Visualisierung der subzellulären Lokalisation eines Proteins im Herzen mittels Quantenpunkt-vermittelter Immunmarkierung gefolgt von Transmissionselektronenmikroskopie
September 16th, 2022
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Immunmarkierung eines Proteins in den Herzgewebeschnitten unter Verwendung von Quantenpunkten. Diese Technik bietet ein nützliches Werkzeug, um die subzelluläre Lokalisation und Expression eines Proteins auf ultrastruktureller Ebene zu visualisieren.
Die Bestimmung der subzellulären Lokalisation eines Proteins ist entscheidend für die Beschreibung seiner eigentlichen Funktion und der daran beteiligten Mechanismen. Diese Methode kann uns helfen, die subzelluläre Lokalisation eines Proteins auf der Ultrastrukturebene sichtbar zu machen. Quantenpunkt-vermittelte Immunmarkierung ist stabiler, resistent gegen Photobleaching, hat eigene Emissionsspektren, liefert eine hohe Elektronendichte und zeigt eine höhere Effizienz und Retention auf Geweben mit besserer Penetration in Gewebe.
Mehrere Schritte des Prozesses, d. h. Fixierung, Ätzung, Blockierung und optimale Konzentration von Quantenpunkten, sind herausfordernde Schritte zur Optimierung. Es ist ratsam, mehrere Zeitpunkte und Konzentrationen der verwendeten Reagenzien auszuprobieren. Eine weitere Herausforderung ist der Umgang mit Gittern, bei denen nur Geduld und natürlich Übung funktionieren.
Chowdhury Abdullah, ein Postmitarbeiter, Naznin Remex, ein Doktorand aus meinem Labor, und Brandon Hartman, Elektronenmikroskopie-Supervisor von unseren Elektronenmikroskopie-Diensten, werden das Verfahren demonstrieren. Nach der Betäubung der Mäuse und dem Öffnen der Brusthöhle das Herz mit eiskaltem 3% Glutaraldehyd in 0,1 Molar Natriumcacodylatpuffer für zwei Minuten überladen. Verwenden Sie eine 25-Gauge-Nadel von fünf mal acht Zoll, um die Fixiermittel mit Schwerkraftdruck in das Herz einzuführen.
Unmittelbar nachdem sich das Herz mit dem Fixiermittel füllt, heben Sie die Herzspitze an, um den Druck zu lindern. Schneiden Sie die darunter liegenden Gefäße ein bis zwei Millimeter vom Herzen ab und lassen Sie die Flüssigkeiten abfließen. Seziere das Herz.
Entfernen Sie die Vorhöfe und lassen Sie die Ventrikel in eine Petrischale fallen, die eiskaltes 3% Glutaraldehyd und 0,1 molares Natriumcacodylat enthält. Machen Sie einen Schmetterlingsschnitt nach 30 bis 60 Minuten Fixierung und legen Sie den Ventrikel wieder in die Petrischale. Hacken Sie das Herz mit einer chirurgischen Klinge in kleine Würfel von einem Kubikmillimeter.
Fixieren und tauchen Sie das zerlegte Herzgewebe 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius in Glutaraldehyd- und Cacodylatlösung. Nach 24 Stunden Fixierung waschen Sie das Gewebe zweimal für 20 Minuten in einem 0,1-molaren Natriumcacodylatpuffer. Entfernen Sie das Gewebe aus dem Natriumcacodylatpuffer und tauchen Sie vier Stunden bei Raumtemperatur in 2% Osmiumtetroxidlösung ein.
Nach der Osmulation tauchen Sie das Gewebe für 10 Minuten bei Raumtemperatur in 2% ige Natriumacetatlösung. Als nächstes tauchen Sie das Gewebe für eine Stunde bei Raumtemperatur in 2% Uranylacetatlösung. Nach der Uranylacetatfärbung dehydrieren Sie das Gewebe nacheinander durch die abgestuften Alkohole und Aceton.
Betten Sie das dehydrierte Gewebe in niedrigviskoses Epoxidharz ein, wie im Manuskript beschrieben. Geben Sie das Gewebe in acht Millimeter Mikroformen in frisches Harz und härten Sie das eingebettete Gewebe bei 70 Grad Celsius über Nacht aus. Nachdem Sie den interessierenden Bereich gefunden haben, produzieren Sie mit einem Ultra-45-Grad-Messer hellgoldene ultradünne Schnitte.
Platzieren Sie diese ultradünnen Abschnitte auf der stumpfen Seite eines 200-mesh-Kupfergitters. Beginnen Sie die Färbung, indem Sie das Antigen demaskieren, indem Sie 20 Mikroliter Ätzlösungsmetaperiodat auf einen sauberen Paraffinfilm geben. Legen Sie den getrockneten Rost mit Gewebeschnitten auf den Tröpfchen der Ätzlösung.
Lassen Sie das Schnittgitter 30 Minuten bei Raumtemperatur auf der Lösung. Waschen Sie die geätzten Gewebeabschnitte, indem Sie sie 60 Sekunden lang auf einen Tropfen destilliertes Wasser legen. Blockieren Sie die Restaldehydehyde, indem Sie das Schnittgitter für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Tröpfchen mit 0,05 molärer Glycinlösung legen.
Tupfen Sie die Ränder des Gitters auf Filterpapier ab, um die restliche Glycinlösung zu entfernen. Legen Sie das Schnittgitter für 25 Minuten bei Raumtemperatur in 10 bis 20 Mikroliter Blockierlösung. Tupfen Sie die Gitterränder auf Filterpapier ab und legen Sie die Gitterabschnitte auf Antikörperverdünnungsmittel zur Konditionierung bei Raumtemperatur für 10 Minuten.
Inkubieren Sie die Gitterschnitte mit primären Antikörpern für eine Stunde 30 Minuten in einer befeuchteten Kammer. Trocknen Sie das Gitter und waschen Sie die Gitterabschnitte zweimal für jeweils fünf Minuten mit Antikörperverdünnungsmittel. Inkubieren Sie die Gitterschnitte mit biotinylierten sekundären Antikörpern für eine Stunde in einer befeuchteten Kammer.
Sobald das Gitter getrocknet ist, waschen Sie die Gitterabschnitte zweimal für jeweils fünf Minuten mit Antikörperverdünnungsmittel. Inkubieren Sie die Gitterabschnitte in handelsüblicher Streptavidin-konjugierter QD für eine Stunde in einer Kammer bei Raumtemperatur. Verhindern Sie Lichteinwirkung, indem Sie die Kammer mit Aluminiumfolie abdecken.
Nachdem Sie die Gitterkanten mit Filterpapier getrocknet haben, waschen Sie die Gitterabschnitte, indem Sie sie zwei Minuten lang auf Wassertröpfchen legen und die Gitterkanten zum Trocknen abtupfen. Führen Sie den Probenhalter in die Mikroskopsäule ein und betätigen Sie den Pumpschalter, um das Goniometer auszuwerten, gefolgt von einem vollständigen Einsetzen des Probenhalters in die Mikroskopsäule. Konzentrieren Sie sich gut auf den gewünschten Bereich.
Nehmen Sie das Bild mit einer Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera auf und speichern Sie die Datei im TIF-Format. Die mitochondrialen Membranen, Lysosomen und die endoplasmatische Retikulums- oder sarkoplasmatische Retikulummembran-Mitochondrienschnittstelle zeigten das Vorhandensein von Sigmar1-markierten Quantenpunkten. Herzschnitte wurden mit Kaninchen-Immunglobulin G und Quantenpunkten als Isotypkontrolle für Anti-Sigmar1-Kaninchen-Primärantikörper visualisiert.
Eine wichtige Sache, die bei der Arbeit an diesem Protokoll zu berücksichtigen ist, ist die Demaskierungszeit für Antigen. Wenn die Gewebeschnitte zu lange geätzt werden, erzeugt die Metaperiodatlösung Perforationen in dünnen Gewebeschnitten. Quantenpunkt-vermittelte Markierung gewinnt an Aufmerksamkeit bei der Tumorerkennung, der molekularen und Immunstatus-Profilerstellung von Tumoren und der Gewebebildgebung und ebnet einen neuen Weg für die medizinische Diagnostik.
Quantenpunkte sind auch nützlich bei der Behandlung von Tumoren durch photodynamische Therapien und ophthalmische Anomalien, indem sie Medikamente an die Augen abgeben.
Übersicht
Diese Studie skizziert ein Protokoll für die Immunmarkierung von Proteinen in Herzgewebeschnitten unter Verwendung von Quantenpunkten, das die Visualisierung der Proteinlokalisation und -expression auf ultrastruktureller Ebene ermöglicht. Die Methode ist entscheidend für das Verständnis der Proteinfunktion und damit verbundener Mechanismen.
Wichtige Studienkomponenten
Forschungsgebiet
- Proteinlokalisation
- Herzgewebeabbildung
- Quantenpunkte in der Mikroskopie
Hintergrund
- Die Bestimmung der Proteinlokalisation ist wesentlich für das Verständnis biologischer Funktionen.
- Quantenpunkte bieten Vorteile wie Stabilität und Resistenz gegen Photobleichung.
- Die Optimierung von Fixierungs- und Einbettungsmethoden ist herausfordernd, aber entscheidend für eine effektive Bildgebung.
Verwendete Methoden
- Quantenpunkte-vermittelte Immunmarkierung
- Herzgewebe von Mäusen
- Elektronenmikroskopie und verschiedene Färbetechniken
Hauptergebnisse
- Die erfolgreiche Immunmarkierung von Sigmar1 in Herzgewebeschnitten wurde nachgewiesen.
- Hochauflösende Bildgebung zeigte das Vorhandensein von Quantenpunkten in mitochondrialen Membranen und anderen zellulären Strukturen.
- Optimale Bedingungen für die Antigenfreilegung wurden etabliert, um Gewebeschäden zu vermeiden.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll verbessert die Visualisierung der Proteinlokalisation in Herzgeweben mittels Quantenpunkten.
- Die Ergebnisse tragen zu Fortschritten in der medizinischen Diagnostik und therapeutischen Forschung bei.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Precise subcellular localization of proteins in cardiac tissue is essential for mechanistic de-risking and target validation in early discovery pipelines. Quantum dots-mediated immunolabeling combined with transmission electron microscopy (TEM) enables high-resolution visualization, supporting predictive confidence in protein function assignments. This capability strengthens translational continuity and informs risk-adjusted portfolio decisions for cardiovascular and broader organ system research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of protein distribution at the ultrastructural level for functional hypothesis testing.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying protein localization within organelles and membrane interfaces.
- Improves predictive confidence in target selection by providing spatial context for protein activity.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated tissue sections for downstream quantitative imaging workflows.
- Enhances assay reproducibility through stable, photobleaching-resistant quantum dot labeling.
- Provides high-resolution, quantitative outputs for comparative analysis of protein localization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subcellular localization data with disease-relevant cardiac models for translational biomarker development.
- Enables continuity from molecular discovery to preclinical validation by mapping protein presence in situ.
- Supports risk-adjusted advancement by confirming target engagement at the organelle level.
Pipeline & Workflow Integration
This quantum dot-TEM workflow integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical research, providing a reusable platform for protein localization studies across organ systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping protein distribution in cardiac tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables high-resolution measurement of protein localization for condition comparison.
- Translational Research: Bridges molecular findings to preclinical models by confirming subcellular protein presence.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable workflow for diverse protein localization studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Provides stable, reproducible, and scalable imaging for cross-study comparability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying biological risk early.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electron microscopy and immunolabeling techniques.
- Demands access to TEM instrumentation and quantum dot reagents.
- Necessitates cross-team standardization of fixation, staining, and imaging protocols.
- Adaptable to various tissue types and organ systems with protocol optimization.
- Optimization of antigen unmasking and reagent concentrations is critical to avoid tissue damage.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:16
Animal Preparation
2:39
Heart Tissue Processing and Embedding
3:47
Tissue Sectioning Using an Ultramicrotome and Ultrathin Heart Section Staining
6:19
Transmission Electron Microscopy Imaging
6:48
Results: Visualization of Sigmar1 Using Quantum Dots
7:22
Conclusion
