3D-Rekonstruktion und Analyse dünner subzellulärer neuronaler Strukturen mit Hilfe von Rasterelektronenmikroskopiedaten mit fokussiertem Ionenstrahl

Summary

Eine flexible methodische Pipeline zur Identifizierung, Visualisierung und Quantifizierung dünner subzellulärer neuronaler Prozesse innerhalb von Bildvolumina der fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie unter Verwendung benutzerfreundlicher Open-Source-Softwarepakete.

Abstract

Jüngste Fortschritte in der Rasterelektronenmikroskop-Technologie ermöglichen nun die schnelle dreidimensionale (3D) Analyse ultradünner subzellulärer Prozesse. Hier wird eine methodische Pipeline vorgestellt, um dünne neuronale Prozesse zu identifizieren, zu visualisieren und zu analysieren, wie sie beispielsweise in die präsynaptischen Boutons anderer Neuronen (sogenannte "Spinules") projizieren. Unter Verwendung frei verfügbarer Softwarepakete demonstriert dieses Protokoll, wie ein Entscheidungsbaum verwendet werden kann, um gemeinsame neuronale subzelluläre Strukturen anhand morphologischer Kriterien innerhalb der Bildvolumina der fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) zu identifizieren, mit besonderem Augenmerk auf die Identifizierung einer Vielzahl von Spinuli, die in präsynaptische Boutons projizieren. Insbesondere beschreibt dieses Protokoll, wie Spinulen innerhalb neuronaler Synapsen verfolgt werden können, um 3D-Rekonstruktionen dieser dünnen subzellulären Projektionen, ihrer Elternneuriten und postsynaptischen Partner zu erstellen. Darüber hinaus enthält das Protokoll eine Liste frei verfügbarer Open-Source-Softwareprogramme zur Analyse von FIB-SEM-Daten und bietet Tipps (z. B. Glättung, Beleuchtung) zur Verbesserung von 3D-Rekonstruktionen für die Visualisierung und Veröffentlichung. Dieses anpassungsfähige Protokoll bietet einen Einstieg in die schnelle nanoskalige Analyse subzellulärer Strukturen innerhalb von FIB-REM-Bildvolumen.

Introduction

Untersuchungen zu den Struktur-Funktions-Beziehungen nanometerdünner subzellulärer Bauteile profitieren häufig von der 3D-Visualisierung und -Analyse¹. Transmissionselektronenmikroskopie-Studien mit seriellen Schnitten waren jedoch zeitlich und räumlich durch die Notwendigkeit eingeschränkt, ein Diamantmesser zu verwenden, um Hunderte bis Tausende von seriellen ultradünnen Schnitten von ≥40 nm zu schneiden und auszurichten. Diese Einschränkungen haben die Fähigkeit eingeschränkt, dünne subzelluläre Strukturen (<40 nm Durchmesser) zu beproben und effektiv zu analysieren, und die Notwendigkeit, sich mit ultradünnen seriellen Schnitten vertraut zu machen, hat die Anwendung von 3D-Strukturanalysen behindert ^2,3. Jüngste Fortschritte in der fokussierten Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB-SEM) haben jedoch die Geschwindigkeit und Auflösung der erzielbaren Bildvolumina revolutioniert und ermöglichen nun die quantitative Analyse dünner subzellulärer Strukturen wie glatte endoplasmatische Reticula ^4,5, neuronale Synapsen ^3,6 und synaptische Vesikel ^7,8 in großem Maßstab. Darüber hinaus hat die breitere Nutzung von FIB-REM-Bildvolumina die Entwicklung von frei zugänglichen FIB-SEM-Bildvolumenspeichern⁹ und 3D-Analysesoftware (z. B. Espina¹⁰, IMOD¹¹, Neuromorph¹², Reconstruct¹³, TrakEM¹⁴) beschleunigt, die die Reichweite dieser Technologie erweitern und nun Untersuchungen der Struktur und Funktion feiner subzellulärer Strukturen ermöglichen.

Ein solches nanoskaliges subzelluläres Merkmal ist die neuronale synaptische "Spinule". Spinulen sind dünne (~0,06-0,15 μm breit, 0,1-1 μm lang), fingerartige Fortsätze, die von einem Neuron ausgehen und vom Neurit (z.B. präsynaptischer Bouton) eines anderen Neurons eingekapselt werden^15,16. Spinulen, die in neuronale Prozesse eingebettet sind, werden in der Elektronenmikroskopieliteratur seit fast 60 Jahren berichtet¹⁷, und spinulenähnliche Ausstülpungen sind ein konserviertes 18,19,20 und ubiquitäres^21,22 Merkmal exzitatorischer Synapsen. Trotz der Verbreitung synaptischer Spinulen bleiben ihre Funktion(en) im Dunkeln, und es gibt einen Mangel an notwendigen Daten, um ihre Häufigkeit und strukturelle Konservierung zu erklären. Dieser Mangel an experimenteller Charakterisierung von Spinulen ist hauptsächlich auf die Schwierigkeit zurückzuführen, die Prävalenz und Größe der Spinulen quantitativ zu analysieren. Ihre geringen Abmessungen eignen sich am besten für Analysen mit einer bisher unerreichten z-Auflösung (z. B. ≤15 nm).

Hier wird eine FIB-REM-Analysepipeline zur Identifizierung, Visualisierung und Analyse dünner (mit Querschnitten ≤40 nm breit) subzellulärer Strukturen vorgestellt, die als Einstiegspunkt für FIB-REM-Neulinge und Experten gleichermaßen dienen können. Dieses Protokoll dient als Grundierung für die Identifizierung neuronaler subzellulärer Strukturen innerhalb eines 3D-FIB-REM-Bildvolumens und betont, wie bestimmte Kriterien zur Erkennung und Klassifizierung von Subtypen von Spinulen und Synapsen verwendet werden können. Darüber hinaus demonstriert das Protokoll, wie man Bildvolumina in eine kostenlose 3D-Analysesoftwareplattform (Reconstruct) importiert, diese Software verwendet, um Spinulen in exzitatorischen neuronalen Synapsen zu verfolgen und 3D-Rekonstruktionen dieser subzellulären Projektionen, ihrer Elternneuriten und der Einkapselung präsynaptischer Boutons zu erstellen. Schließlich zeigt das Protokoll, wie man kostenlose, quelloffene 3D-Rendering-Software (Blender) verwendet, um die "Haut" von 3D-Rekonstruktionen für die Visualisierung und mögliche Veröffentlichung zu glätten, und beschreibt die Vorteile und potenziellen Fallstricke dieser Technik.

Protocol

1. Bildvolumendaten und subzelluläre Objektgröße: Überlegungen und Registrierung

1. Erhalten Sie ein qualitativ hochwertiges FIB-REM-Bildvolumen des interessierenden Bereichs, der die subzellulären Objekte von Interesse enthält.
   HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet Segmente eines FIB-REM-Bildvolumens aus dem primären visuellen Kortex eines Frettchens im späten Adoleszenten (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, isotrope Voxel von 4 nm) und ein frei zugängliches FIB-SEM-Volumen aus dem CA1-Hippocampus adulter Ratten (10,2 x 7,7 x 5,3 μm; isotrope Voxel von 5 nm), die vom Knott-Labor zur Verfügung gestellt wurden (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Es ist von entscheidender Bedeutung, Gewebeblöcke für das FIB-REM unter Verwendung eines Protokolls vorzubereiten, das ultrastrukturelle Details bewahrt und unter FIB-REM-Bildgebungsbedingungen einen hohen Kontrast erzeugt^23,24. Wichtig ist, dass das Gewebe so abgebildet wird, dass die resultierende Auflösung des FIB-REM-Bildvoxels <0,5 × der Größe des Durchmessers der kleinsten subzellulären Struktur von Interesse beträgt. Da beispielsweise die Stellen des Spinulusvorsprungs in präsynaptische Boutons einen Durchmesser von nur 30 nm haben können, wäre eine Voxelgröße von <15 nm geeignet, um diese Strukturen oberhalb des Nyquist-Kriteriums zu beproben. Darüber hinaus ist es nützlich, Gewebe mit isotroper (in allen Dimensionen gleichen) Auflösung (z. B. 5 x 5 x 5 nm Voxel) abzubilden, um die Visualisierung und Rekonstruktion feiner Strukturen zu ermöglichen, die in allen x/y/z-Ebenen gleiche Abmessungen haben.
2. Laden Sie die Fidschi-Distribution von ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads) herunter und installieren Sie sie.
3. Richten Sie das Bildvolumen aus.
   HINWEIS: Während moderne FIB-SEM-Systeme grob ausgerichtete Bildvolumina erzeugen, kann die Bild-zu-Bild-Registrierung immer noch unter Subpixeldrift leiden.
   1. Navigieren Sie in Fidschi zu Plugins | Registrierung und wählen Sie Register Virtual Stack Slices aus. Weitere Informationen finden Sie im Benutzerhandbuch (https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). Beginnen Sie mit einer starren Registrierung und verwenden Sie dann bei Bedarf eine affine Technik.
4. Skalieren Sie das Bildvolumen.
   1. Öffnen Sie das ausgerichtete Bildband in Fidschi, indem Sie auf Datei | Importieren | Bildsequenz und navigieren Sie zu dem Ordner mit den ausgerichteten Bildern.
   2. Klicken Sie im Dialogfenster auf Namen numerisch sortieren, wenn die Bilder in numerischer Reihenfolge benannt sind. Klicken Sie auf Virtuellen Stack verwenden , um die Leistung von Fidschi zu beschleunigen.
   3. Sobald das Bild geöffnet ist, klicken Sie auf Bild | Eigenschaften und geben Sie die physische Größe der Pixel des Bildvolumens in Mikrometern in die Felder Pixelhöhe, -breite und -tiefe ein. Geben Sie um OR μm in jedes der Felder ganz rechts ein. Speichern Sie dieses ausgerichtete Bildvolume als .tiff Datei, indem Sie auf Datei | Speichern unter | Tiff.
      HINWEIS: Wenn das Bild skaliert wurde, sollte am oberen Rand des Bildes jetzt die Größe des Bildes in Mikrometern angegeben werden (z. B. 9,82 x 8,65 μm).

2. Identifizierung von Neuriten und synaptischen Spinulen

1. Während Sie durch den Stapel scrollen (mit den Pfeiltasten oder dem Mausrad), beziehen Sie sich auf den Entscheidungsbaum zur Neuritenidentifikation (Abbildung 1) und Beispiele für geschnittene Neuriten (Abbildung 2), um die interessierenden Objekte zu lokalisieren und zu identifizieren.
   1. Identifizieren Sie synaptische Spinulen als membrangebundene Ausstülpungen aus einem Neuriten, der vollständig von einem präsynaptischen oder postsynaptischen Neuriten umhüllt wird.
      ANMERKUNG: Die positive Identifizierung des synaptischen Spinulus erfordert den visuellen Nachweis des Eindringes der Spinule-projizierenden Objektmembran in die invertierte Membran einer präsynaptischen oder postsynaptischen Struktur und das Vorhandensein des membrangebundenen Spinuls, das vollständig von der Membran der prä- oder postsynaptischen Struktur in mindestens einem Bild eingekapselt ist.
2. Erstellung von Regions of Interest (ROIs) in Fidschi
   1. Klicken Sie auf ein entsprechendes Werkzeug in der Fiji-Symbolleiste (z. B. ovales Werkzeug) und klicken und ziehen Sie dann auf das Bild, um einen ROI zu erstellen. Erfassen Sie diesen ROI im ROI-Manager, indem Sie den Buchstaben "T" eingeben.
      HINWEIS: Der ROI-Manager sollte jetzt mit den Bildkoordinaten als Standardnamen angezeigt werden.
   2. Benennen Sie den ROI wie gewünscht um, indem Sie im ROI-Manager auf die Schaltfläche Umbenennen klicken und den gewünschten Namen in das angezeigte Textfeld eingeben. Benennen Sie ROIs basierend auf quantitativen Kriterien um (z. B. könnte der 12^. präsynaptische Bouton, der analysiert wird und zwei Synapsen mit postsynaptischen Dornen hat, B12_s,s genannt werden).
      HINWEIS: Um jeden ROI mit einem "Slice" eines Bildes zu verknüpfen (anstatt es im gesamten Bildstapel zu haben) und um ROI-Namen auf einzelnen Bildern sichtbar zu machen, klicken Sie auf diese Optionen im ROI-Manager | Mehr | Optionen und klicken Sie dann auf die Kontrollkästchen Alle anzeigen und Beschriftungen am unteren Rand des ROI-Managers. Beachten Sie, dass dieser Schritt beim Speichern von ROIs innerhalb eines Bildvolumens von entscheidender Bedeutung ist, da das Verknüpfen von ROIs mit dem gesamten Bildvolumen und nicht mit einzelnen Bildern zu einer Doppelzählung von Objekten innerhalb des Volumens führen kann.
   3. Um alle ROIs, die sich derzeit im ROI-Manager befinden, als Datei zu speichern, klicken Sie zunächst im ROI-Manager auf die Schaltfläche Auswahl aufheben, klicken Sie auf die Schaltfläche Mehr und scrollen Sie nach unten zu Speichern.
      HINWEIS: Diese gespeicherte .zip Datei kann jetzt in Fidschi geöffnet werden, um alle diese ROIs in den ROI-Manager zu laden.

3. Bestimmen Sie den Interessenbereich und übertragen Sie das Bildvolumen an die 3D-Analysesoftware

1. Bestimmen Sie, ob es wünschenswert ist, das gesamte Bildvolumen in die 3D-Rekonstruktions- und Analysesoftware zu übertragen, oder ob ein kleinerer Substack (siehe 3.3.2) erstellt werden soll, um eine kleinere Anzahl von Bildern und/oder Bereich of Interest aus dem ursprünglichen Stack zu analysieren.
2. Führen Sie eine kleine Pilotstudie an einem relativ kleinen Bereich durch, der die interessierenden Objekte enthält, um die Effektstärke und die Anzahl der interessierenden Objekte zu schätzen, die erforderlich sind, um die gewünschte Trennschärfe für statistische Vergleiche zu erhalten. Verwenden Sie eine konservative Schätzung der Größe des Bildvolumens, das für die Probenahme der interessierenden Objekte erforderlich ist, wenn diese subzellulären Objekte ungleichmäßig innerhalb des Bildvolumens verteilt sind.
3. Um einen Teil des Bildvolumens für die 3D-Analyse zu verwenden, duplizieren Sie zunächst das Bildvolumen, indem Sie auf Bild | Duplizieren.
   1. Um einen beschnittenen Teil des Bildes für die Analyse zu verwenden, wählen Sie das Rechteck-Werkzeug aus der Fidschi-Symbolleiste aus und zeichnen Sie den gewünschten Interessenbereich. Wenn dies nicht gewünscht ist, fahren Sie mit dem nächsten Schritt fort.
   2. Gehe zu Bild | Stapel | Werkzeuge | Substack erstellen. Geben Sie den Bereich der Bilder in das Textfeld ein, die in den Teilstapel aufgenommen werden sollen (z. B. Bilder 1 bis 500 durch Eingabe von 1 bis 500).
   3. Beziehen Sie sich auf die obigen Überlegungen zur Stichprobenerstellung (Hinweis nach 1.1), um die erforderliche Z-Auflösung basierend auf der Größe der interessierenden Objekte zu bestimmen. Wenn das Bildvolumen beispielsweise eine Voxeltiefe von 5 nm hat, ist es möglich, das interessierende Objekt in Abständen von 10 nm in der Z-Dimension abzutasten, so dass Fiji jedes andere Bild im Substack behält. Geben Sie dazu die Nummer des n-ten Bildes nach dem Bereich ein (z. B. um nur jedes andere Bild in einem Bildbereich von 1 - 500 Bildern einzuschließen, geben Sie 1 - 500 - 2 ein).
      HINWEIS: Jedes 3D-Analysesoftwarepaket (siehe Tabelle 1) hat seine eigenen Anforderungen an den Dateiimport. Dieses Protokoll konzentriert sich auf das Importieren von Image-Volumes, die als .tiff-Dateien gespeichert sind, in die Image-Volume-Software Reconstruct.

4. 3D Rekonstruktionen und Analysen dünner subzellulärer Strukturen in Reconstruct

HINWEIS: Es ist sehr vorteilhaft, während der Verwendung von Reconstruct eine Maus zu verwenden, die mit einem Rad ausgestattet ist. Wenn die meisten oder alle Leiterbahnen manuell ausgeführt werden, kann die Verwendung eines Stifts zum Zeichnen von Konturen auf einem Computer mit Touchscreen die Leiterbahneffizienz drastisch steigern.

1. Laden Sie Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) herunter und installieren Sie es für die Verwendung auf einem Computer mit Microsoft Windows in einer nativen oder virtuellen Umgebung.
2. Starten Sie eine neue Rekonstruktion, indem Sie einen neuen Ordner für die Rekonstruktionsdateien erstellen, indem Sie auf Serie | Neu und speichern Sie diese Rekonstruktion (.ser-Datei) mit dem gewünschten Dateinamen in dem Ordner, der gerade erstellt wurde.
3. Importieren Sie das gespeicherte .tiff Bildvolume in Reconstruct.
   1. Navigieren Sie zu Serie | Importieren | Images, klicken Sie im Fenster "Images importieren" auf "Auswählen" und suchen Sie die Image-Volume-Datei. Suchen Sie im Fenster "Images importieren" nach den Image-Volume-Dateien, die als separate Zeile für jedes Image auf dem Volume angezeigt werden.
   2. Wichtig: Geben Sie die richtige Pixelgröße in das Textfeld Pixelgröße ein, die der x/y-Pixelgröße (in μm) des Bildvolumens entspricht. Sobald dies erledigt ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Importieren im Fenster Bilder importieren .
      HINWEIS: Nachdem die Bilder importiert wurden, sollte sich in der Mitte des Fensters "Rekonstruieren " ein Bild befinden, und die Liste "Bilder importieren " sollte leer sein.
   3. Wenn sich in der Mitte des Fensters "Rekonstruieren" ein Bild befindet und die Liste "Bilder importieren" leer ist, klicken Sie im Fenster "Bilder importieren" auf "Beenden".
   4. Legen Sie die Schnittdicke (d. h. Voxelhöhe oder Z-Dimension) fest, indem Sie auf Schnitt | Listen Sie Abschnitte auf, markieren Sie alle aufgelisteten Abschnitte und klicken Sie dann auf Ändern | Dicke im Menü Schnittliste und geben Sie die Schnittdicke (in μm) in das Textfeld ein (z. B. 0,005 für einen 5 nm dicken Querschnitt).
      HINWEIS: Denken Sie daran, dass bei der Arbeit mit einem Substack aus einem größeren Original-Bildvolumen, das nur jeden n-ten Abschnitt enthält (siehe Schritt 3.3.3), diese "fehlenden" Abschnitte in der Gesamtschnittdicke berücksichtigt werden müssen. Wenn beispielsweise die Dicke des ursprünglichen Bildvolumenabschnitts (auch bekannt als Voxelhöhe) 0,005 μm betrug und der Substack nur jeden dritten Abschnitt umfasst (z. B. 1-500-3), beträgt die Abschnittsdicke dieses Substacks 0,015 μm (d. h. 0,005 μm x 3 Abschnitte).
4. Machen Sie Spuren von den interessanten Objekten.
   1. Zur Serie | Optionen | Registerkarte Namen/Farben, um dem neuen Objekt einen Namen zu geben. Wählen Sie eine Farbe für den Umriss und die innere Füllung der Leiterbahnen des Objekts aus, und klicken Sie dann auf OK.
      HINWEIS: Bei der Funktion "Rekonstruieren " wird versucht, alle Leiterbahnen mit dem gleichen Namen wie ein Objekt zu verbinden. Lesen Sie das Reconstruct-Handbuch für Trace-Namenskonventionen (z. B. keine Leerzeichen in Namen einfügen). Kurvenfarben dienen lediglich zur Visualisierung von Ablaufverfolgungen. Die Farbe der 3D-Rekonstruktion dieses Objekts kann später leicht geändert werden.
   2. Wählen Sie in der Symbolleiste das Freihandzeichen-Werkzeug aus, das wie ein Bleistift aussieht. Halten Sie die linke Maustaste gedrückt und ziehen Sie die Maus, um die Membran des Objekts nachzuzeichnen. Lassen Sie die linke Maustaste los, um die Ablaufverfolgung automatisch zu vervollständigen. Klicken Sie auf Bild auf / Bild ab oder verwenden Sie das Mausrad, um zum nächsten optischen Abschnitt des Bildvolumens zu gelangen und nach und nach Spuren zu erstellen, bis die Struktur vollständig ist.
5. Spur synaptischer Spinulen
   HINWEIS: Eingebettete Spinulen in präsynaptischen Boutons erscheinen als membrangebundene transparente Strukturen, gelegentlich mit aktinähnlichem, elektronenundurchsichtigem Material und/oder membranartigen Falten in ihrem Inneren.
   1. Bewegen Sie sich durch das Bildvolumen und lokalisieren Sie die Stelle der Spinulinvagination in den präsynaptischen Bouton, wobei Sie darauf achten, Spinulen von endoplasmatischen Retikula, Vakuolen, Endosomen, Autophagosomen und anderen subzellulären Organellen zu unterscheiden.
      HINWEIS: Im Gegensatz zu membrangebundenen Organellen ist darauf zu achten, dass synaptische Spinulen immer aus einem Neuriten/einer Glia (d. h. einer umgedrehten Membran) hervorragen und von einer prä- oder postsynaptischen Struktur (d. h. einer umgekehrten Membran) aufgenommen werden. Dieser visuelle Nachweis einer Spinul-Invagination sollte in ≥2-Bildern auftreten, und in ≥1-Bild sollte ein vollständig verkapselter, membrangebundener Spinulus innerhalb der prä- oder postsynaptischen Struktur vorhanden sein. Kleine Spinula können Clathrin-beschichtet sein. Um Spinulin-Einstechlingsereignisse von Clathrin-beschichteter Endozytose in den prä- oder postsynaptischen Neuriten zu unterscheiden, stellen Sie sicher, dass eine positive Identifizierung von Clathrin-beschichteten Spinulen eine visuelle Bestätigung der zusammenfallenden Umkehrmembran vom Spinulus-Elternobjekt erfordert, die in die Umkehrmembran einer prä- oder postsynaptischen Struktur innerhalb desselben Bildes projiziert wird.
   2. Bewegen Sie sich durch das Bildvolumen, um die Stelle der Spinule-Projektion/des Ursprungs von ihrem Mutterneuriten/ihrer Glia zu lokalisieren; In Abbildung 1 und Abbildung 2 finden Sie weitere Informationen zur Identifizierung dieser übergeordneten Strukturen.
   3. Beginnen Sie mit der Spur des Spinulus an der Stelle des Membranvorsprungs in die aufnehmende Struktur (z. B. präsynaptischer Bouton) und fahren Sie mit dem Zeichnen des Spinulus so lange fort, wie er als membrangebundene Struktur innerhalb des verkapselnden prä- oder postsynaptischen Neuriten erscheint.
   4. Halten Sie weiterhin die linke Maustaste gedrückt (oder zeichnen Sie mit einem Stift entlang der Spinulusmembran, wenn Sie einen Touchscreen-Computer verwenden), während Sie die Membran der Spinulus mit dem Mauszeiger nachzeichnen.
   5. Wenn der Punkt erreicht ist, an dem der Trace gestartet wurde, lassen Sie die linke Maustaste los.
      HINWEIS: Wenn Sie die linke Maustaste zu früh loslassen, wird die Ablaufverfolgung automatisch vervollständigt, oft mit unerwünschten Ergebnissen. In diesem Fall klicken Sie einfach auf Löschen , während diese Ablaufverfolgung in der Ablaufverfolgungsliste hervorgehoben ist.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 4.5.2 bis 4.5.5 für jeden Abschnitt, in dem das Spinule erscheint.
      HINWEIS: Denken Sie daran, den Spinulus gegebenenfalls als eingekapselte, membrangebundene Struktur innerhalb des Boutons zu verfolgen. Da Reconstruct die automatische Subtraktion von verkapselten subzellulären Strukturen (z. B. Spinuli, subzelluläre Organellen) vom Volumen der Verkapselungsstruktur nicht zulässt, kann dies post-hoc durchgeführt werden (z. B. durch einfaches Subtrahieren des Spinulusvolumens vom Gesamtvolumen des präsynaptischen Boutons).
6. Rekonstruieren von Objekten in 3D in Reconstruct
   1. Navigieren Sie zu Serie | Optionen | 3D, und stellen Sie sicher, dass das Optionsfeld Ablaufverfolgungen angeklickt ist.
   2. Öffnen Sie die Objektliste, indem Sie auf Objekte | Objekte auflisten.
   3. Sobald die Namen der verfolgten Objekte in das Fenster geladen werden, doppelklicken Sie auf den Namen der Objekte in der Objektliste , um sie in 3D anzuzeigen. Warten Sie, bis das Fenster "3D-Szene" angezeigt wird.
   4. Stellen Sie sicher, dass der Start, das Ende und die Anzahl der Ablaufverfolgungen in der Objektliste für jedes Objekt korrekt sind, sodass Count = End - Start ist. Wenn Count ≠ End - Start für ein Objekt vorhanden ist, wurden möglicherweise versehentlich eine oder mehrere Ablaufverfolgungen von diesem Objekt weggelassen.
   5. Drehen Sie die 3D-Spuren des Objekts/der Objekte, indem Sie die linke Maustaste gedrückt halten und die Maus bewegen und/oder die rechte Maustaste gedrückt halten und die Maus vorwärts und rückwärts bewegen, um hinein- und herauszuzoomen. Stellen Sie sicher, dass die Ablaufverfolgungen des Objekts ordnungsgemäß ausgerichtet sind und dass zwischen den nachfolgenden Ablaufverfolgungen ein fließender Übergang zu bestehen scheint.
   6. Verfolgen Sie bei Bedarf einzelne Leiterbahnen nach, um Fehler zu entfernen, die zu scharfen Kanten und/oder Übergängen zwischen den Leiterbahnen führen.
   7. Platzieren Sie eine tetraedrische Netzhaut auf dem Objekt, indem Sie zu Serie | Objekt | Registerkarte 3D und klicken Sie auf das Optionsfeld Boissonnat-Oberfläche .
   8. Klicken Sie im Fenster 3D-Szene auf Szene | Deaktivieren Sie die Option und doppelklicken Sie dann auf den gewünschten Objektnamen in der Objektliste.
   9. Drehen Sie die Objekte, um fließende Übergänge zwischen den Leiterbahnen zu gewährleisten, und zeichnen Sie die Leiterbahnen bei Bedarf neu.
   10. Um die Objektfarben und die Transparenz zu ändern, klicken Sie in der Objektliste auf den Namen des Objekts und dann auf Szene | Farbe/Transparenz... im Menü Objektliste . Doppelklicken Sie auf den Objektnamen in der Objektliste , um diese Änderung im 3D-Szenenfenster anzuzeigen.
       HINWEIS: Objektfarbe, Transparenz und Glättung können mit Blender mit einem höheren Maß an Kontrolle und Spezifität geändert werden (siehe 5.4-5.6).
7. Quantitative Analyse von 3D-Objekten
   1. Navigieren Sie zu Serie | Optionen | Listen und klicken Sie auf alle gewünschten Messungen in den Abschnitten Objektliste und Trace-Liste dieses Fensters.
   2. Exportieren Sie die Objektmaße, indem Sie die Objektliste öffnen (Menüpunkt Objekt | Objekte auflisten...) und klicken Sie dann auf Liste | Speichern.
   3. Speichern Sie die Objektmaße, wie sie in der Objektliste angezeigt werden, als kommagetrennte Datei (.csv).
   4. Importieren Sie die .csv Datei in die Datenanalysesoftware Ihrer Wahl. Um in eine Tabelle (z. B. Microsoft Excel) zu importieren, doppelklicken Sie einfach auf die Datei oder öffnen Sie eine neue leere Arbeitsmappe, klicken Sie auf Datei | Importieren | CSV-Datei und folgen Sie den Anweisungen.
   5. Um die Abstände zwischen Objekten in 3D zu messen (z. B. um den Projektionsabstand eines synaptischen Spinulus innerhalb eines präsynaptischen Boutons zu messen), verwenden Sie die Z-Trace-Funktion in Reconstruct.
   6. Geben Sie zunächst der Ablaufverfolgung einen neuen Namen, indem Sie zur Schaltfläche Serie | Optionen | Registerkarte Namen/Farben und Eingabe eines Namens für die Z-Spur.
   7. Klicken Sie anschließend auf das Z-Trace-Werkzeug in der Symbolleiste.
   8. Um die Z-Spur des Projektionsabstands eines synaptischen Spinulus zu zeichnen, klicken Sie mit der linken Maustaste auf den Anfang des synaptischen Spinulus und drücken Sie dann die Bild-auf- oder Bild-ab-Tasten , um durch das Bildvolumen zu blättern, während Sie auf aufeinanderfolgende Punkte entlang der Membran des synaptischen Spinulus innerhalb jedes Abschnitts klicken.
   9. Schließen Sie diesen Z-Trace ab, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken.
   10. Exportieren Sie Z-Trace-Messungen, indem Sie auf Trace | Traces auflisten... , um die Trace-Liste aufzurufen , und klicken Sie dann auf Liste | Speichern , um die Messungen der Trace-Liste als .csv Datei zu speichern.
8. Hinzufügen eines Würfels "Skalieren"
   1. Navigieren Sie zu einem der ersten oder letzten Bilder im Stack
   2. Zur Serie | Optionen | Registerkarte Namen/Farben, und geben Sie einen Namen für den Maßstabswürfel ein.
   3. Wählen Sie in der Symbolleiste das Werkzeug Rechteck zeichnen aus und zeichnen Sie ein kleines Quadrat (Größe unwichtig) neben die Objekte, ohne sie jedoch zu verdecken. Zur Serie | Optionen | Registerkarte 3D, klicken Sie auf das Optionsfeld Box im Bereich Generieren und geben Sie die Größe des Maßstabswürfels (in μm) an, indem Sie seine Abmessungen in die Felder A:, B:, C: im Bereich Größe eingeben (geben Sie z. B. 0,5 für A, B und C ein, um einen Würfel mit 0,5 μm/Seitenmaßstab zu erzeugen).
      HINWEIS: Bevor Sie versuchen, den maßstabsgetreuen Würfel in 3D zu rekonstruieren, stellen Sie sicher, dass die gewünschten 3D-Objekte bereits in der 3D-Szene mit der Option Leiterbahnen oder Boissonnat-Oberfläche rekonstruiert sind. Denken Sie daran, die Option Generieren wieder auf Boissonnat-Fläche und die Größen von A, B und C wieder auf -1 zu ändern, nachdem Sie den Skalenwürfel rekonstruiert haben (d.h. nach Schritt 4.8.5).
   4. Öffnen Sie die Objektliste und doppelklicken Sie auf den Namen des Maßstabswürfels. Warten Sie, bis der Maßstabswürfel im 3D-Szenenfenster angezeigt wird.
   5. Um den Maßstabswürfel relativ zu den anderen Objekten zu verschieben, gehen Sie zu Reihe | Optionen | 3D-Registerkarte und geben Sie die gewünschte Anzahl von μm ein, um den Skalenwürfel in die Felder X, Y und/oder Z zu verschieben. Klicken Sie auf OK, um das Fenster zu schließen, und doppelklicken Sie dann in der Objektliste auf den Namen des Maßstabswürfels.
      HINWEIS: Alternativ kann dies auch mit Blender erfolgen (siehe unten).

5. Importieren, Umfärben, Glätten und Hinzufügen von Transparenz zu 3D-Rekonstruktionen in Blender

HINWEIS: Für detaillierte Unterstützung bei der Verwendung von Blender konsultieren Sie bitte das Blender-Handbuch und/oder die unzähligen Anleitungsvideos zur Verwendung der einzelnen Blender-Funktionen (führen Sie einfach eine Websuche nach Blender UND der gewünschten Funktion durch). Im Folgenden finden Sie eine kurze Einführung in das Umfärben, Glätten und Hinzufügen von Transparenz zu 3D-Rekonstruktionen.

1. Laden Sie die neueste Version von Blender, der kostenlosen Open-Source-3D-Software-Suite (www.blender.org), herunter und installieren Sie sie.
2. Speichern Sie in Rekonstruieren die 3D-Rekonstruktionen, indem Sie die gewünschten Objekte im 3D-Szenenfenster aufrufen und dann auf Szene | Exportieren als | VRML 2.0.
3. Navigieren Sie in Blender zu Datei | Importieren | X3D Extensible 3D (.x3d/.wrl). Klicken Sie auf die VRML 2.0-Datei, die aus Reconstruct gespeichert wurde, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche X3D/VRML2 importieren .
4. Färbe die Rekonstruktionen neu ein.
   1. Klicken Sie im Fenster Szenensammlung in der oberen rechten Ecke, um das Augensymbol für das Standard-Cube-Objekt zu deaktivieren/deaktivieren, und klicken Sie auf die Namen der einzelnen Objekte, um jedes Objekt in der Szene hervorzuheben. Benennen Sie diese Objekte entsprechend um.
   2. Klicken Sie auf den Namen des ersten Objekts, das im Fenster Szenensammlung neu eingefärbt werden soll.
   3. Klicken Sie auf das zirkuläre Context. Materialsymbol am unteren Rand des rechten Symbolstreifens, und klicken Sie dann auf Material hinzufügen. Eine Liste der Optionen sollte unten angezeigt werden. Klicken Sie anschließend auf die Leiste neben der Option Grundfarbe und wählen Sie die gewünschte Luminanz und den gewünschten Farbton für das Objekt aus.
   4. Um das metallische Aussehen, den Glanz und die Reflexionseigenschaften des Objekts zu ändern, passen Sie die Optionen "Metallisch", "Glanzlicht", "Rauheit" und "Glanz " an, um den gewünschten Effekt zu erzielen.
      HINWEIS: Damit bestimmte Optionen in der Szene angezeigt werden (z. B. Transparenz, Glanz), kann es erforderlich sein, dass Sie sich in der Einstellung Ansichtsfensterschattierung: Look Dev oder Ansichtsfensterschattierung: Gerendertes Ansichtsfenster befinden. Um zu einer der beiden Ansichtsfenstereinstellungen zu wechseln, bewegen Sie den Mauszeiger über die Globussymbole oben rechts und klicken Sie auf die gewünschte Ansichtsfenstereinstellung.
   5. Um den Beleuchtungswinkel zu ändern, klicken Sie im Fenster Szenensammlung auf das Lichtobjekt, klicken Sie oben rechts auf das Symbol Gizmo anzeigen und ziehen Sie dann das Licht um die Szene, um den gewünschten Lichteffekt zu erzielen. Ändern Sie die Lichtintensität im Fenster "Objektdaten", das unter dem Fenster "Szenensammlung" angezeigt wird, wenn das Lichtobjekt ausgewählt ist.
   6. Um Objekte in ausgewählten Achsen separat zu drehen, klicken Sie auf die Namen der Objekte im Fenster Szenensammlung , drücken Sie die Taste R , klicken Sie dann auf den Buchstaben der Rotationsachse (x-, y- oder z-Taste ) und bewegen Sie die Maus, um die gewünschte Drehung zu erzeugen. Um Objekte zu greifen und zu verschieben, wählen Sie sie im Fenster Szenensammlung aus, drücken Sie die G-Taste, und verwenden Sie dann die Maus, um Objekte in der Szene zu verschieben.
5. Remesh (d.h. glätten) Sie die Rekonstruktionen.
   1. Klicken Sie im Fenster Szenensammlung auf den Namen des gewünschten Objekts und verwenden Sie dann den Gimball und das Mausrad, um das Objekt zu zentrieren und zu vergrößern.
   2. Klicken Sie auf das Schraubenschlüsselsymbol Context.Modifiers auf der rechten Symbolleiste, klicken Sie auf Modifizierer hinzufügen, und klicken Sie dann auf Neu vernetzen (unter der Überschrift Generieren ). Verwenden Sie das Dropdown-Menü, um Glatt auszuwählen, klicken Sie auf die Schaltfläche Glatte Schattierung und ändern Sie die Octree-Tiefe und -Skalierung , um die gewünschte Glätte zu erzielen.
      HINWEIS: Es ist hilfreich, sich während der Neuvernetzung im Fenster Ansichtsfensterschattierung: Drahtmodell (Option für das Globussymbol oben rechts) zu befinden, um die Ergebnisse direkt anzuzeigen. Durch die Neuvernetzung werden Tetraedernetze unterschiedlicher Größe auf dem Objekt erstellt. Achten Sie beim Glätten des Objekts, um Schnitt- oder Nachzeichnungsartefakte zu entfernen, darauf, dass die ursprüngliche Form und die ursprünglichen Konturen beibehalten werden. Beginnen Sie mit einer Octree-Tiefe = 7 und einer Skala = 0,95 und verringern Sie diese Zahlen dann bei Bedarf langsam. Achten Sie besonders auf kleine, dünne Objekte wie Spinulen und postsynaptische Dichten, da das kleine Volumen dieser Objekte den Bereich der Glättung verringert, der ohne Veränderung ihrer ursprünglichen Form durchgeführt werden kann.
6. Fügen Sie Objekten Transparenz hinzu.
   HINWEIS: Objekte transparent zu machen ist wichtig, wenn es wünschenswert ist, die 3D-Beziehung eines Objekts (z. B. Spinuli, präsynaptische Vesikel, Mitochondrien, Endosomen) zu zeigen, das sich in einem anderen Objekt befindet (z. B. ein präsynaptischer Bouton).
   1. Klicken Sie auf den gewünschten Objektnamen im Fenster Szenensammlung . Scrollen Sie zum Ende des Kontexts. Materialfenster (Symbol unten rechts in der rechten Liste), öffnen Sie den Abschnitt Einstellungen und verwenden Sie das Dropdown-Menü, um den Mischmodus in Alpha-Überblendung zu ändern. Öffnen Sie als Nächstes den Abschnitt Oberfläche , scrollen Sie nach oben zu Alpha, und ändern Sie die Zahl in einen Wert kleiner als eins (1 = vollständig undurchsichtig, 0 = vollständig transparent).
7. Exportieren Sie Schnappschüsse der 3D-Rekonstruktionen.
   1. Sobald Sie die optimale Farbgebung, Glättung und Beleuchtung für die 3D-Rekonstruktionen erhalten haben, speichern Sie das Bild in der Szene, indem Sie auf die Menüüberschrift Fenster klicken und Screenshot speichern auswählen.
   2. Wählen Sie in den Optionen "Screenshot speichern " unten links den Dateityp, das Farbformat und die gewünschte Komprimierung aus.
   3. Geben Sie den Namen für den neuen Screenshot in das Textfeld Dateiname oben ein, und speichern Sie den Screenshot dann am gewünschten Speicherort.

Results

Quantifizierung des Prozentsatzes synaptischer Spinulen innerhalb der exzitatorischen präsynaptischen Bouton-Population im primären visuellen Kortex von Frettchen
Obwohl spinulenartige Ausstülpungen von Neuriten in exzitatorische präsynaptische Boutons seit Jahrzehnten beobachtet werden^19,26, ist ihre potentielle Bedeutung für die synaptische Funktion bisher unklar geblieben. Diese Experimente wurden entwickelt, um den Anteil exzitatorischer p...

Discussion

Diese FIB-REM-Pipeline zur Bildvolumenanalyse kann zuverlässige 3D-Rekonstruktionen und quantitative Messungen dünner subzellulärer Strukturen erstellen. Während derzeitige halbautomatische Techniken, die tiefe neuronale Netze und Segmentierungsalgorithmen verwenden, die Geschwindigkeit und Effizienz bei der Rekonstruktion zellulärer Strukturen mit relativ hohem Membrankontrast innerhalb großer Bildvolumina erhöhen können³³, werden viele subzelluläre Strukturen (z...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fidschi (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruct			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https:/www.blender.org