使用聚焦离子束扫描电子显微镜数据对薄亚细胞神经元结构进行 3D 重建和分析

Summary

一种灵活的方法学管道，使用用户友好的开源软件包来识别、可视化和量化聚焦离子束扫描电子显微镜图像体积内的薄亚细胞神经元过程。

Abstract

扫描电子显微镜技术的最新进展现在允许对超薄亚细胞过程进行快速三维 （3D） 分析。在这里，提出了一种方法学管道来识别、可视化和分析薄神经元过程，例如投射到其他神经元突触前钮扣（称为"棘"）中的过程。使用免费提供的软件包，该协议演示了如何使用决策树使用聚焦离子束扫描电子显微镜 （FIB-SEM） 图像体积内的形态学标准来识别常见的神经元亚细胞结构，特别注意识别投射到突触前钮扣中的棘叶的多样性。特别是，该协议描述了如何追踪神经元突触内的棘突，以产生这些薄的亚细胞投影、它们的亲代神经突和突触后伴侣的 3D 重建。此外，该协议还包括一个用于分析 FIB-SEM 数据的免费开源软件程序列表，并提供了改进 3D 重建以进行可视化和发布的技巧（例如，平滑、照明）。这种适应性强的协议为 FIB-SEM 图像体积内亚细胞结构的快速纳米级分析提供了一个切入点。

Introduction

对纳米薄亚细胞成分的结构-功能关系的研究通常受益于 3D 可视化和分析¹。然而，由于必须使用金刚石刀切割和对齐成百上千个 ≥40 nm 连续超薄切片，因此连续截面透射电子显微镜研究在时间和空间上受到限制。这些限制限制了对薄（直径 <40 nm）亚细胞结构进行采样和有效分析的能力，并且精通超薄连续切片的必要性阻碍了 3D 结构分析的应用 ^2,3。然而，聚焦离子束扫描电子显微镜 （FIB-SEM） 的最新进展彻底改变了可获得图像体积的速度和分辨率，现在可以定量分析薄的亚细胞结构，例如光滑的内质网 ^4,5、神经元突触 ^3,6 和突触囊泡 ^7,8大规模。此外，FIB-SEM 图像卷的广泛使用加速了可免费访问的 FIB-SEM 图像卷存储库⁹ 和 3D 分析软件（例如，Espina¹⁰、IMOD¹¹、Neuromorph¹²、Reconstruct¹³、TrakEM¹⁴）的开发，这些软件扩大了该技术的范围，现在能够研究精细亚细胞结构的结构和功能。

一种这样的纳米级亚细胞特征是神经元突触"棘"。棘很薄（~0.06-0.15 μm 宽，0.1-1 μm 长），指状突起，从一个神经元发出，并被另一个神经元的神经突（例如突触前钮扣）包裹^15,16。嵌入神经元过程中的棘突在电子显微镜文献中已有近 60 年的报道¹⁷，而棘状突起是兴奋性突触的保守 18,19,20 和普遍存在的^21,22 特征。然而，尽管突触棘无处不在，但它们的功能仍然不清楚，并且缺乏必要的数据来解释它们的丰富性和结构保守性。缺乏棘突的实验表征主要是由于难以定量分析棘突的患病率和大小。它们的小尺寸最适合使用以前无法达到的 z（深度）分辨率（即 ≤15 nm）进行分析。

在这里，提出了一个 FIB-SEM 分析管道，用于识别、可视化和分析薄（横截面≤40 nm 宽）亚细胞结构，可以作为 FIB-SEM 新手和专家的切入点。该协议作为识别 3D FIB-SEM 图像体积内神经元亚细胞结构的入门书，强调如何使用特定标准来识别和分类棘突和突触的亚型。此外，该协议还演示了如何将图像体积导入免费的 3D 分析软件平台 （Reconstruct），使用该软件追踪兴奋性神经元突触内的棘突，并生成这些亚细胞投影、它们的母体神经突和封装的突触前钮扣的 3D 重建。最后，该协议展示了如何使用免费的开源 3D 撕裂软件 （Blender） 来平滑 3D 重建的"皮肤"以进行可视化和可能的发布，详细介绍了该技术的优势和潜在陷阱。

Protocol

1. 图像体积数据和亚细胞物体大小:注意事项和配准

1. 获得包含感兴趣亚细胞对象的感兴趣区域的高质量 FIB-SEM 图像体积。
   注意:该协议使用来自晚期青少年雪貂初级视觉皮层（24.2 x 16.2 x 2.4 μm，4 nm 各向同性体素）的 FIB-SEM 图像体积片段，以及来自成年大鼠 CA1 海马体（10.2 x 7.7 x 5.3 μm;5 nm 各向同性体素）的可自由访问的 FIB-SEM 体积由 Knott 实验室 （https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/）。使用保留超微结构细节并在 FIB-SEM 成像条件下产生高对比度的方案为 FIB-SEM 准备组织块至关重要^23,24。重要的是，应对组织进行成像，使生成的 FIB-SEM 图像体素分辨率×感兴趣的最小亚细胞结构的直径大小<0.5。例如，由于棘突突出到突触前钮扣的部位直径可以小至 30 nm，因此 <15 nm 的体素大小对于高于奈奎斯特标准的这些结构进行采样是合适的。此外，以各向同性（所有维度相等）分辨率（例如，5 x 5 x 5 nm 体素）对组织进行成像也很有用，以便能够在所有 x/y/z 平面上具有相同维度的精细结构进行可视化和重建。
2. 下载并安装 ImageJ²⁵ 的斐济发行版 （https://imagej.net/software/fiji/downloads）。
3. 对齐图像体积。
   注意:虽然现代 FIB-SEM 系统可产生大致对齐的图像体积，但图像到图像配准可能仍会受到亚像素漂移的影响。
   1. 在斐济，导航到 插件 |注册 ，然后选择 Register Virtual Stack Slices （注册虚拟堆栈切片）。请参阅用户手册以获取帮助 （https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices）。从 Rigid 套准开始，然后根据需要使用 Affine 技术。
4. 缩放图像体积。
   1. 通过单击在斐济打开对齐的图像卷 文件 |导入 |Image Sequence 并导航到包含对齐图像的文件夹。
   2. 在对话框窗口中，如果图像按数字顺序命名，请单击 Sort names digitically （数字排序名称）。单击 Use virtual stack for faster Fiji performance（ 使用虚拟堆栈 以获得更快的斐济性能）。
   3. 图像打开后，单击 Image |Properties 并在像素高度、宽度和深度框中插入图像体积像素的物理大小（以微米为单位）。在最右侧的每个框中键入 um OR μm 。通过单击.tiff 文件 |另存为 |蒂夫。
      注意:如果图像是缩放的，则图像的顶部现在应以微米为单位指示图像的大小（例如，9.82 x 8.65 μm）。

2. 神经突和突触棘识别

1. 在堆栈中滚动（使用箭头键或鼠标滚轮）时，参考神经突识别决策树（图 1）和切片神经突示例（图 2）来定位和识别感兴趣的对象。
   1. 将突触棘识别为神经突的膜结合突起，该突起完全包裹在突触前或突触后神经突内。
      注:突触棘阳性识别需要棘突突出的物体膜浸入突触前或突触后结构的倒置膜的视觉证据，并且存在膜结合棘完全被突触前或突触后结构的膜包裹在至少一张图像中。
2. 在斐济创建感兴趣区域 （ROI）
   1. 单击 Fiji 工具栏中的相应工具（例如， 椭圆 工具），然后单击并拖动图像以形成 ROI。在 ROI Manager 中键入字母"T"来记录此 ROI。
      注意: ROI Manager 现在应以图像坐标作为其默认名称显示。
   2. 单击 ROI Manager 中的 Rename 按钮，然后在出现的文本框中键入所需的名称，根据需要重命名 ROI。根据定量标准重命名 ROI（例如，分析的第 12^个突触前钮扣可能命名为 B12_s，s）。
      注意:要将每个 ROI 与一个图像"切片"相关联（而不是将其存在于整个图像堆栈中）并使 ROI 名称在单个图像上可见，请单击 ROI 管理器 |更多 |Options 窗口，然后单击 ROI Manager 底部的 Show All and Labels 复选框。请注意，在图像体积中保存 ROI 时，此步骤至关重要，因为将 ROI 与整个图像体积而不是单个图像相关联可能会导致体积内对象的重复计数。
   3. 要将 ROI 管理器中当前的所有 ROI 保存为文件，首先，单击 ROI Manager 中的 Deselect 按钮，单击 More 按钮，然后向下滚动到 Save。
      注意:现在可以在斐济打开此保存的 .zip 文件，以将所有这些 ROI 重新加载到 ROI Manager 中。

3. 确定感兴趣区域并将图像体积传输到 3D 分析软件

1. 确定是否需要将整个图像体积传输到 3D 重建和分析软件，或者是否应该创建一个较小的子堆栈（3.3.2） 来分析原始堆栈中较少数量的图像和/或感兴趣区域。
2. 在包含感兴趣对象的相对较小的区域上运行一个小型的"试点"研究，以估计效应大小和获得统计比较所需功效所需的感兴趣对象数量。如果这些亚细胞对象在图像体积内分布不均匀，则对感兴趣对象进行采样所需的图像体积大小进行保守估计。
3. 要将图像体积的一部分用于 3D 分析，请首先通过单击 图像 |复制。
   1. 要使用图像的裁剪部分进行分析，请从斐济工具栏中选择 矩形工具 并绘制所需的感兴趣区域;如果不需要，请继续执行下一步。
   2. 转到 图片 |堆栈 |工具 |制作 Substack。在文本框中键入要包含在子堆栈中的图像范围（例如，通过键入 1 - 500 来包含图像 1 到 500）。
   3. 请参阅上述采样注意事项（注意 1.1 之后），根据目标对象的大小确定所需的 z 分辨率。例如，如果图像体积的体素深度为 5 nm，则可以在 z 维度上以 10 nm 的间隔对感兴趣的对象进行采样，以便斐济保留子堆栈中的所有其他图像。为此，请键入范围后第 n 个图像的编号（例如，要仅包含 1 - 500 个图像范围内的所有其他图像，请键入 1 - 500 - 2）。
      注意:每个 3D 分析软件包（见 表 1）都有自己的文件导入要求。该协议侧重于将保存为 .tiff 文件的图像卷导入图像卷软件 Reconstruct。

4. 3D 重建和重建中薄亚细胞结构的分析

注意:在使用 Reconstruct 时使用配备滚轮的鼠标非常有利。此外，如果大部分或全部描摹都是手动执行的，那么使用触笔在带有触摸屏的计算机上绘制轮廓可以显著提高描摹效率。

1. 下载并安装 Reconstruct （https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0），以便在本机或虚拟环境中运行 Microsoft Windows 的计算机上使用。
2. 通过为重建文件创建一个新文件夹，单击 "序列 |新建，并将此重建（.ser 文件）与所需的文件名保存在刚刚创建的文件夹中。
3. 将保存的 .tiff 图像卷导入到 Reconstruct 中。
   1. 导航到系列 |导入 |Images （图像），单击 Import Images （导入图像） 窗口中的 Select （选择），然后找到映像卷文件。在 Import Images （导入映像） 窗口中，查找为卷中每个映像单独显示的映像卷文件。
   2. 重要说明:在 Pixel Size 文本框中键入正确的像素大小，以对应于图像体积的 x/y 像素大小（以 μm 为单位）。完成此作后，单击 Import Import 按钮 导入图片 窗口。
      注意:导入图像后， "重建 "窗口中间应该有一张图像，并且 "导入图像"列表 应为空。
   3. 如果 Reconstruct 窗口中间有图像，并且 Import Images 列表为空，请单击 Import Images 窗口中的 Quit。
   4. 通过单击截面 |列出部分，突出显示所有列出的部分，然后单击 Modify |Thickness 并在文本框中键入截面厚度（以 μm 为单位）（例如，对于 5 nm 厚的截面，为 0.005）。
      注意:回想一下，如果处理来自仅包含每 n 个截面的较大原始图像体积的子堆栈（请参阅步骤 3.3.3），则必须在总截面厚度中考虑这些"缺失"截面。例如，如果原始图像体积截面厚度（又名体素高度）为 0.005 μm，并且子堆栈仅包括每三个部分（例如，1-500-3），则该子堆栈的截面厚度为 0.015 μm（即 0.005 μm x 3 个截面）。
4. 跟踪感兴趣的对象。
   1. 前往系列 |选项 |Names/Colors 选项卡为新对象命名。为对象描摹的轮廓和内部填充选择一种颜色，然后单击 OK。
      注意: Reconstruct 将尝试将同名的所有跟踪与一个对象连接起来。请参阅 Reconstruct 手册了解跟踪命名约定（例如，名称中不要包含空格）。描摹颜色仅用于可视化描摹;此对象的 3D 重建的颜色可以在以后轻松更改。
   2. 在 Toolbar（工具栏）上，选择看起来像铅笔的 Draw Freehand （绘制手绘 ） 工具。按住鼠标左键并拖动鼠标以跟踪对象的膜;松开鼠标左键可自动完成跟踪。单击 Page Up / Page Down 或使用鼠标滚轮前进到图像体积中的下一个光学部分，并逐步进行描摹，直到结构完成。
5. 追踪突触棘
   注:突触前钮扣内的嵌入棘状物表现为膜结合的透明结构，偶尔在其内部有肌动蛋白样电子不透明材料和/或膜状折叠。
   1. 通过图像体积前进，将棘突内陷到突触前钮扣的部位定位，小心区分棘与内质网、液泡、内体、自噬体和其他亚细胞器。
      注意:与膜结合的细胞器不同，确保突触棘始终从（即外翻的膜）神经突/神经胶质细胞伸出，并被（即倒膜）突触前或突触后结构接收。棘突内陷的这种视觉证据应出现在 ≥2 图像中，并且在 ≥1 图像中，突触前或突触后结构内应存在完全封装的膜结合棘。小棘可能被网格蛋白包被。为了区分刺突内陷事件与网格蛋白包被的内吞作用进入突触前或突触后神经突，确保网格蛋白涂层棘突的阳性识别需要目视确认来自突突母体的重合外翻膜投射到突触前或突触后结构的倒置膜在同一图像中。
   2. 在图像体积中前进，从其母神经突/神经胶质细胞定位棘突投影/起点;请参阅 图 1 和 图 2 以帮助识别这些父结构。
   3. 从膜突出到接收结构（例如突触前钮扣）的部位开始追踪棘，并继续绘制棘，只要它在封装的突触前或突触后神经突内显示为膜结合结构。
   4. 继续按住鼠标左键（如果使用触摸屏计算机，则用手写笔继续沿着棘膜绘制），同时用鼠标指针描摹棘膜。
   5. 到达跟踪开始点时，松开鼠标左键。
      注意:过早松开鼠标左键将自动完成跟踪，通常会产生不良结果。如果发生这种情况，只需在 Trace List 中突出显示此跟踪时按 delete。
   6. 对出现棘突的每个部分重复步骤 4.5.2-4.5.5。
      注意:请记住在适当时将棘突作为钮扣内的封装膜结合结构进行追踪。由于 Reconstruct 不允许从封装结构的体积中自动减去封装的亚细胞结构（例如，棘状细胞、亚细胞器），因此可以在 事后 进行（例如，通过简单地从突触前钮扣的总体积中减去刺状体积）。
6. 在 Reconstruct 中重建 3D 对象
   1. 导航到 系列 |选项 |3D 选项卡，并确保单击 Traces 单选按钮。
   2. 通过单击 对象 |列出对象。
   3. 在窗口中加载跟踪对象的名称后，双击 Object List （对象列表 ） 中的对象名称以 3D 形式查看它们。等待 3D Scene 窗口出现。
   4. 确保每个对象的 Object List（对象列表 ）中跟踪的 start、end （结束） 和 count （计数） 正确无误，以便 Count = End - Start（结束 - 开始）。如果对象的 Count ≠ End - Start，则可能错误地省略了该对象的一个或多个跟踪。
   5. 通过按住鼠标左键并移动鼠标和/或按住鼠标右键并前后移动鼠标来放大和缩小对象的 3D 轨迹。确保对象的轨迹正确对齐，并且每个连续轨迹之间似乎有一个平滑的过渡。
   6. 如有必要，请回溯单个迹线，以消除导致尖锐边缘和/或迹线之间过渡的错误。
   7. 通过导航到"系列 |对象 |3D 选项卡并单击 Boissonnat surface 单选按钮。
   8. 在 3D Scene 窗口中，单击 Scene |清除，然后双击 Object List 中所需的对象名称。
   9. 旋转对象以确保轨迹之间的平滑过渡，并在必要时重新绘制轨迹。
   10. 要更改对象颜色和透明度，请单击 Object List（对象列表）中的对象名称，然后单击 Scene |颜色/透明度... 在 Object List （对象列表 ） 菜单中。双击 Object List 中的对象名称，在 3D Scene 窗口中查看此更改。
       注意:使用 Blender 可以更大程度地控制和特异性地更改对象的颜色、透明度和平滑度（5.4-5.6） 。
7. 3D 对象的定量分析
   1. 导航到 系列 |选项 |Lists 选项卡 ，然后单击此窗口的 Object List 和 Trace List 部分中的所有所需测量值。
   2. 通过打开 对象列表 （Object |列出对象...，然后点击 List |保存。
   3. 将 Object List（对象列表 ）中显示的对象测量值保存为逗号分隔文件 （.csv）。
   4. 将 .csv 文件导入到所选的数据分析软件中。要导入到电子表格（例如 Microsoft Excel）中，只需双击该文件，或打开一个新的空白工作簿，单击 文件 |导入 |CSV 文件 选项，然后按照说明作。
   5. 要测量 3D 对象之间的距离（例如，测量突触前钮扣内突触棘的投影距离），请使用 Reconstruct 中的 Z 跟踪函数。
   6. 首先，通过导航到 Series |选项 |Names/Colors 选项卡 ，然后键入 Z 轨迹的名称。
   7. 接下来，单击工具栏中的 Z 跟踪 工具。
   8. 要绘制突触棘投影距离的 Z 轨迹，请单击鼠标左键单击突触棘的起点，然后按 Page Up 或 Page Down 按钮在图像体积中前进，同时单击每个截面内沿突触棘膜的连续点。
   9. 通过单击鼠标右键完成此 Z 跟踪。
   10. 通过单击 Trace |列出跟踪... 调出 Trace List ，然后单击 List |Save 将迹线列表测量值保存为 .csv 文件。
8. 添加缩放立方体
   1. 导航到堆栈中的第一个或最后一个映像之一
   2. 前往 系列 |选项 |Names/Colors 选项卡 ，然后键入缩放多维数据集的名称。
   3. 在工具栏中，选择 Draw Rectangle 工具，并在对象附近绘制一个小正方形（大小不重要），但不要遮挡它们。前往系列 |选项 |3D 选项卡中，单击"生成"区域中的"框"单选按钮选项，然后通过在"大小"区域的 A:、B:、C: 框中键入其尺寸来指定缩放立方体的大小（以 μm 为单位）（例如，为 A、B 和 C 键入 0.5 以生成 0.5 μm/侧缩放立方体）。
      注意:在尝试在 3D 中重建缩放立方体之前，请确保已使用 Traces 或 Boissonnat surface 选项在 3D 场景中重建所需的 3D 对象。请记住，在重建缩放立方体后（即，在步骤 4.8.5 之后），将 Generate 选项改回 Boissonnat surface ，并将 A、B 和 C 的大小改回 -1 。
   4. 打开 Object List 并双击缩放立方体的名称;等待 Scale Cube 出现在 3D scene 窗口中。
   5. 要相对于其他对象移动缩放立方体，请转到 Series |选项 |3D 选项卡，然后键入将刻度立方体移动到 X、Y 和/或 Z 框中所需的 μm 数。单击 OK 关闭窗口，然后双击 Object List 中缩放立方体的名称。
      注意:或者，这可以使用 Blender 完成（见下文）。

5. 在 Blender 中导入、重新着色、平滑和添加 3D 重建的透明度

注意:有关使用 Blender 的详细帮助，请查阅 Blender 手册和/或有关使用每个 Blender 功能的无数"作方法"视频（只需在网上搜索 Blender 和 所需功能）。以下是有关如何为 3D 重建重新着色、平滑和添加透明度的简短入门。

1. 下载并安装最新版本的 Blender，即免费的开源 3D 软件套件 （www.blender.org）。
2. 在 Reconstruct（重建）中，通过在 3D 场景 窗口中显示所需的对象，然后单击 Scene （场景） |导出为 |VRML 2.0 的。
3. 在 Blender 中，导航到 文件 |导入 |X3D 可扩展 3D （.x3d/.wrl）。单击从 Reconstruct 保存的 VRML 2.0 文件，然后单击 Import X3D/VRML2 按钮。
4. 重新着色重建。
   1. 在 Scene Collection 窗口的右上角，单击以取消选择/取消选中默认 Cube 对象的眼睛图标，然后单击各个对象的名称以突出显示场景中的每个对象。根据需要重命名这些对象。
   2. 在 Scene Collection 窗口中单击要重新着色的第一个对象的名称。
   3. 单击循环 Context。 Material 图标，然后单击 Add Material（添加材质）。选项列表应显示在下方。接下来，单击旁边的栏 基础颜色 选项并为对象选择所需的亮度和色调。
   4. 要改变对象的金属外观、光泽度和反射质量，请调整 "金属"、"镜面反射"、"粗糙度"和 "光泽 "选项以产生所需的效果。
      注意:要使某些选项显示在场景中（例如，透明度、光泽），可能需要位于 Viewport Shading: Look Dev 或 Viewport Shading: Rendered viewport 设置中。要更改为任一视区设置，请将鼠标悬停在右上角的 地球 图标上，然后单击所需的视区设置。
   5. 要更改光照角度，请单击 Scene Collection 窗口中的 Light 对象，单击右上角的 Show Gizmo 图标，然后在场景周围拖动灯光以获得所需的光照效果。选择 Light 对象时，在 Object Data （对象数据） 窗口中更改灯光强度，该窗口显示在 Scene Collection （场景集合） 窗口下方。
   6. 要分别在选定轴上旋转对象，请单击 Scene Collection 窗口中的对象名称，按 R 键，然后单击旋转轴的字母（x、y 或 z 键），并移动鼠标以产生所需的旋转。要 抓取 和移动对象，请在 Scene Collection 窗口中选择对象，按 G 键，然后使用鼠标在场景中移动对象。
5. 重新划分（即平滑）重建。
   1. 在 Scene Collection 窗口中单击感兴趣的对象的名称，然后使用万向节和鼠标滚轮将对象居中并放大。
   2. 单击图标右侧的 Context.Modifiers 扳手 图标，单击 Add Modifier，然后单击 Remesh （在 Generate 标题下）。使用下拉菜单选择 平滑，单击 平滑着色 按钮，然后更改 八叉树深度 和 比例 以获得所需的平滑度。
      注意:在重新划分网格时，在 Viewport Shading: Wireframe 窗口（右上角的地球 图标选项）中直接查看结果非常有用。重新划分网格将在对象上创建不同大小的四面体网格。在平滑对象以去除切片或描摹伪影时，请注意保留其原始形状和轮廓。从 Octree Depth = 7 和 Scale = 0.95 开始，然后根据需要慢慢减小这些数字。特别注意小而薄的物体，例如棘状体和突触后密度，因为这些物体的小体积会缩小在不改变其原始形状的情况下可以完成的平滑范围。
6. 为对象添加透明度。
   注意:当需要显示位于另一个对象（例如突触前钮扣）内的一个对象（例如，突触前囊泡、线粒体、内体）的 3D 关系时，使对象透明是很重要的。
   1. 在 Scene Collection 窗口中单击所需的对象名称。滚动到 Context 的底部 。Material 窗口（右侧列表中的右下角图标），打开 Settings 部分，然后使用下拉菜单将 Blend Mode 更改为 Alpha Blend。接下来，打开 Surface 部分，向上滚动到 Alpha，并将数字更改为小于 1 的值（1 = 完全不透明，0 = 完全透明）。
7. 导出 3D 重建的快照。
   1. 获得 3D 重建的最佳着色、平滑和照明后，通过单击菜单标题 Window 并选择 Save Screenshot 来保存场景中的图像。
   2. 在 保存屏幕截图 左下角的选项，选择所需的文件类型、颜色格式和压缩。
   3. 在上面的文件名文本框 中键入新 屏幕截图的名称，然后将屏幕截图保存在所需位置。

Results

量化雪貂初级视觉皮层中兴奋性突触前钮扣种群中突触棘的百分比
尽管几十年来已经观察到从神经突到兴奋性突触前钮扣的棘状突起^19,26，^但它们对突触功能的潜在重要性仍然不清楚。这些实验旨在确定雪貂初级视觉皮层 （V1） 中整个出生后发育过程中包含棘突的兴奋性突触前钮扣的比例，以确定棘突对突触功能与发育里程碑的潜在重要性。因此，从出生后第 21 天 （p） 21 （15.1 x 14.1x 2.8 μm）、p46 （9.7 x 8.4 x 2.7 μm）、p60 （24.2 x 16.2 x 2.4 μm） 和 >p90 （24.2 x 16.2 x 2.4 μm） 雪貂 V1 获取对齐的 4 nm/体素各向同性 FIB-SEM 图像体积，使用 FEI Helios 660 DualBeam FIB-SEM 以 52° 倾斜度成像， 反向散射模式下 4.2 mm 工作距离、3 kV 加速电压和 400 pA 电流。尽管堆栈在采集时与 FEI 软件大致对齐，但所有堆栈都使用斐济进行亚像...

Discussion

该 FIB-SEM 图像体积分析管道可以产生可靠的 3D 重建和薄亚细胞结构的定量测量。虽然目前使用深度神经网络和分割算法的半自动化技术可以提高在大图像量中重建具有相对高膜对比度的细胞结构的速度和效率³³，但许多亚细胞结构（例如，棘状、光滑内质网、内体）由于膜对比度和/或迂曲度较低，仍然难以使用自动化方法进行可靠捕获， 尽管较新的方法已经开始捕获更高对比度的线粒体和粗面内质网^34,35。此外，未标记的亚细胞结构之间的细微区别（例如，网格蛋白介导的内吞作用与带有网格蛋白涂层尖端的棘，或内体与内质网）将需要对任何自动重建技术进行反复的手动校对³⁶。因此，该协议详细说明了在开始分析 FIB-SEM 图像中的亚细胞结构之前建立明确亚细胞物体阳性识别标准的重要性。

为了实现这些目的，熟悉特定亚细胞结构在一系列随机切...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
斐济 （ImageJ）			https://imagej.net/software/fiji/downloads
重建			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https：/www.blender.org