriebenen. Seine Zuverl&auml;ssigkeit best&auml;tigte Messungen &uuml;ber die Reaktion der Zellen auf den Zusatz von Lockstoffe.

&Uuml;berwachung der bakteriellen Chemotaxis mithilfe von Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer: mangelnde Feedback von der Flimmerband Motoren.

Many cellular activities are driven by complex protein machines. By measuring the behaviour of fluorescent protein fusions in real time in living cells it has become apparent that many of these complexes are not fixed, but are dynamic. To some extent this might be expected, for example, for cell division complexes, as defining mid-cell is linked to growth and cell cycle, but perhaps comes as more of a surprise with a complex anchored machine like the bacterial flagellar motor. The assumption has been that once made it remains intact. However, the dynamics of this structure is strongly supported in two manuscripts in this issue of Molecular Microbiology. The stator units which form a peptioglycan anchored ring around the rotor, generating torque in response to the ion motive force, clearly disengage when conditions change. The driving ion is shown to be important in both engagement of the stator to the rotor and the selection of the type of stator unit. These new results provide an insight into the mechanisms underlying motor function, which might rely on dynamic processes, and clearly illustrate the need to move away from a static view of cellular structures.

Parts exchange: tuning the flagellar motor to fit the conditions.

Viele zellul&auml;re Aktivit&auml;ten werden durch komplexe Protein Maschinen angetrieben. Durch Messung des Verhaltens von fluoreszierenden Proteins Fusionen in Echtzeit in lebenden Zellen ist deutlich geworden, dass viele dieser komplexe sind nicht festgelegt, sondern sind dynamisch. In gewisser Weise k&ouml;nnte dies, z. B. f&uuml;r Zellteilung-komplexe, rechnen wie definierenden Mid-cell an Wachstum und Zellzyklus kn&uuml;pft, aber vielleicht mehr als eine &Uuml;berraschung mit einer komplexen verankerten Maschine wie der bakteriellen Flimmerband Motor kommt. Die Annahme war, dass wenn es intakt bleibt. Die Dynamik dieser Struktur ist jedoch stark in zwei Handschriften in dieser Ausgabe von Molekulare Mikrobiologie unterst&uuml;tzt. Die Stator-Einheiten bilden einen Peptioglycan verankert-Ring um den Rotor, Generieren von Drehmoment als Reaktion auf die Ion-Motor abzuziehen klar wenn sich Bedingungen &auml;ndern. Das treibende Ion zeigt in beiden Engagement des Stators am Rotor und die Auswahl des Typs der Statoreinheit wichtig sein. Diese neuen Ergebnisse geben einen Einblick in die Mechanismen Motorik, die m&ouml;glicherweise auf dynamische Prozesse verlassen, und verdeutlichen die Notwendigkeit, sich von eine statische Ansicht von Zellstrukturen.

Austausch-Teile: Optimierung des Flimmerband Motors an die Bedingungen angepasst.

Most biological processes are performed by multiprotein complexes. Traditionally described as static entities, evidence is now emerging that their components can be highly dynamic, exchanging constantly with cellular pools. The bacterial flagellar motor contains approximately 13 different proteins and provides an ideal system to study functional molecular complexes. It is powered by transmembrane ion flux through a ring of stator complexes that push on a central rotor. The Escherichia coli motor switches direction stochastically in response to binding of the response regulator CheY to the rotor switch component FliM. Much is known of the static motor structure, but we are just beginning to understand the dynamics of its individual components. Here we measure the stoichiometry and turnover of FliM in functioning flagellar motors, by using high-resolution fluorescence microscopy of E. coli expressing genomically encoded YPet derivatives of FliM at physiological levels. We show that the approximately 30 FliM molecules per motor exist in two discrete populations, one tightly associated with the motor and the other undergoing stochastic turnover. This turnover of FliM molecules depends on the presence of active CheY, suggesting a potential role in the process of motor switching. In many ways the bacterial flagellar motor is as an archetype macromolecular assembly, and our results may have further implications for the functional relevance of protein turnover in other large molecular complexes.

Signal-dependent turnover of the bacterial flagellar switch protein FliM.

Die meisten biologischen Prozesse werden von multiprotein komplexe ausgef&uuml;hrt. Traditionell als statische Entit&auml;ten beschrieben, entsteht Beweise jetzt, dass ihre Komponenten hochdynamische, Austausch von st&auml;ndig mit zellul&auml;ren Pools sein k&ouml;nnen. Bakterielle Flimmerband Motor enth&auml;lt ca. 13 verschiedene Proteine und stellt ein ideales System, um funktionelle molekulare Komplexe zu studieren. Es ist powered by Transmembran Ionen-Fluss durch einen Ring von Stator-komplexe, die auf einem zentralen Rotor schieben. Der Escherichia-coli-Motor schaltet Richtung an die Rotor-Switch-Komponente FliM stochastisch als Reaktion auf die Bindung des Reglers Antwort CheY. Der statische motor Struktur ist wenig bekannt, aber wir stehen erst am Anfang, die Dynamik seiner einzelnen Komponenten zu verstehen. Hier messen wir die St&ouml;chiometrie und Umsatz von FliM in funktionierende Flimmerband Motoren, mit hochaufl&ouml;sende Fluoreszenzmikroskopie von E. Coli genomically codierten YPet Derivate flim auf physiologischer Ebene zum Ausdruck zu bringen. Wir zeigen, dass die etwa 30 FliM-Molek&uuml;le pro Motor in zwei getrennte Populationen, einer eng verbunden mit dem Motor und der andere eine stochastische Umsatz vorhanden. Dieser Umsatz von FliM Molek&uuml;le h&auml;ngt das Vorhandensein von aktiven CheY, was auf eine m&ouml;gliche Rolle im Prozess motor wechseln. Der bakterielle Flimmerband Motor ist in vielerlei Hinsicht als Archetyp Makromolekulare Assembly, und unsere Ergebnisse m&ouml;glicherweise weitere Auswirkungen auf die funktionelle Relevanz der Protein-Umsatz in andere gro&szlig;e molekulare Komplexe.

Signal-abh&auml;ngige Umsatz von der bakteriellen Flimmerband wechseln Protein FliM.

Die Proteine, aus denen die bakterielle Flimmerband Rotary motor wurden vor kurzem gezeigt, dynamischer als bisher angenommen, mit einige wichtige Proteine, die Austausch mit Pools Proteine in der Membran/Zytoplasma zu sein. Ist auch klar geworden, da&szlig; neben einfach als Reaktion auf chemosensory Signale schalten, die Drehrichtung des bakteriellen Flimmerband Motors verlangsamt oder gestoppt werden kann, signalisiert mit einer Kupplung oder Bremse, vom Stoffwechsel und Wachstum Zustand.

Protein-Dynamik und Mechanismen, die Steuerung des rotatorischen Verhaltens des bakteriellen Flimmerband Motors.

The proteins that make up the bacterial flagellar rotary motor have recently been shown to be more dynamic than previously thought, with some key proteins exchanging with pools of proteins in the membrane/cytoplasm. It has also become clear that in addition to simply switching in response to chemosensory signals, the rotation of the bacterial flagellar motor can be slowed or stopped, using a clutch or a brake, by signals from metabolism and growth state.

Article	Year
Monitoring bacterial chemotaxis by using bioluminescence resonance energy transfer: absence of feedback from the flagellar motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 16452163	2006
Parts exchange: tuning the flagellar motor to fit the conditions. Molecular microbiology\| PubMed ID: 19170878	2009
Signal-dependent turnover of the bacterial flagellar switch protein FliM. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America\| PubMed ID: 20498085	2010
Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current opinion in microbiology\| PubMed ID: 21955888	2011

Nicolas Delalez

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