哺乳动物系统 CRISPR 指南 RNA 克隆
October 2nd, 2018
这里概述了一种简单、高效、经济高效的 sgRNA 克隆方法。
此方法便于为CRISPR促进实验创建引导RNA表达质粒。该技术的主要优点是，克隆可以在一个步骤中进行，并且可以使用单导RNA表达质粒创建成对指南RNA。为了开始此协议，将 1X TE 缓冲液中的冻干底流液稀释到最终浓度为 100 微摩尔。
将等量的向前和反向引件插入 PCR 条盖管。漩涡混合。接下来，在100倍G下旋转导导RNA寡核苷酸混合物15秒。
在室温下孵育反应五分钟，然后进行结扎。使用每微克的 BSNB1 0.5 微升将所选 PSB700 引导表达向量添加到 BSNB1 的 1 到 5 微克之间。加入蒸馏水，直到总体积为40微升，并在55摄氏度下进行一小时的消化。
在1.5%的低熔化阿加糖凝胶上运行消化产品。切出与大小约 9 千基的片段对应的消化矢量主干带。将凝胶片转移到 1.5 毫升微离心管中。
使用商业凝胶净化试剂盒，根据制造商的说明从阿加罗斯凝胶中提取DNA。然后将DNA稀释成10-15微升TE缓冲液，获得浓缩的脱氧核糖核酸。当准备进行结扎时，在小瓶中加入15微升蒸馏水。
加入1微升的先前退火导导RNA寡核苷酸，1微升BSNB1消化PSB700指南表达载体和2微升10XT4 DNA连体反应缓冲液。然后通过涡流混合此溶液。再次添加一微升DNA连体和涡流。
在 100 次 G 下旋转溶液 15 秒。在夜间室温下孵育反应，确保包括无插入阴性控制反应，单独使用BSNB1消化载体，无需退火导导RNA寡果插入。首先，在零下80摄氏度的储存中去除大肠杆菌，并在冰上解冻5至10分钟。
在合格的大肠杆菌的8微升中加入0.5微升的已准备好的反应混合物。将混合物放在冰上30分钟。在42摄氏度下热击混合物45秒。
然后让混合物在冰上休息两分钟。使用旋转摇床，使用此处列出的 NEB DH5a 或 NEB 稳定条件，恢复 SOC 介质 250 微升中的培养。在此之后，板80微升培养适当的抗生素耐药性利生汤板。
NEB DH5a 在 37 摄氏度下孵育过夜，NEB 稳定在 30 摄氏度下孵育过夜。首先，使用 Phusion GC 特殊 PCR 协议创建文本协议中概述的所需片段。在 1%的加糖凝胶上运行此 PCR 产品，并验证在大约 490 个碱基对上是否看到一个带子。
使用凝胶提取套件切割并提取此 PCR 产品。然后将准备好的 1X 主混合到 PCR 管中。使用多通道移液器以每微升的 40 微升浓度添加 PCR 产品的一微升。
在PSB700矢量的一个微升中，每微升添加40个飞度。使用一微升水代替导导RNA寡核苷酸，包括无插入控制。使用文本协议中概述的金门协议，消化向量并将插入物分给一个反应中。
初始金门反应后，每个反应中加入0.5微升BSNB1酶。在 55 摄氏度下继续反应一小时。当金门反应完成时，继续前文所述大肠杆菌转化过程。
本研究中，使用两种方法成功创建单导RNA表达载体。在第一种方法中，在一系列短寡核苷酸中预先消化和连接向量主干。第二种方法使用金门克隆同时消化和吸收在一个单一的反应。
通过克隆自定义PCR片段成功创建由自身独立启动子驱动的成对引导RNA表达载体。与无插入控制板相比，成功克隆其中任何一种方法都会导致使用适当插入DNA进行转化的菌落明显更多。尝试此过程时，必须记住在克隆步骤中不包含任何插入控件。
按照这个程序，可以执行其他方法，如表观基因组工程，以回答问题，如染色质特征对基因表达的影响。
概述
本文概述了一种简单、高效和经济的方法，用于克隆单引导RNA（sgRNA）表达质粒，以用于CRISPR实验。该技术允许一步克隆和创建配对的引导RNA。
关键研究组成部分
科学领域
- 分子生物学
- 基因工程
- CRISPR技术
背景
- 引导RNA表达质粒对于CRISPR应用至关重要。
- 传统的克隆方法可能耗时且复杂。
- 该方法简化了创建引导RNA载体的过程。
- 它能够同时消化和连接DNA片段。
研究目的
- 提供一个简化的sgRNA克隆协议。
- 展示配对引导RNA创建的效率。
- 促进基因编辑和表观基因组工程的进一步应用。
使用的方法
- 准备引导RNA寡核苷酸和表达载体。
- 使用限制性内切酶消化质粒。
- 使用T4 DNA连接酶连接DNA片段。
- 用连接混合物转化能胀的大肠杆菌。
主要结果
- 成功使用两种方法创建了sgRNA表达载体。
- 观察到适当的插入DNA可增加菌落形成。
- 展示了Golden Gate克隆方法的效率。
- 突出了在实验中包含无插入对照的重要性。
结论
- 该方法为sgRNA克隆提供了一种可靠的方法。
- 它可以提高基于CRISPR的实验效率。
- 未来的应用可能包括染色质特征和基因表达的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient guide RNA cloning is foundational for CRISPR-based target validation and functional genomics in mammalian systems. This streamlined protocol enables rapid generation of single or paired guide RNA vectors, supporting iterative hypothesis testing and mechanistic de-risking in early discovery. Its cost-effectiveness and minimal equipment requirements facilitate broad adoption across R&D teams, accelerating portfolio progression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid construction of guide RNA vectors for gene function interrogation.
- Supports mechanistic de-risking by facilitating targeted genome editing experiments.
- Improves predictive confidence in target validation through efficient CRISPR reagent generation.
- Allows flexible design of single or paired guide RNAs for pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated CRISPR constructs for downstream phenotypic or functional screening.
- Standardizes cloning steps to ensure reproducibility and quantitative output consistency.
- Facilitates assay readiness by enabling quick turnaround of custom guide RNA vectors.
- Supports reliable compound evaluation in gene-edited cellular models.
Translational & Preclinical Research
- Provides continuity from discovery to preclinical studies by enabling precise genome modifications.
- Aligns with translational biomarker strategies through targeted gene perturbation.
- Reduces risk in advancing candidates by clarifying gene function in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This guide RNA cloning protocol fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and functional genomics prior to preclinical model development.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis-driven gene editing for pathway and target validation.
- Screening: Delivers reproducible, validated CRISPR constructs for assay development and screening campaigns.
- Analytics: Provides clear readouts via colony formation and control comparisons to assess cloning success.
- Translational Research: Supports continuity by enabling gene editing in mammalian systems relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, reusable workflow for guide RNA cloning across multiple projects and targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Streamlines cloning with minimal specialized equipment, enhancing reproducibility and scalability for small-scale needs.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and capital-efficient resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by clarifying target biology before preclinical investment.
Implementation Considerations
- Requires standard molecular biology expertise and access to Sanger sequencing for validation.
- Utilizes common laboratory instrumentation and reagents, with no need for specialized equipment.
- Demands cross-team standardization of cloning and validation steps for reproducibility.
- Adaptable to various organisms if compatible guide RNA vectors are available.
- Not suitable for high-throughput library generation; alternative synthesis methods are needed for large-scale applications.
