Ein mehrfarbiges 3D-STORM-Hochauflösungs-Visualisierungsprotokoll für Kollagenmineralisation in selbstassemblierten rekombinanten Typ-I-Kollagenfibrillen

Summary

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Unterscheidung intrafibrillärer von extrafibrillärer Mineralisation in rekombinanten Kollagenfibrillen mittels multicolor 3D-STORM, wobei optimierte Markierung, Bildgebung und quantitative Kolokalisationsanalyse integriert werden.

Abstract

Dieses Protokoll beschreibt eine mehrfarbige dreidimensionale stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopiemethode (3D-STORM) zur nanoskaligen Visualisierung der Kollagenmineralisierung in einem rekombinanten Typ-I-Kollagen-selbstassemblierten Fibrillenmodell. Die Methode ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung von Kollagen-, nicht-kollagenen Proteinen (z. B. Chondroitinsulfat) und Calciumphosphatmineralphasen. Die Probenvorbereitung beinhaltet Aminosilanisierung und Kollagenselbstassemblierung, gefolgt von einer Mineralisierung mit einem Calciumphosphatmedium, das in einem frühen Stadium (30 Minuten) amorphes Calciumphosphat (ACP) bildet und nach 6 Stunden zu Hydroxyapatit (HAP) reift. Anschließend wird eine Multiplex-Immunfluoreszenz-Markierung durchgeführt, und die Proben werden zunächst mittels Konfokalmikroskopie vor der 3D-STORM-Bildaufnahme mit einem sauerstoffabnehmenden Bildpuffer bewertet. Die Datenverarbeitung und -analyse erfolgen mit öffentlich verfügbarer Software. Im Vergleich zur herkömmlichen Elektronen- oder Konfokalmikroskopie kombiniert dieses Protokoll molekulare Spezifität mit nanoskaliger Auflösung (typische laterale Präzision 20–30 nm, axial 50–60 nm) und ermöglicht so eine dreidimensionale Visualisierung intrafibrillärer versus extrafibrillärer Mineralisationsmuster. Repräsentative Ergebnisse zeigen eine klare Visualisierung von Kollagennetzwerken, zugehörigen nicht-kollagenen Proteinen und mineralischen Phasen im dreidimensionalen Raum. Quantitative Kennzahlen, darunter Pearsons Korrelationskoeffizient (0,89 ± 0,04) und Manders' Überlappungskoeffizient (0,91 ± 0,03), sind im Ergebnisbereich angegeben. Dieses Protokoll bietet ein leistungsstarkes Werkzeug für Forscher in der Biomaterialwissenschaft, Biomineralisierung und Knochengewebetechnik, die nanoskalige Einblicke in die Mineralisationsdynamik benötigen.

Introduction

Kollagenmineralisierung ist ein grundlegender biologischer Prozess, der entscheidend für die Bildung harter Gewebe wie Knochen und Zähne^ist. Die komplexe Struktur der Kollagenfasern, verbunden mit einer fein abgestimmten Regulierung der Mineralablagerung, verleiht diesen Geweben bemerkenswerte mechanische Festigkeit und strukturelle Integrität². Kollagen dient nicht nur als passives Gerüst, sondern als aktiver Teilnehmer, der eine präzise Mineralablagerung durch komplexe molekulare und physikalische Wechselwirkungen orchestriert^. Die Aufklärung dieser Mechanismen ist entscheidend, um pathologische Erkrankungen wie Osteoporose und Karies zu verstehen und biomimetische Materialien für regenerative Therapien zu entwickeln⁴.

Der Durchmesser der Kollagenfasern in harten Geweben reicht von etwa 50 bis 100 nm, wobei Hydroxyapatitpartikel (HAP) noch kleiner sind (typischerweise 2–5 nm dick und 20–30 nm lang) und innerhalb fibrillarer^{Lücken 5} eingebettet sind. Während Gap Zones als Keimationsstellen fungieren können, bilden sich in nativen Geweben zunächst Minerale in interfibrillaren Räumen und dehnen sich anschließend in intrafibrillare Kompartimente aus. Traditionelle Charakterisierungsmethoden umfassen histologische Färbung, konfokale Laserrastermikroskopie ^6,7 und Elektronenmikroskopie ^8,9. Die histologische Färbung bietet eine makroskopische Bewertung, kann aber keine nanoskaligen Mineralisierungszustände bewerten. Die konfokale Mikroskopie ermöglicht die Beobachtung spezifischer Komponenten, ist jedoch beugungsbeschränkt (~200 nm lateral) und kann die intrafibrillare versus extrafibrillare Mineralisierung^{10 nicht} unterscheiden. Die Elektronenmikroskopie bietet eine hohe Auflösung, besitzt jedoch keine molekulare Spezifität. Obwohl die Immungold-Markierung molekulare Spezifität für die Elektronenmikroskopie bieten kann, erfordert sie eine spezialisierte Verarbeitung und ist weniger geeignet für multiplexierte, dreidimensionale Visualisierung mehrerer Komponenten als STORM und erfordert lange experimentelle Zyklen und hohe Kosten¹¹.

Die stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) überwindet die Beugungsgrenze, indem sie einzelne Fluorophore mit hoher Präzision lokalisiert und eine laterale Auflösung^{von ~}20 nm erreicht. Im Vergleich zu anderen Superauflösungstechniken wie der Stimulated Emission Depletion (STED)^{13-Mikroskopie}und der strukturierten Beleuchtungsmikroskopie (SIM)¹⁴ bietet STORM eine höhere Lokalisationsgenauigkeit (~20 nm seitlich und ~50 nm axial) und ist mit einem größeren Spektrum organischer Fluorophore kompatibel. Insbesondere benötigt STED spezialisierte Farbstoffe und hohe Laserleistungen, die biologische Proben beschädigen können, während SIM nur eine Auflösung von ~100 nm bietet, was nicht ausreicht, um fibrilllskalierte (50–100 nm) Merkmale aufzulösen. STORM bietet ein praktisches Gleichgewicht zwischen Auflösung, Multiplexing-Fähigkeit und Sample-Kompatibilität. Veröffentlichte Richtlinien haben standardisierte Testproben beschrieben, um die Optimierung der STORM-Bildaufnahmeparameter und die Auflösungsbewertung^zu erleichtern. In Kombination mit dreidimensionalen Bildgebungsfunktionen ermöglicht 3D-STORM die nanoskalige Visualisierung mehrerer Komponenten^{gleichzeitig 16}. Jüngste Fortschritte haben STORM auf Multicolor- und Multiplex-Bildgebung ausgeweitet, wodurch die Visualisierung mehrerer Ziele innerhalb derselben Stichprobe^{ermöglicht 17,18}.

Dieses Protokoll verwendet ein biomimetisches In-vitro-Modell, das auf selbstassemblierten rekombinanten Typ-I-Kollagenfibrillen basiert und ist explizit für in vitro rekombinante Typ-I-Kollagen-selbstassemblierte Fibrillenmodelle konzipiert, um intrafibrillare von extrafibrillären Mineralisationen auf Nanoskala zu unterscheiden. Es ist für die Bildgebung von lebenden Zellen nicht geeignet, da STORM feste Proben und sauerstoffabnehmende Puffer benötigt. Es ist auch nicht geeignet für natürliche, hochmineralisierte Gewebe (z. B. reife Knochen) ohne vorherige Dekalkifikation oder Antigengewinnung. Wenn nur die Gesamtmineraldichte oder die Morphologie großer Flächen bewertet werden muss, ist konventionelle Konfokal- oder Elektronenmikroskopie effizienter.

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen standardisierten, schrittweisen Workflow für die Verwendung von mehrfarbigem 3D-STORM bereitzustellen, um die nanoskalige Verteilung von Mineralien und nicht-kollagenen Proteinen innerhalb einzelner Kollagenfibrillen zu visualisieren, mit besonderem Schwerpunkt auf der Unterscheidung intrafibrillärer von extrafibrillärer Mineralisierung. Dieses Protokoll integriert optimierte Immunkennzeichnung mit einem maßgeschneiderten Bildpuffer, um die gleichzeitige Verfolgung mehrerer organischer Komponenten (Kollagen, nicht-kollagene Proteine) und anorganischer Phasen (ACP, HAP) in drei Dimensionen¹⁹ zu ermöglichen. Eine wichtige Innovation ist die quantitative Bewertung intrafibrillärer versus extrafibrillärer Mineralisationsmuster. Die Quantifizierung erfolgt durch zwei unabhängige Kriterien: (1) Berechnung des Pearsonschen Kolokalisierungskoeffizienten zwischen den Mineralkanälen (ein Kalziumindikatorfarbstoff (z. B. Calcein)) und dem Kollagenkanal (ein weitroter fluoreszierender Farbstoff) mittels des Kolokalisationsmoduls in Bildanalysesoftware (Koeffizient >0,8 zeigt eine starke Assoziation an); (2) Analyse der Persistenz des mineralischen Signals über Z-Schnitte einzelner Fibrillen: Wenn mineralisches Signal in zentralen Schnitten (Z = 0 bis ±120 nm vom vertikalen Zentrum des Fibrils) bei Intensität ≥50 % des Maximums vorhanden ist, wird es als intrafibrillär klassifiziert. Im Gegensatz zur herkömmlichen Elektronen- oder Konfokalmikroskopie kombiniert dieses Protokoll molekulare Spezifität mit nanoskaliger Auflösung und ermöglicht so eine dreidimensionale räumliche Verteilung der intrafibrillaren Mineralisierung.

Dieses Protokoll ist für Forscher in der Biomaterialwissenschaft, Biomineralisierung und Knochengewebetechnik konzipiert und benötigen nanoskalige Einblicke in die Mineralisationsdynamik. Das standardisierte Verfahren kann auch angepasst werden, um andere mineralisierte Kollagensysteme wie demineralisierte Dentinscheiben oder kollagenbasierte Hydrogele zu untersuchen, indem die anfänglichen Probenvorbereitungsschritte entsprechend angepasst werden.

Protocol

Alle Experimente mit biologischen Proben wurden gemäß den Richtlinien und Vorschriften der Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine, durchgeführt und vom Institutional Biosafety Committee genehmigt (Genehmigungszertifikat Nr. BSL20235710079). Das hier beschriebene experimentelle Protokoll verwendet kommerziell gewonnene Reagenzien und in vitro biomimetische Systeme. Es sind keine menschlichen Teilnehmer, Tierprobanden oder menschliche Gewebeproben beteiligt und benötigen daher keine ethische Genehmigung durch ein institutionelles Prüfungsgremium.

VORSICHT: Alle Verfahren, die gefährliche Chemikalien betreffen, müssen in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (Laborkittel, Handschuhe, Schutzbrille) durchgeführt werden. Entsorgen Sie chemische Abfälle gemäß institutionellen Vorschriften. Für NaN₃ sammeln Sie Abfälle in einem speziellen Behälter mit der Aufschrift "Azidabfall" und vermischen Sie ihn nicht mit Säuren (Risiko von explosivem Gas). Bei Glutaraldehyd wird vor der Entsorgung mit 10 % überschüssigem Natriumbisulfit inaktiviert. Für β-Mercapttoethanol oxidieren Sie mit Bleichmittel (1:10 v/v) für 1 Stunde vor der Entsorgung.

HINWEIS: Die Immunfluoreszenz-Markierung MUSS VOR der Mineralisation durchgeführt werden, um eine Epitope-Maskierung durch Mineralablagerungen zu vermeiden. Für Anwendungen, die eine Postmineralisierungsmarkierung erfordern, kann eine Antigengewinnung erforderlich sein.

1. Herstellung des Mineralisationsmediums

1. Herstellung eines Mineralisierungsmediums für rekonstituierte Kollagenfibrillen
   1. Stellen Sie eine Calciumfondlösung vor, indem Sie 100 μL 5 mg/mL Polyaspartinsäure (p-Asp, Mw 9-11 kDa) tropfweise zu 5 mL 3,44 mM CaCl₂-Lösung in einem 15 mL konischen Rohr hinzufügen.
   2. Wirbelvermischung im Rohr für 30 Sekunden, bis es homogen ist.
   3. P-Asp langsam hinzufügen und gründlich mischen, um amorphes Calciumphosphat (ACP) zu stabilisieren.
   4. Fügen Sie 5 ml Phosphatlösung (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) zur Calciumlösung hinzu.
   5. Wirbelmischung für 1 Minute.
      HINWEIS: Endkonzentrationen nach dem Mischen: 1,67 mM CaCl₂, 9,5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl und 50 μg/mL p-Asp.
   6. Bereiten Sie das Mineralisationsmedium unmittelbar vor der Anwendung vor. Nicht aufbewahren; Verwenden Sie sofort den instabilen ACP-Vorläufer, um konsistente Ergebnisse zu erzielen.
      HINWEIS: Lagerung führt zu vorzeitiger Kristallisation.
2. Herstellung von Mineralisationsmedium für Kollagengele/demineralisiertes Dentin
   1. Stellen Sie eine calciumhaltige Lösung vor, indem Sie 8,77 g NaCl, 0,01 g NaN₃, 6,06 g Tris und 1,11 g CaCl₂ in 800 mL deionisiertem Wasser auflösen.
   2. Erhöhen Sie das Volumen mit deionisiertem Wasser auf 1 Liter.
   3. Fügen Sie 350 μg/mL Polyacrylsäure (PAA, Mw ~1800) zur calciumhaltigen Lösung hinzu.
   4. Vortex für 1 Minute.
      HINWEIS: Verwenden Sie PAA anstelle von p-Asp für eine bessere Stabilisierung bei höheren Kalziumkonzentrationen.
   5. Stellen Sie eine Phosphatlösung vor, indem Sie 0,85 g Na��HPO₄ in 1 L deionisiertem Wasser lösen, um 6 mM Na₂HPO₄ zu erhalten.
   6. Filtersterilisieren Sie die Phosphatlösung mit einer 0,22-μm-Membran.
   7. Kombinieren Sie gleiche Mengen (z. B. je 500 ml) Calcium- und Phosphatlösungen mit magnetischem Rühren bei 300 U/min.
   8. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 mit 1 M HCl oder NaOH ein, während Sie mit einem pH-Messgerät messen.
      HINWEIS: Halten Sie den pH-Wert bei 7,4 ± 0,1. Erlaubt keine pH-Abweichungen >0,2, die eine vorzeitige Kristallisation verursachen.

2. Herstellung rekombinanter Kollagenfasern

1. Aminosilanisierung von Glasbodenschalen
   HINWEIS: Diese Behandlung verwendet (3-Aminopropyl-)Triethoxysilan (APTES), um positiv geladene Aminogruppen (-NH₂) auf die Glasoberfläche einzuführen, was die elektrostatische Adsorption und Stabilisierung negativ geladener Kollagenmonomere fördert.
   1. Fügen Sie 200 μL APTES-Lösung (5 % v/v in absolutem Ethanol) zu jeder Glasboden-Kulturschale hinzu (35 mm, #1,5H Dicke, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. Sorgen Sie für eine vollständige Abdeckung der Schüsselfläche mit der APTES-Lösung.
   3. Inkubieren Sie 2 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur (20–25 °C).
   4. Spülen Sie das Geschirr dreimal mit absolutem Ethanol (2 ml pro Wasch).
   5. Ultraschall in deionisiertem Wasser für 10 Minuten bei 40 kHz. Entferne die restlichen APTES vollständig, um unspezifische Bindungen zu vermeiden.
   6. Silanisierte Geschirr können bis zu einer Woche trocken bei 4 °C gelagert werden.
   7. (Optional) Backen für mehr Stabilität: Stellen Sie gewaschene und getrocknete Geschirr 30–60 Minuten in den Ofen bei 100–120 °C.
   8. Lass es auf Zimmertemperatur abkühlen, bevor du weitermachst.
      HINWEIS: Bei Verwendung von Kunststoffschalen sollten Sie die Temperatur auf unter 80 °C senken, um Verformungen zu verhindern. Passen Sie das Silanisierungsverfahren von Bitter und Muir²⁰ an.
2. Kollagenselbstassemblierung und Vernetzung
   1. Pipetten Sie 100 μL Kollagen-I-Lösung (50 μg/mL in 0,1 m Essigsäure) auf jede silanisierte Schale.
   2. Inkubieren Sie bei 37 °C für 10 Stunden in einer Luftfeuchtigkeitskammer (> 90 % relative Luftfeuchtigkeit). Halten Sie eine stabile Luftfeuchtigkeit, um eine Verdunstung der Lösung zu verhindern.
   3. Fibrillenbildung mit Phasenkontrast- oder Konfokalmikroskopie überprüfen; Eine erfolgreiche Vorbereitung zeigt ein feines, webähnliches Fibrillennetzwerk.
   4. Um die korrekte Fibrillenbildung auf ultrastruktureller Ebene zu überprüfen, bereiten Sie eine separate Probe auf einem polyvinyl-formalen/kohlenstoffbeschichteten TEM-Gitter unter denselben Selbstassemblierungsbedingungen vor (Kollagen-I 50 μg/mL, 37 °C, 10 H, Luftfeuchtigkeit > 90%).
   5. Färben Sie 10 Minuten lang mit 1 % Phosphotungstescher Säure (pH 7,0).
   6. Waschen Sie mit deionisiertem Wasser.
   7. Untersuchen Sie sie unter einem Transmissionselektronenmikroskop. Eine erfolgreiche Fibrillogenese zeigt sich im charakteristischen 67 nm D-periodischen Bandmuster (siehe Abbildung 3).
   8. Aspirieren Sie vorsichtig die restliche Kollagenlösung aus den Glasboden-Schalen.
   9. Gib 2 ml Chondroitinsulfat (CS)-Lösung (50 mg/mL in PBS, pH 5,5) zu jedem Gericht hinzu.
   10. Inkubieren Sie bei 4 °C für 12 Stunden, um die elektrostatische Adsorption von CS auf Kollagenfibrillen zu ermöglichen.
   11. Bereite EDC/NHS-Vernetzungslösung²¹ vor: löse 0,2 M EDC (1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid) und 0,05 M NHS (N-Hydroxysuccinimid) im MES-Puffer (0,1 M MES, pH 5,5).
       HINWEIS: Der MES-Puffer kann hergestellt werden, indem MES-freie Säure in deionisiertem Wasser gelöst und der pH-Wert mit NaOH auf 5,5 eingestellt wird.
   12. Entferne die CS-Lösung und füge 2 ml der EDC/NHS-Vernetzungslösung hinzu.
   13. Inkubiere bei Raumtemperatur für 2 Stunden, um CS kovalent auf Kollagen zu immobilisieren.
   14. Spüle dreimal das Geschirr mit PBS (je 5 ml, jeweils 5 Minuten), um nicht reaktivierte Reagenzien zu entfernen.
   15. Lagern verarbeitete Kollagenfasern in PBS bei 4 °C bis zu 24 Stunden vor der Mineralisation.

3. Immunfluoreszenz-Markierung (durchgeführt VOR der Mineralisation)

1. Probenvorbereitung
   1. Spülen Sie die Kollagenfibrillen dreimal mit 500 mM NaCl-Lösung (10 mL pro Wasch, jeweils 5 Minuten).
   2. Waschen Sie dreimal mit deionisiertem Wasser (10 mL pro Wasch, jeweils 5 Minuten).
   3. Führen Sie Waschen auf einer horizontalen Schüttelplattform durch, die sich mit 50 U/min dreht, um eine gründliche Wäsche zu gewährleisten und gleichzeitig Scherkräfte zu minimieren, die zusammengesetzte Fibrillen lösen könnten.
2. Blockierung und primäre Antikörperinkubation
   1. Inkubieren Sie mit Blockpuffer (5 % Rinderserumalbumin in PBS) bei 37 °C für 1 Stunde in einer befeuchteten Kammer.
   2. Bereite einen Antikörpercocktail im Blockpuffer vor: Kaninchen-Antikollagen-I (1:100 Verdünnung) und Maus-Antichondroitin-Sulfat (1:100 Verdünnung).
   3. Fügen Sie pro Probe 200 μL Antikörpercocktail hinzu.
   4. Proben mit Laborversiegelungsfolie abdecken.
   5. Inkubieren Sie über Nacht bei 4 °C (12–16 H).
   6. Schützen Sie vor Licht mit Alufolie. Nach der primären Antikörperinkubation können die Proben in PBS bei 4 °C bis zu 24 Stunden gelagert werden.
3. Sekundäre Antikörperfärbung
   1. Entfernen Sie ungebundene primäre Antikörper, indem Sie das Geschirr dreimal mit Waschpuffer (0,1 % Tween-20 in PBS), jeweils 10 Minuten pro Wasch, entfernen.
   2. Bereite die fluoreszierende sekundäre Antikörpermischung in einem Blockpuffer (200 μL pro 35 mm Schüssel) vor, der enthält: Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit einem weit-roten fluoreszierenden Farbstoff (1:100), und Ziegen-Anti-Maus-IgM, konjugiert mit einem roten fluoreszierenden Farbstoff (1:100).
      HINWEIS: Ab diesem Schritt schützen Sie die Proben vor Licht, um Photobleaching des Fluorophors zu verhindern.
   3. Proben bei Raumtemperatur (20–25 °C) 1 Stunde im Dunkeln inkubieren.
   4. Dreimal das Geschirr mit einem Waschpuffer (jeweils 10 Minuten) abwaschen, um ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen.
      HINWEIS: Bewahren Sie beschriftete Proben in PBS bei 4 °C (lichtgeschützt) bis zu 48 Stunden vor der Bildgebung auf. Fügen Sie keine primären Antikörperkontrollen hinzu, um auf Autofluoreszenz zu prüfen.

4. Mineralisierung von Kollagenfasern (durchgeführt NACH der Markierung)

1. Mineralisierungsprozess
   1. Fügen Sie pro Gericht 2 ml frisch zubereitetes Mineralisierungsmedium hinzu.
   2. Inkubieren bei 37 °C für 30 Minuten (kurzzeitig) zur Bildung von Mineralien im Frühstadium (ACP).
   3. Alternativ inkubieren Sie bei 37 °C für 6 Stunden (langfristig) zur Kristallisation eines reifen Minerals (HAP).
      HINWEIS: Halten Sie eine exakte Temperatur von 37 °C ± 0,5 °C mit einem kalibrierten Inkubator.
   4. Mineralisationsmedium sanft aspirieren.
   5. Dreimal mit deionisiertem Wasser spülen (5 ml pro Wasch, 1 Minuten Abstand).
2. Calciumphosphat-Markierung
   1. Fügen Sie 4 μM eines Kalziumindikator-Farbstoffs (z. B. Calcein) in PBS (200 μL pro Schale) hinzu.
   2. Inkubieren Sie bei Raumtemperatur (20–25 °C) für 30 Minuten im Dunkeln.
      HINWEIS: Der Kalziumindikatorfarbstoff (z. B. Calcein) bindet an Calciumionen und unterscheidet nicht zwischen amorphen und kristallinen Phasen; Die Phasenzuweisung basiert auf der Mineralisationszeit (30 Minuten = ACP, 6 Stunden = HAP). Er sollte mit Bernsteinröhrchen oder Folienfolie vor Licht geschützt werden.
   3. Fünfmal spülen: drei Waschgänge mit deionisiertem Wasser und zwei Waschgänge mit 70 % Ethanol (jeweils 1 Minute), abwechselnd abwechselnd.
3. Probenvorbereitung für die Bildgebung
   1. Proben im Bildgebungspuffer eintauchen: 10 % (w/v) Glycerol in PBS. Geben Sie optional ein Antifade-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu.
   2. Verwenden Sie ein ausreichendes Volumen (20–50 μL) Bildpuffer, um die Probe zu bedecken.
   3. Legen Sie einen Deckdeckel über die Probe.
   4. Bewahren Sie Proben bei 4 °C im Dunkeln bis zu 72 Stunden auf.

5. Beobachtung unter einem Laserkonfokalmikroskop

1. Probenübertragung von 4 °C Speicher auf Raumtemperatur (20–25 °C).
2. Lassen Sie 10 Minuten Gleichgewicht ein, um Kondensation zu vermeiden.
3. Halte Lichtschutz mit bernsteinfarbenen Behältern oder Folienfolie aufrecht.
4. Überprüfen Sie, dass der Bildpuffer die gesamte Probe abdeckt.
5. Konfigurieren Sie das konfokale Mikroskop mit den folgenden Einstellungen:
   1. Für die Kollagenbildgebung (fernroter fluoreszierender Farbstoff): 647 nm Laser, Emissionsfilter 650–710 nm.
   2. Für die Calciumphosphat-Bildgebung (Calcium-Indikator-Farbstoff (z. B. Calcein)): 488 nm Laser, Emissionsfilter 500-550 nm.
   3. Ziel: 100× Ölimmersion (NA 1,4).
   4. Lochdurchmesser: 1 Airy-Einheit (AU).
   5. Pixel-Dwell-Zeit: 1-2 μs.
      HINWEIS: Führen Sie vor der Bildgebung eine Laserausrichtung und Lochkalibrierung durch.
6. Führen Sie sequentielle Scans durch: Erster Scan mit 647 nm Anregung (Kollagen).
7. Führen Sie einen zweiten Scan mit 488 nm Anregung (Mineral) durch.
   HINWEIS: Sammeln Sie Kanäle nacheinander, um Durchlauf zu vermeiden.
8. Für die 3D-Rekonstruktion stellen Sie die Z-Stack-Schrittgröße auf 0,5 μm oder kleiner, um eine ausreichende Abtastung sicherzustellen.
9. Speicherstände mit erhaltenen Metadaten.
10. Für die Kolokalisationsanalyse verwenden Sie Bildanalyse-Software, die Pearsons Korrelationskoeffizienten berechnen kann (z. B. öffentlich verfügbare Software mit geeigneten Plugins).

6. Bildgebung durch dreidimensionale stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (3D-STORM)

1. Vorbereitung des STORM-Bildpuffers²²
   HINWEIS: Glukoseoxidase und Katalase werden dem Bildgebungspuffer zugesetzt, um Sauerstoff zu gewinnen, wodurch die Photobleachung reduziert und das Blinken der Fluorophore verlängert wird, was für die Lokalisierung von Einzelmolekülen bei STORM unerlässlich ist.
   1. Bereiten Sie eine Glukoseoxidase-(GOx)-Fondlösung mit 8 mg/mL in einem 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,1) vor.
   2. Bereiten Sie eine Katalasa-Lagerlösung mit 160 μg/mL in 1× PBS vor.
      HINWEIS: Entfernen Sie die Enzymbestände, frieren Sie sie mit flüssigem Stickstoff oder einem Trockeneis-/Ethanolbad ab und lagern Sie sie bei -20 °C oder -80 °C. Vermeiden Sie wiederholte Gefrier-Tau-Zyklen.
   3. Bereiten Sie einen frischen STORM-Bildpuffer auf Eis vor, geschützt vor Licht.
   4. Kombinieren Sie die folgenden Komponenten in der angegebenen Reihenfolge zu einem Endvolumen von 1 mL: steriles nukleasefreies H₂O (bis 1 mL), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM final), 1 M Tris-HCl pH 8,0 (50 μL, 50 mM final), frisch hergestelltes 1 M Cystamin (MEA) angepasst auf pH ~7,0 (50 μL, 50 mM final), 50% (w/v) Glukose (200 μL), 10 % W/v Endwert), GOx-Aktie (200 μL, 1,6 mg/mL final), Katalase-Aktie (200 μL, 32 μg/mL final).
   5. Mischen Sie sanft durch Pipette oder Inversion. Nicht vortexen.
      HINWEIS: Der Puffer muss frisch vorbereitet und auf Eis vor Licht geschützt aufbewahrt werden. Verwenden Sie sie innerhalb von 30 Minuten nach der Zubereitung. Für eine detaillierte Optimierung der STORM-Bildgebungsbedingungen siehe die etablierten Protokolle mit Testproben¹⁵.
   6. Fügen Sie 200 μL frisch vorbereiteten STORM-Bildpuffer hinzu, um die Probe vollständig abzudecken.
2. 3D-STORM-Systemkonfiguration
   1. Stellen Sie sicher, dass der Bildgebungspfad zu einer elektronenmultiplizierenden CCD-(EMCCD)-Kamera geleitet wird.
   2. Aktivieren Sie das zylindrische Objektivmodul für 3D-Bildgebung.
   3. Stelle die Software auf den 3D-STORM-Erfassungsmodus.
   4. Konfigurieren Sie optische Pfadfilter für die verwendeten Farbstoffe.
   5. Schalte den 647-nm-Laser ein und stelle die Leistung auf eine niedrige Stufe (1–5 mW).
   6. Mit einem 100× Öl-Immersionsobjektiv (NA ≥1.4) lokalisieren Sie die interessante Region im Weitfeld- oder TIRF-Live-Vorschaumodus.
   7. Nehmen Sie ein herkömmliches Weitfeld-Fluoreszenzbild für den späteren Vergleich auf.
   8. Wechsel in den TIRF-Beleuchtungsmodus.
   9. Kalibrieren Sie den TIRF-Winkel so, dass ein dünnes Beleuchtungsfeld (~100–200 nm) erreicht wird, um Hintergrundfluoreszenz zu minimieren.
   10. Passen Sie die Belichtungszeit der Kamera (10–30 ms) basierend auf der anfänglichen Signalintensität an.
   11. Stellen Sie die Laserleistung der Bildabbildung basierend auf der anfänglichen Signalintensität an.
   12. Führen Sie eine kurze Testaufnahme durch.
   13. Überprüfen Sie, dass die Parameter korrekt eingestellt sind, ohne eine schnelle Photobleaching zu verursachen.
       HINWEIS: Stellen Sie eine präzise Ausrichtung der zylindrischen Linseachse auf die Probenebene sicher. Die meisten modernen Systeme verfügen über eine automatisierte Kalibrierung. Für die manuelle Kalibrierung verwenden Sie 100 nm fluoreszierende Perlen, um symmetrische, rundpunktbasierte Spreizfunktionen (PSFs) zu überprüfen.
   14. Beginnen Sie mit einer Belichtung von 10–30 ms bei einer 647 nm Laserleistung von 1–2 kW/cm^².
   15. Überprüfen Sie, dass die Blinkdichte 0,1–1 Molekül/μm² beträgt.
   16. Wenn die Dichte zu niedrig oder zu hoch ist, passen Sie die Laserleistung oder Belichtungszeit entsprechend an.
   17. Wiederholen Sie die Überprüfung und Anpassung, bis die ideale Dichte erreicht ist.
3. 3D-STORM-Datenerfassung
   1. Stellen Sie die Erfassungssoftware auf den Modus "Kontinuierliche Aktivierung" ein.
   2. Stellen Sie den Bildverarbeitungslaser (647 nm) auf hohe Leistung (100–500 mW Fasereingang) ein, um die meisten Fluorophore in den Dunkelzustand zu überführen.
   3. Stellen Sie den Aktivierungslaser (405 nm) auf niedrige Leistung (0,1–5 mW) ein.
   4. 405 nm Leistung empirisch zu optimieren, um 100–200 lokalisierte Moleküle pro Bild in einem Bereich von 256×256 Pixeln zu erhalten.
   5. Stellen Sie die Gesamtzahl der Frames auf 10.000–20.000 ein.
   6. Verwenden Sie 1 Bild Aktivierungslicht (405 nm) gefolgt von 5 Bildbildern Bildlicht (647 nm) pro Zyklus.
   7. Beginnen Sie mit der Erwerbung.
   8. EMCCD mit maximaler Empfindlichkeit (EM-Verstärkung angewendet) betreiben
   9. Verwenden Sie 10–30 ms Belichtung pro Bild.
   10. Während der Aufnahme wird die Dichte des aktiven Moleküls überwacht.
   11. Stellen Sie die 405-nm-Laserleistung an, um einen stetigen Strom von Einzelmolekül-Ereignissen aufrechtzuerhalten.
       HINWEIS: Rohfilmdaten können auf einer Standardfestplatte für eine Langzeitarchivierung vor der Rekonstruktion gespeichert werden.
4. Datenanalyse der Kollagenmineralisierung (unter Verwendung von Bildanalysesoftware mit STORM-Modul)
   1. Wählen Sie in der Analysesoftware den entsprechenden Kameratreiber (STORM-Modul) aus.
   2. Klicken Sie im STORM-Panel auf [Analyse GUI]. Das Analysefenster öffnet sich.
   3. Klicken Sie auf [Datei öffnen]. Wählen Sie die zu analysierende Raw-Mikroskopie-Bilddatei aus. Klicken Sie auf Öffnen.
   4. Bestimme den minimalen Fluoreszenzwert (Mindesthöhe) für gültige Signale.
   5. Finde den dunkelsten Fleck, der noch als Einzelmolekül-Signal erkennbar ist.
   6. Bewege die Maus in ihre Mitte.
   7. Lesen Sie den Wert der Gipfelhöhe.
   8. Zeichnen Sie diesen Wert auf.
   9. Klicken Sie auf [Identifikationseinstellungen]. Im Dialog setzen Sie folgende Parameter: Minimale Höhe (geben Sie den im Schritt 6.4.8 erfassten Wert ein), Maximale Höhe (20000), CCD Baseline (100) und für 3D-STORM die Datenangabe "3D" (für 2D deaktiviert).
   10. Klicken Sie >> , um weitere Parameter zu erweitern. Setzen: Mindestweite (nm) auf 200, maximale Breite (nm) auf 700 (400 für 2D), Anfangspassbreite (nm) auf 300, maximales Achsenverhältnis auf 2,5 (1,3 für 2D) und maximale Verdrängung (pix) auf 1.
   11. Klicken Sie auf OK, um den Dialog zu schließen.
   12. Führen Sie eine Testanalyse durch, um die Parameter zu validieren. Drift-Korrektur deaktivieren.
   13. Setze die Stunden auf 1.
   14. Klicken Sie auf [Test].
   15. Nach der Analyse klicken Sie im Pop-up-Dialog auf OK.
   16. Überprüfen Sie, ob die Signalstellen korrekt identifiziert sind. Hintergrundgeräusche sollten nicht falsch ausgewählt werden. Echte Stellen sollten nicht verpasst werden.
   17. Wenn nicht zufriedenstellend, wiederholen Sie die Schritte 6.4.9–6.4.16, um die Parameter anzupassen, bis sie korrekt sind.
   18. Nachdem die Testanalyse bestanden hat, führen Sie die vollständige Analyse durch. Überprüfen Sie die Driftkorrektur.
       HINWEIS: Die Analysesoftware führt Driftkorrektur mit einem redundanten Kreuzkorrelationsalgorithmus (RCC) durch, der die Korrelation zwischen Zeitsegmenten molekularer Lokalisierungen maximiert. Keine treuen Perlen sind erforderlich,²³.
   19. Periode behalten = 1.
   20. Klicken Sie auf [Start] (oder klicken Sie erneut auf [Test], dann [Start]).
   21. Warten Sie, bis die Analyse abgeschlossen ist. Klicken Sie im Pop-up-Dialog auf OK.
   22. Nach der Analyse werden zwei Ergebnisdateien (.bin und .txt) im selben Ordner wie die .nd2-Datei generiert.
   23. Für die Kolokalisierungsanalyse (647 nm und 488 nm Kanäle) werden beide Kanäle gleichzeitig in der Kanalliste des Analysefensters angezeigt.
   24. Wählen Sie ein geeignetes Interessengebiet (ROI) aus.
   25. Verwenden Sie das Kolokalisationsmodul, um den Pearsonschen Korrelationskoeffizienten zu berechnen. Falls nicht automatisch bereitgestellt, exportieren Sie Punktcloud-Daten manuell in ein Kolokalisierungs-Plugin in öffentlich verfügbarer Bildanalysesoftware. Notieren Sie den Wert.
   26. Führen Sie Z-Slice-Analyse durch, um die intrafibrillare Mineralisierung zu bestätigen. Im Hauptmenü wählen Sie 'Ansicht > Z-Stepping > Slice.
   27. Einzelne Ebenen werden in 60-nm-Abständen extrahiert.
   28. Beobachten Sie das Mineralsignal (grün, 488 nm Kanal). Prüfen Sie, ob das Signal in den zentralen Schnitten erhalten bleibt (Z = 0 nm ±120 nm). Persistenz bestätigt intrafibrillare Mineralisierung.
   29. Optional: Dichtefilterung durchführen, um Überzählungen durch dicht gepackte Emitter zu reduzieren. Öffnen Sie das STORM-rekonstruierte Bild in öffentlich verfügbarer Bildanalysesoftware mit einem Plugin für die Analyse der Einzelmoleküllokalisierung²⁴.
   30. Um Überzählungen durch dicht gepackte Emitter zu reduzieren, wenden Sie Dichtefilterung (z. B. Medianfilter oder lokale Dichteschwelle) basierend auf der Signaldichte an.
   31. Wenn die Driftkorrektur in Schritt 6.4.18 nicht aktiviert war oder eine zusätzliche Korrektur erforderlich ist, führen Sie die Driftkorrektur durch. Korrekt, basierend auf dem PSF der treuhänderischen Marker. Alternativ verwenden Sie Kreuzkorrelationsalgorithmen (z. B. Driftkorrektur, die im selben Plugin implementiert wird).
   32. Führen Sie Spektralentmischung durch, um Kanalübersprechen zu eliminieren. Im STORM-Analysefenster klicken Sie auf das Werkzeug zur Entfernung von Übersprechen (meist unten rechts).
   33. Stellen Sie den Radius auf 25,0 nm ein (empfohlen). Wählen Sie den Quellkanal. Wählen Sie die Entfernungsmethode: Statistische Methoden werden empfohlen.
   34. Um die durch den Anregungslaser verursachte Kreuzaktivierung zu entfernen, wählen Sie zusätzlich zu NSA > Kreuzaktivierung Subtrahieren. Klick OK. Ein neuer Kanal, Nonspecific Activation-Xt, wird automatisch generiert.
   35. Validiere Autofluoreszenzwerte und Hintergrundsignale mit ungefärbten Kontrollproben. Stellen Sie sicher, dass alle Signale genau beschriftet sind.
   36. Führe 3D-Visualisierung durch. Wählen Sie im Analysefenster ein Interessengebiet (ROI) aus.
   37. Klicken Sie auf die [3D]- Schaltfläche (oder [3D anzeigen]). Generiere eine 3D-Projektion oder ein Volumenrendering.
   38. Rechtsklick, um die Rendering-Parameter anzupassen. Exportiere Videos in gängigen Formaten (z. B. .avi oder .mp4).
   39. Um ein Mineralsignal als intrafibrillar zu klassifizieren, führen Sie eine Z-Schnitt-Analyse wie in 6.4.26–6.4.28 durch. Exportintensitätsprofile.
   40. Definiere das Fibrillzentrum als die Z-Ebene, in der das Kollagensignal maximal ist.
   41. Ein Mineralsignal gilt als intrafibrillär, wenn seine Intensität bei Z = 0 (Zentrum) und bei Z = ±60 nm ≥50 % der maximalen Mineralintensität in diesem Fibrill liegt. Wenn das Signal bei Z = 0 unter 30 % fällt, klassifiziert als extrafibrillär.
   42. Die Klassifikation von mindestens 50 Fibrillen pro Zustand notieren lassen, um den prozentualen intrafibrillaren Mineralisierungsprozentsatz zu berechnen.
       HINWEIS: Alternative öffentlich verfügbare Plugins sind ebenfalls für Dichtefilterung, Driftkorrektur und spektrales Entmischen verfügbar.

Results

Eine erfolgreiche Umsetzung dieses Protokolls ermöglicht eine hochauflösende, dreidimensionale Visualisierung mineralisierter Kollagenfibrillen mit Multicolor 3D-STORM. Die folgenden Ergebnisse veranschaulichen typische Ergebnisse, Qualitätskontrollen und quantitative Bewertungen.

Abbildung 1 zeigt eine mehrfarbige 3D-STORM-Rekonstruktion eines Kollagennetzwerks, das mit amorphem Calciumphosphat (ACP) mineralisiert ist. Kollagen (...

Discussion

Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Workflow für die nanoskalige Visualisierung der Kollagenmineralisierung mittels mehrfarbigem 3D-STORM. Mehrere kritische Schritte erfordern besondere Aufmerksamkeit, um erfolgreiche Ergebnisse zu gewährleisten.

Erstens ist die Probenvorbereitung grundlegend für hochwertige STORM-Bildgebung. Die Aminosilanisierung von Schalen mit Glasboden muss gründlich erfolgen, um während der nachfolgenden Wasch- und Beschriftungssch...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyasparaginsäure (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Stabilisator für amorphes Calciumphosphat
Calciumchlorid (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Calciumquelle
Dinatriumbiphosphat (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Phosphatquelle
Natriumchlorid (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Anpassung der Ionenstärke
Polyacrylsäure (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Stabilisator für Calcium mit hoher Konzentration
Tris-Base	Sigma-Aldrich	T1503	Pufferkomponente
Natriumazid (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Antimikrobielles Mittel
(3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Funktionalisierungsmittel für Glasoberflächen
Absolutes Ethanol	Sigma-Aldrich	459836	Lösungsmittel
Typ-I-Kollagenlösung (50 μg/mL in 0,1 M Essigsäure)	Corning	354249	Selbstmontagegerüst
Chondroitinsulfat (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Nicht-kollagenes Protein-Mimik
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid)	Sigma-Aldrich	E7750	Vernetzungsmittel
NHS (N-Hydroxysuccinimid)	Sigma-Aldrich	130672	Vernetzungsaktivator
MES-Freie Säure	Sigma-Aldrich	M5287	Puffer für Vernetzungen
Phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	10010023	Wasch- und Verdünnungspuffer
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Blockierungsmittel
Kaninchen-Anti-Kollagen-I-Antikörper	Abcam	ab34710	Primärantikörper für Kollagen
Maus-Anti-Chondroitinsulfat-Antikörper	Sigma-Aldrich	C8035	Primärantikörper für CS
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit weitrotem Fluoreszenzfarbstoff (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Sekundärantikörper für Kollagen
Ziegen-Anti-Maus-IgM, konjugiert mit rotem Fluoreszenzfarbstoff (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Sekundärantikörper für CS
Calcein (Kalziumindikatorfarbstoff)	Sigma-Aldrich	C0875	Kalziumphosphat-Label
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Reiniger für Waschpuffer
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Komponente des Bildgebungspuffers
Glucoseoxidase (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Sauerstofffänger
Catalase	Sigma-Aldrich	C1345	Sauerstofffänger
Cysteamin (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Thiol für Fluorophor-Blinking
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152	Substrat für Glucoseoxidase
Natriumacetat	Sigma-Aldrich	S2889	Puffer für GOx-Lager
Salzsäure (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	pH-Anpassung
Natriumhydroxid (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	pH-Anpassung
Phosphowolframsäure	Sigma-Aldrich	P4006	Negative Färbung für TEM
Glasboden-Zellkulturgefäße (35 mm, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Probensubstrat; Dicke 0,17 mm
Ultraschallreinigungsgerät (40 kHz)	Branson	B200	Reinigungsgerät
Luftfeuchtigkeitskammer	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Für Kollagen-Selbstmontage
Transmissionselektronenmikroskop	Hitachi	HT7800	TEM-Bildgebung
Formvar/Kohlenstoff-beschichtete TEM-Raster (200 Maschen)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	TEM-Probeunterstützung
Horizontale Schüttelplattform	Labnet	S2030-RC	Sanftes Waschen
Konfokaler Laserscanningmikroskop	Nikon	A1	Vorläufige Untersuchung
3D-STORM-Mikroskopsystem (mit 405/488/647 nm Lasern, zylindrische Linse, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Superauflösungsbildgebung
100-fachiges Öl-Immersionsobjektiv (NA 1,49)	Nikon	MRD01991	Bildgebung mit hoher Auflösung
pH-Meter	Mettler Toledo	FiveGo F2	pH-Kontrolle
STORM-Erfassungs- und Analysesoftware	Nikon	NIS-Elements (STORM-Modul)	STORM-Datenerfassung und -verarbeitung
.nd2-Dateiformat (Rohmikroskopiebilddatei)	Nikon	N/A	Roh-Bilddateiformat, das von Nikon-Mikroskopen generiert wird.
Öffentlich verfügbare Bildanalysesoftware	Open Source	N/A	z. B. ImageJ mit ThunderSTORM-Plugin für Einzelmolekül-Lokalisierungsanalyse (Co-Lokalisierung, Driftkorrektur)
Parafilm	Bemis	PM996	Probenabdeckung während der Inkubation
Aluminiumfolie	Jeder Laborzulieferer	N/A	Zum Lichtschutz (z. B. Proben einwickeln)
Bernsteinfarbene Mikrozentrifugenrohre	Fisher Scientific	05-669-21	Zum Lichtschutz von Fluorophoren
Deckgläser (Nr. 1,5)	Corning	2855-18	Probenmontage