一种微流控系统，用于模拟生理脉冲剪切应力与振荡性高血糖下的内皮功能障碍

Summary

本文介绍了一种方法，用于制造和操作一种微流控系统，使内皮细胞暴露于同步振荡性高血糖和脉动剪切应力之下。该方法为研究糖尿病内皮功能障碍提供了具有生理学意义的 体外模型。该方案能够定量测量氧化应激和内皮细胞反应。

Abstract

糖尿病血管并发症中的内皮功能障碍涉及代谢紊乱之间的复杂相互作用，特别是振荡性葡萄糖（OG）和脉搏剪切应激（PSS）。尽管这些因素已被单独研究，传统模型仍限于静态高血糖或简化层流，缺乏模拟糖尿病血管中整合时空耦合的能力。通过利用可编程微流控平台，该方案为研究同步振荡性高血糖与生理性PSS对内皮细胞的综合影响提供了宝贵平台。本方案旨在模拟内皮功能障碍在生理相关的耦合代谢和机械条件下的表现。结合聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片和压力驱动控制系统，能够精确、独立地调制流动波形和葡萄糖浓度曲线。系统的血流动力学保真度通过微颗粒成像速度测量（Micro-PIV）验证，同时通过监测细胞内活性氧（ROS）水平和细胞存活率，定量表征细胞响应。代表性结果表明，生理性PSS有效减轻OG引起的氧化损伤。这一效应表现为细胞内ROS水平降低和细胞存活率提升，在联合刺激条件下表现为显著。根据研究问题的不同，可以调整剪切应力模式、葡萄糖振荡频率和通道几何形状等参数。该方法作为机械生物学通路机制研究和糖尿病血管疾病治疗干预药物筛查的多功能工具。

Introduction

内皮功能障碍是糖尿病血管并发症发展的关键早期事件，由代谢紊乱和异常血流动^{动力学力量}共同驱动 ^1,2。OG水平，而不仅仅是持续高血糖，越来越被认为是内皮细胞中氧化应激和炎症信号传导的强有力诱导因子，导致血管损伤和稳态受损 ^3,4,5。同时，血流动力学剪切应激是内皮表型的主要决定因素，生理运动条件下的PSS促进一氧化氮生成、抗氧化防御和^{血管保护6,7,8}。因此，理解振荡性高血糖与血流动动力学刺激的综合效应对于阐明内皮功能障碍的机制至关重要。

传统的体外模型通常依赖静态高血糖条件或简化的层流，无法复制体内代谢与机械线索之间复杂且动态的相互作用 ^9,10,11。虽然动物模型捕捉了糖尿病的全身性特征，但它们缺乏在受控微环境条件下解剖信号所需的细胞层面分辨率¹²。微流控技术提供了一种有效的替代方案，能够精确地控制生理相关几何形状中的生化和生物力学刺激，并推动了各种创新生物医学应用的最新进展（^14,15）。例如，Chen 等^人设计了一种微流控器件，利用空间和时间壁剪切应力及 ATP 信号传导，用于研究内皮细胞细胞内 Ca²⁺ 动态。Yu等^人开发了一种血流动动力微流控芯片系统，用于检测在不同生理PSS和高血糖浓度组合下的细胞反应。尽管这些系统已被用于研究内皮对剪切应激或单因子代谢扰动的反应，但很少有系统能成功将葡萄糖振荡和PSS整合到单一系统中。因此，缺乏一个标准化且可重复的协议，能够在受控微流控环境中同步两者。

该方法通过建立一个可重复的微流控系统来弥补这一空白，能够实现耦合的OG和PSS。该方法的主要目标是以生理学相关的方式，模拟内皮功能障碍背后的氧化应激、细胞存活能力受损和机械生物学反应。与静态培养或传统灌注腔不同，该方法改进了现有模型，实现同时且受控地调节代谢和机械刺激，更接近糖尿病血管微环境。此外，该系统兼容活细胞成像、实时监测和分子分析，适用于机理研究、疾病建模以及内皮功能和损伤的药物筛查等广泛应用。

Protocol

伦理声明：

注意：本协议中使用的所有试剂、设备和软件均列于 材料表中。

1. 微流控芯片制造

1. 使用计算机辅助设计（CAD）软件设计微流控芯片结构（宽 x L x 高 = 2 mm x 30 毫米 x 0.1 毫米， 见图1A），并通过商业公司制作SU-8母模。
2. 将PDMS固化剂和预聚合物按重量比10：1混合在干净的搅拌杯中，用力手动搅拌5分钟。
3. 将容器放入真空室，温度低于-0.08兆帕，至少15分钟，以去除混合过程中被困的气泡。
   注意：为加快气泡清除并防止溢流，应暂时将气缸排气至大气压以破裂大气泡，然后立即重新施加真空。重复此排气循环2–3次，直到整体混合物完全透明且无宏观气泡。
4. 将PDMS倒在放在玻璃培养皿中的晶圆上。
5. PDMS在干燥器中再加15分钟脱气，以去除铸造过程中可能形成的气泡。
   注意：如果SU-8主模具结构附近或内部仍有顽固微泡，应轻轻吹气或用手动橡胶风机将其吹破。完全去除气泡对于防止微通道结构缺陷至关重要。
6. 将含有霉菌和聚合物的培养皿放入加热至80°C的高温烤箱中烘烤2小时。
   注意：处理高温物品时请戴耐热手套
7. 用手术刀小心地将凝固的聚合物板从主模具上剥离。
8. 使用芯冲工具（例如直径1.2毫米）在聚合物板的指定通道端部开设进出口口。
9. 用胶带清洁玻璃罩和聚合物板的花纹面。
   暂停点：固化并冲孔的PDMS板可在室温下保存数周，再进行等离子处理和粘结。
10. 用等离子清洁剂在室内空气下以65瓦功率处理聚合物板和玻璃盖片60秒。
11. 立即将聚合物通道面对准玻璃盖片的处理面。
12. 轻轻按压即可形成永久闭合的微流控通道。

2. 内皮细胞的制备与播种

1. 将结合的微流控芯片放入装满去离子水的硼化玻璃瓶中，并以121°C、15 psi高压灭菌20分钟。
   注意：高压灭菌过程中应将芯片浸入水中以平衡压力并防止PDMS微通道变形。这也有助于去除被困的气泡，并为后续流体的引入做准备。
   暂停点：经过灭菌的微流控芯片可以在室温密封玻璃瓶中安全保存数周，直到需要进行细胞播种。
2. 将无菌芯片放入一个60毫米培养皿中，培养皿内填充1：1混合的磷酸缓冲盐水（PBS）和低葡萄糖杜尔贝科改良鹰培养基（DMEM）。
3. 用1毫升注射器将100 μg·^mL-1 纤脑内分泌素注入通道，并在37°C下培养4小时。
   注意：确保微流控芯片置于液面以下。将适配器软管连接到注射器针头，注入液体并插入低于液位的软管，接入入口，然后注射以确保没有气泡进入。
4. 将24.5 mM的D-甘露醇加入低葡萄糖DMEM（5.5mM葡萄糖）以提高渗透压。将5 mM D-葡萄糖加到高血糖DMEM（25mM葡萄糖）中，最终为30 mM葡萄糖。将正常葡萄糖（NG）培养基和高葡萄糖（HG）培养基分别补充20%胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P/S）。
5. 将1×PBS、胰蛋白酶、NG和HG培养基置于37°C的水浴中。 从培养皿中提取90%汇聚率的人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）。使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液分离细胞，并在37°C下培养30秒。计数采集的细胞，并将浓度分别调整为1 x 10⁶ 细胞/mL，分别为NG培养基和HG培养基。
6. 使用1毫升注射器将100微升细胞悬浮液注入微流控芯片的入口口，对照组使用天然气培养基，实验组使用高浓度培养基。将微流控芯片放入37°C加5%二氧化碳的加湿孵化箱_中，浸泡 48小时。
   注意：在进一步处理前，应让细胞至少附着4小时。每2小时手动交替使用两种培养基，以刺激静止培养阶段的振荡性高血糖。将细胞的血糖保持在5.5毫毫米，过夜以模拟体内的情况（见图1B）。

3. 动态刺激装置

1. 分别向两个100 mL的储液槽填充NG和HG培养基，并将其连接到可编程压力控制系统的相应通道。
2. 用硅胶管连接储液槽、两档三通磁阀和微流控芯片。
3. 使用直径1.3毫米、90°倾角的不锈钢连接器将PDMS芯片的进出口端口连接到管子上。
   注意：事先用高压高温高压灭菌器消毒100毫升储液罐、硅胶管和不锈钢连接器。
4. 计算实现目标PSS（τ）所需的流量（Q）。使用公式τ = （6μQ）/（wh²），其中μ粘度，w为通道宽度，h为通道高度。
5. 设定一个生理PSS目标（τ = 10 ± 2 dyn·^cm-2,1 Hz），对应计算出的流量为200 ± 40 μL·^min-1。
6. 编程可编程空气泵生成正弦波函数以维持PSS。将阀门控制器编程为每5分钟切换通道，在动态刺激期间产生方波葡萄糖振荡。
7. 启动可编程泵系统，将合并的OG和PSS输送，总共30分钟。

4. 用于流场验证的微型PIV

1. 准备含有0.05%体积浓度（1微米）的NG和HG培养基。确保颗粒均匀分布且无聚集。
2. 将一块干净、无细胞的微流控芯片（与细胞实验中使用的芯片）放置在倒置荧光显微镜的舞台上。
3. 连接系统中的所有组件（图1C）。
   1. 将压力源连接到压力控制器。
   2. 将压力控制器连接到阀门控制器，阀门控制器连接计算机，实现压力波形的自动控制。
   3. 通过不同的管道将压力控制器出口连接到HG和NG水箱。
   4. 将两个储液槽连接到3/2压力阀，该阀根据编程的振荡葡萄糖协议在HG和NG介质之间切换。
   5. 通过管道将3/2压力阀的出口连接到微流控芯片的入口。
   6. 将微流控芯片的出口连接到废物储存槽。
   7. 将微流控芯片放置在显微镜台上，在整个实验过程中进行活细胞成像。
      注意： 在开始流动前，确保所有管路连接都牢固且无泄漏。
4. 在流量稳定后触发高速摄像机（以15 Hz双帧模式运行），捕捉流动微粒的连续图像对。将每对两帧之间的精确时间延迟（Δt）设为80微秒。
5. 在频道内为兴趣区域（ROI）拍摄图像。选择直通道段中心的ROI（见图2A），距离入口和出口等距，以避免终端效应并确保流量测量具有代表性。
6. 使用PIV分析软件处理采集到的图像对。使用自适应多重交叉相关算法，从初始询问区域64×64像素开始，最终细化到16×16像素，网格步长为8×8像素，以确定两帧之间粒子的位移矢量（Δx）。
7. 用公式v = Δx / Δt计算每个探测区域的速度矢量（v）。

5. 数据采集

注意：使用钙化素-AM/碘化丙二（PI）试剂盒和活细胞氧化应激荧光探针，量化细胞的存活能力和功能，以验证葡萄糖波动造成的损伤并评估共刺激的影响。

1. 细胞存活率
   1. 按照制造商在实验端点的说明准备钙化素AM/PI工作溶液。
      注意： PI是一种已知的诱变原，也是疑似致癌物，会嵌入DNA中。请极其小心地处理。在指定的安全工作区内佩戴手套和手柄。
   2. 用PBS冲洗一次频道，然后将Calcein-AM/PI工作溶液引入频道。在37°C下，5%二氧化碳在黑暗中孵育30分钟。
   3. 立即使用配备10×物镜的倒置荧光显微镜拍摄染色细胞的荧光图像。对于Calcein-AM使用FITC（绿色）滤波器，PI则使用TRITC或Rhodamine（红色）滤波器。
2. 测量细胞内ROS
   1. 在制造商指定的浓度（5微米）中，制备活细胞氧化应激荧光探针（见 材料表）工作溶液（PBS）。
      注意： 荧光探针及其常见的溶剂（如DMSO）可能具有毒性，并可能促进有害物质通过皮肤的吸收。在指定的安全工作区内佩戴手套和手柄。
   2. 用PBS冲洗通道三次，并注入活细胞氧化应激荧光探针溶液。在37°C下与5%二氧化碳一起在黑暗中孵育30分钟。
   3. 用PBS冲洗通道三次以去除未绑定的探头。立即使用远红滤光片组（激发640 nm，发射665 nm）通过20×的物镜捕捉荧光图像，保持所有组的曝光参数完全相同。
      注意： 荧光强度升高表示ROS水平升高。

6. 数据分析

暂停点：一旦所有原始荧光图像和高速相机图像被采集并安全保存到硬盘，后续的图像处理、定量分析和统计比较可以暂停，并在任何时间点进行。

1. 量化细胞存活能力
   1. 在ImageJ中打开采集的钙化素-AM（绿色）和PI（红色）图像（见 材料表）。手动调整每个通道的阈值，以区分荧光信号和背景信号。使用细胞计数器函数计数荧光细胞，根据观察到的细胞大小调整最小细胞大小，并在多个视野中计数活细胞（N个_活细胞）和死亡细胞（N个_死细胞）的数量。
      注意：_{N 活}指的 Calcein-AM 阳性（绿色）细胞数量，N_死亡指的是 PI 阳性（红色）细胞的数量。
   2. 使用电子表格软件计算每种实验条件下活细胞的百分比（N活_{细胞 ÷ N}活_{细胞 + N}死细胞 × 100%）。使用统计分析软件计算多个视野的平均差和标准差，以便组间比较。
2. 定量细胞内ROS
   1. 在ImageJ中拖拽首选图片。通过校准显微镜的元数据（或已知参考网格）来设置比例尺： 分析 |设定比例。
   2. 使用背景减法函数： 过程 | 减去背景。
   3. 手动调整阈值滑块以区分并定义细胞内ROS信号：图片 |调整 |门槛。阈值设定后，使用Analyze |设置测量值，选择面积和平均灰度。根据观察到的单元大小设定最小单元大小，测量单元单层ROI内分段信号的平均强度：分析|分析粒子。
   4. 报告每个实验条件的ROS水平，作为从每块芯片至少随机选出三个视场得出的测量值（例如平均强度）的均值。
3. 进行统计比较
   1. 将定量结果（可存活率百分比和ROS平均强度）输入数据分析和绘图软件（见 材料表）。
   2. 通过使用双向方差分析（ANOVA）比较实验组与对照组，并采用Tukey事后检验来确定统计显著性，显著性水平为 p = 0.05。使用该软件进行分析，生成带有代表标准差（SD）的误差条的图。

Results

微流控通道内流场的微PIV验证
图1D 概述了用于研究内皮对耦合代谢和机械刺激反应的微流控平台。该系统集成了直通道PDMS微流控芯片与压力驱动流量控制模块，实现了OG状态与生理PSS的应用。采用可编程阀门切换策略，在NG和HG介质间周期性交替，同时通过计算机控制的压力调节同步脉冲流波形。

为验证微流控系统的血流动力学保真度，使用Micro-PIV定量分析了微通道内的流动特性。在该ROI内测量的实际流量表现出稳定且可重复的振荡，紧密追踪编程输入波形（见图2B）。定量回归分析显示拟合优度很高（R² = 0.94），平均流量为184.75±0.79微升·分^-1 ，振荡幅度为40.30±1.13微升·分-¹。由于系统性液压阻力，平均流量略低于理论输入（200 μL·^min-1）...

Discussion

本文所述的微流控系统为研究OG和PSS对内皮细胞功能的综合影响提供了稳健且生理学相关的平台。该方法的主要优势在于能够精确控制并解耦机械与生化刺激，在特定的微环境中。与传统静态培养缺乏血流动动力学力量或常掩盖细胞水平信号的动物模型^不同，该方案能够独立调节流动模式和葡萄糖浓度分布^20,21。通过复制代谢紊乱与血流动动力学力学力之间的动态相互作用，该系统为剖析糖尿病血管并发症背后的机械生物学机制提供了独特机会。

该协议的成功实施依赖于若干关键步骤。首先，在微流控芯片制造过程中，必须完全去除PDMS预聚合物和微流控通道中的气泡，因为被困气泡会改变通道几何...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	NEST生物技术有限公司	211052	细胞解离
1 mL注射器	上海正邦医疗科技有限公司	1mL	注射液体
60 mm培养皿	NEST生物技术有限公司	705001	细胞培养
90°弯头不锈钢连接器	洛阳梅尔贸易有限公司	1.3 mm	适配器密封装置
AutoCAD软件	Autodesk	RRID:SCR_014981	计算机辅助设计软件
硼化玻璃瓶	湖南艾得特科技仪器有限公司	双层100mL	储液瓶
钙钵/PI试剂盒	贝耀时	byt-c2015	染色
细胞培养箱	ESCO	Esco CelMate	细胞培养
CellROX Deep Red	Invitrogen	C10422	染色
D-葡萄糖	Sigma Aldrich	47249	葡萄糖
D-甘露醇	Macklin	M813423	平衡渗透压
DynamicStudio	丹泰克动态公司	V8.6	PIV分析软件
胎牛血清(FBS)	Gibco	14190-094	培养基
纤连蛋白	Sigma Aldrich	F-2006	细胞粘附
荧光微粒子	Thermo Scientific	G0100	微PIV
玻璃载玻片	Citotest Scientific Co.,Ltd.	#1	微流控芯片
高葡萄糖DMEM	Solarbio	12100	培养基
高速摄像机	丹泰克动态公司	FlowSense EO	微PIV
ImageJ	NIH	RRID:SCR_003070	图像处理软件
倒置荧光显微镜	Olympus	IX73	细胞活力
倒置荧光显微镜	Olympus	IX83	观察和采集
低葡萄糖DMEM	Solarbio	31600	培养基
Origin	OriginLab	RRID:SCR_014212	数据分析和图表软件
PDMS	Dow Inc.	184	微流控芯片
青霉素/链霉素(P/S)	NEST生物技术有限公司	211092	培养基
磷酸盐缓冲盐水(PBS)	NEST生物技术有限公司	211031	细胞培养
等离子体清洁器	嘉润万丰科技有限公司	PC-6D	微流控芯片
可编程压力控制系统	Elvesys	OB1 MK4	流量控制
硅胶管	南京润泽流体控制设备有限公司	96410	1mm*3mm
SU-8母模	博奥生物集团有限公司	N/A	微流控芯片
阀门控制器	Elvesys	MUX Wire V3	流量控制