Die Verarbeitung der Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray
March 20th, 2009
Die cDNA-Microarray PtGen2 war für die Genexpression Studien in loblolly Kiefer entwickelt, P. taeda Und andere Nadelbaumarten. Hier zeigen wir Pre-und Post-Hybridisierung Bearbeitung und Reinigung Techniken, die mit diesem Array verwendet werden, um eine bessere Konsistenz, verringert Artefakte und unteren Hintergründe liefern kann.
Dieses Video wurde von Forschern der Warnell School of Forestry and Natural Resources der University of Georgia produziert. Der Zweck dieses Schulungsvideos besteht darin, detailliert zu beschreiben, wie unser LOB Lolly Pine pt, Gen Two CDNA, Microarray verarbeitet wird, wobei besonderes Augenmerk auf das Waschen und die Handhabung des Arrays gelegt wird, sowohl vor als auch nach der Hybridisierung. Im Allgemeinen folgen unsere Protokolle denen, die am Institute for Genomic Research Tiger und der Vanderbilt Microarray Shared Resource Facility, VMSR, entwickelt wurden, wo unsere Arrays gedruckt werden.
Wir haben festgestellt, dass eine stringentere Verarbeitung von PT Gen 2 erforderlich ist, um ein Höchstmaß an Konsistenz in Bezug auf die Gleichmäßigkeit der Signalqualität und den geringen Hintergrund zu gewährleisten. Der erste Schritt ist eine Vorwäsche. Wir tun dies, weil unser Fleckenpuffer einen sehr hohen Salzgehalt enthält und diese Vorwäsche notwendig ist, um dieses Salz zu entfernen.
Die Objektträger werden in einen Objektträgerträger gelegt und 15 bis 20 Mal kräftig in eine auf 43 Grad vorgewärmte 0,2%ige SDS-Lösung getaucht. Nachdem die Objektträger in der SDS-Lösung gewaschen wurden, werden sie vorsichtig mit einer Pinzette in ein Copeland-Glas mit Prähybridisierungspuffer entnommen. Dieser Puffer enthält fünf XSSC 0,1 % SDS und 1 % BSA und wird ebenfalls auf 43 Grad erhitzt.
Das Copeland-Glas wird mit Parfum bedeckt und für eine Stunde in einen 43-Grad-Inkubator gestellt. Nach der Prähybridisierung werden die Objektträger auf einen Objektträgerträger des Mikroskops entnommen und nacheinander durch fünf Wechsel von deionisiertem Wasser verarbeitet, wobei bei jedem Wechsel 15 bis 20 Mal eingetaucht wird. Schließlich werden die Objektträger in Isopropanol eingelegt und fünf- bis sechsmal getaucht, bevor sie in einer Chip-M-Mate-Zentrifuge bis zum Trocknen zentrifugiert werden.
Nach der Zentrifugation werden die Objektträger mit Druckluft geblasen, die durch einen 0,2-Mikron-Filter geleitet wird. Die Rutschen werden dann mit Lifter-Slips überzogen, die ebenfalls mit Druckluft gereinigt wurden, und wir verwenden eine kleine Pipettenspitze, um den Lifter-Slip in die richtige Position zu bringen. Auf der Folie.
Nachdem die Lifter-Slips positioniert wurden, aber bevor der Hybridisierungspuffer hinzugefügt wird, fügen wir 20 Mikroliter 100 millimolare Dihi, drei Atol, in die Feuchtigkeitsvertiefungen an den Enden der Kammer hinzu. Jetzt sind wir bereit, die Ziel-CDNAs hinzuzufügen, die im Hybridisierungspuffer resuspendiert wurden. Die Pipettenspitze wird an den Rand des Lifterschiebers gelegt und der Objektträger und die Lösung werden langsam pipettiert.
Wir haben festgestellt, dass die Nutzung des Kapillareffekts zum Laden der Arrays die größte Konsistenz bietet und den Einbau unerwünschter Blasen stark reduziert. Nachdem das Zielmaterial zum Array hinzugefügt wurde, wird die Hybridisierungskammer zusammengebaut und mit Aluminiumfolie abgedeckt. Die Hybridisierungskammer wird dann in ein Schüttelwasserbad gestellt, wo sie über Nacht inkubiert wird, typischerweise 14 bis 16 Stunden.
Das Wasserbad ist auf 48 Grad und der Shaker auf 50 U/min eingestellt. Es ist auch wichtig zu beachten, dass die Verfahren ab dem Zeitpunkt der Zugabe der Hybridisierungslösung bei allen Waschvorgängen nach der Hybridisierung bei schwachem Licht durchgeführt werden, um eine Photooxidation zu verhindern. Am nächsten Tag werden die Objektträger aus der Hybridisierungskammer entnommen und in ein Copeland-Glas mit Waschlösung Nummer eins gegeben, das auf 53 Grad vorgewärmt wurde.
Die Objektträger werden etwa eine Minute lang im Copeland-Glas gelassen, bis die Lifter-Slips abfallen, woraufhin die Objektträger vorsichtig mit einer Pinzette entfernt und in einen Objektträgerträger gelegt werden, um mit den Waschungen fortzufahren. Anschließend werden die Objektträger etwa 15 bis 20 Mal kräftig in einen zweiten Behälter getaucht, der ebenfalls Waschlösung Nummer eins bei 53 Grad enthält. Der Behälter wird dann mit Parfum bedeckt und in einen Inkubator-Luftschüttler gelegt, der auf 53 Grad und hundert U/min eingestellt ist.
Nach der 10-minütigen Inkubation und Waschlösung Nummer eins werden die Objektträger 15 bis 20 Mal kräftig in einen Behälter mit Waschlösung Nummer zwei getaucht, der sich bei Raumtemperatur im Behälter befindet. Diese wird mit Parafolie überzogen und für eine 10-minütige Inkubation bei Raumtemperatur wieder auf einen Schüttler gelegt. Zum Schluss werden die Objektträger aus Waschlösung Nummer zwei entnommen und 15 bis 20 Mal kräftig in einen Behälter mit Waschlösung Nummer drei getaucht.
Die Objektträger werden dann in einen zweiten Behälter mit Waschlösung Nummer drei entnommen, der mit Perfil bedeckt ist, und erneut für 10 Minuten auf den Schüttler gelegt. Nach der letzten Wäsche zentrifugieren wir die Objektträger, bis sie vollständig getrocknet sind. Zu diesem Zweck setzen wir eine 15-mil-Falcon-Kappe in ein konisches 50-mil-Rohr ein und platzieren die Arrays mit der Barcode-Seite nach unten in das konische Rohr.
Anschließend werden die Rohre in einem schwingenden Schaufelkopf bei 1500 U/min bei Raumtemperatur gesponnen. Nach der Zentrifugation werden die Objektträger in einen zweiten Satz von 50 mil konischen Röhrchen entnommen, die mit Aluminiumfolie abgedeckt wurden. Die Röhrchen werden dann mit Stickstoffgas gespült, das für den Transport oder die Lagerung bis zum Scannen durch einen 0,22-Mikron-Filter und eine Kappe gefiltert wird.
Wir sammeln Scandaten auf einem PerkinElmer Scan-Array 5.000. Das Array-Bild wird gerastert und die Rohscandaten werden verarbeitet, und die erste Datenanalyse erfolgt mit der Bildgebungssoftware-Suite von Bio Discovery. Als nächstes werden die Intensitätsdaten des Spot-Signals normalisiert, indem die statistische Analyse mit BRB-Array-Tools durchgeführt wird, einem robusten und frei verfügbaren Microarray-Statistikpaket, das vom National Cancer Institute heruntergeladen werden kann.
Andere statistische Analysen und Suchen nach Genexpressionsmustern werden mit der Genexpressionsmuster- und Analysesuite Jeep PPAs durchgeführt. Ein weiteres frei verfügbares webbasiertes Analysepaket. Vielen Dank, dass Sie sich unser Video zur Verarbeitung des Lob Lolly Pine PT Gen Two Microarrays angesehen haben.
Verantwortlich für den Inhalt und die Produktion dieses Schulungsvideos waren folgende Personen.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Übersicht
Dieser Artikel stellt das cDNA-Microarray PtGen2 vor, das für Genexpressionsstudien bei loblolly-Kiefer und anderen Nadelbaumarten entwickelt wurde. Es beschreibt detailliert die Vor- und Nachhybridisierungsbehandlung sowie die Waschtechniken zur Verbesserung der Konsistenz und Reduzierung von Artefakten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Genexpressionsanalyse
- Microarray-Technologie
- Pflanzenbiologie
Hintergrund
- cDNA-Microarrays sind essentiell für die Untersuchung der Genexpression.
- PtGen2 ist speziell für loblolly-Kiefer und Nadelbäume konzipiert.
- Angemessene Handhabungstechniken sind entscheidend für zuverlässige Ergebnisse.
- Ein hoher Salzgehalt im Spottingpuffer erfordert eine Vorwäsche.
Zweck der Studie
- Verbesserung der Konsistenz der Genexpressionsdaten.
- Reduzierung von Hintergrundrauschen in Microarray-Ergebnissen.
- Bereitstellung eines standardisierten Protokolls für Forscher.
Verwendete Methoden
- Vorwäsche zur Entfernung von Salz aus dem Spottingpuffer.
- Strenge Waschtechniken nach der Hybridisierung.
- Vergleich mit Protokollen etablierter Forschungseinrichtungen.
- Bewertung der Signalqualität und Hintergrundniveaus.
Hauptergebnisse
- Verbesserte Konsistenz in der Signalqualität wurde beobachtet.
- Niedrigere Hintergrundniveaus wurden mit verfeinerten Techniken erreicht.
- Protokolle zeigten Wirksamkeit in mehreren Experimenten.
- Empfehlungen für zukünftige Studien bereitgestellt.
Schlussfolgerungen
- Verbesserte Handhabungs- und Waschtechniken sind entscheidend für den Erfolg von Microarrays.
- Standardisierte Protokolle können zu zuverlässigeren Genexpressionsdaten führen.
- Zukünftige Forschung kann auf diesen Erkenntnissen für bessere Ergebnisse aufbauen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This protocol addresses a key challenge in plant genomics: achieving reproducible microarray data despite high-salt spotting buffers that can introduce artifacts. By standardizing pre- and post-hybridization washing steps, the method enhances data consistency and reduces background noise, supporting reliable gene expression profiling in conifer species. This contributes to target validation efforts in forestry biotechnology by enabling clearer detection of differentially expressed genes under experimental conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses in conifer tissues, supporting hypothesis testing in stress or developmental pathways.
- Operational Value: Reduces technical variability from salt artifacts, improving confidence in target identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, low-background microarray slides suitable for reproducible hybridization across experimental groups.
- Operational Value: Establishes a robust slide preparation workflow that enhances assay reproducibility and scalability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by providing reliable expression profiles from pine tissues, useful in studying environmental adaptation or wood formation.
- Operational Value: Facilitates cross-study comparability through consistent slide processing, aiding translational continuity.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology workflow, specifically supporting reliable target profiling in non-model plant systems where genetic tools are limited.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven expression analysis in loblolly pine, clarifying gene responses in root, needle, and stem tissues.
- Screening: Delivers microarray slides with uniform signal quality, enabling reliable comparative screening of gene expression under varying conditions.
- Analytics: Generates clean, normalized signal intensity data compatible with downstream tools like BRB Array Tools and JePPAs for statistical analysis.
- Translational Research: Supports continuity from gene discovery to functional validation by providing trustworthy expression baselines.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable slide preparation protocol that can be applied across multiple conifer species and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves predictive confidence in gene expression measurements by minimizing salt- and SDS-derived artifacts.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across slides and laboratories through defined washing and handling steps.
- Strategic Value: Reduces risk of false positives/negatives in expression profiling, supporting better go/no-go decisions in target validation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate genes based on cleaner, more reliable expression data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microarray handling and hybridization techniques.
- Needs access to temperature-controlled water baths, incubators, and centrifuges for slide processing.
- Demands standardized reagents including SDS, SSC, BSA, and isopropanol for washing and dehydration.
- Requires adaptation of humidity control and hybridization timing based on target RNA source and labeling method.
- Practical limitation: High-salt spotting buffer necessitates rigorous pre-washing; incomplete salt removal may persist if steps are shortened.
