Un protocolo multicolor de visualización de alta resolución 3D-STORM para mineralización de colágeno en fibrillas de colágeno tipo I recombinantes autoensambladas

Summary

Aquí presentamos un protocolo para distinguir la mineralización intrafibrilar de extrafibrilar en fibrillas de colágeno recombinante utilizando 3D-STORM multicolor, integrando marcaje optimizado, imagen y análisis cuantitativo de colocalización.

Abstract

Este protocolo describe un método de microscopía de reconstrucción óptica estocástica tridimensional multicolor (3D-STORM) para la visualización a nanoescala de la mineralización del colágeno en un modelo de fibrilla autoensamblada de colágeno tipo I recombinante. El método permite la imagen simultánea de las fases de colágeno, proteínas no colagenosas (por ejemplo, sulfato de condroitina) y minerales de fosfato de calcio. La preparación de la muestra implica la aminosilización y el autoensamblaje del colágeno, seguida de mineralización utilizando un medio de fosfato de calcio que forma fosfato de calcio amorfo (ACP) en una fase temprana (30 minutos) y madura en hidroxiapatita (HAP) en 6 horas. A continuación, se realiza el marcaje multiplexado por inmunofluorescencia y las muestras se evalúan primero mediante microscopía confocal antes de la adquisición de imágenes 3D-STORM utilizando un tampón de imagen absorbente de ojeño. El procesamiento y análisis de datos se realizan utilizando software disponible públicamente. En comparación con la microscopía electrónica o confocal convencional, este protocolo combina especificidad molecular con resolución a nanoescala (precisión lateral típica 20–30 nm, axial 50–60 nm), permitiendo la visualización tridimensional de patrones de mineralización intrafibrilar frente a extrafibrilar. Los resultados representativos muestran una visualización clara de redes de colágeno, proteínas no colágenas asociadas y fases minerales dentro del espacio tridimensional. Métricas cuantitativas, incluyendo el coeficiente de correlación de Pearson (0,89 ± 0,04) y el coeficiente de solapamiento de Mander (0,91 ± 0,03), se proporcionan en la sección de Resultados. Este protocolo ofrece una herramienta poderosa para investigadores en ciencia de biomateriales, biomineralización e ingeniería tisular ósea que requieren conocimientos a escala nanométrica sobre la dinámica de mineralización.

Introduction

La mineralización del colágeno es un proceso biológico fundamental y fundamental en la formación de tejidos duros como huesos y^{dientes 1}. La compleja estructura de las fibras de colágeno, junto con una regulación finamente ajustada de la deposición mineral, otorga a estos tejidos una notable resistencia mecánica e integridad^estructural. El colágeno no sirve solo como andamiaje pasivo, sino como participante activo, orquestando una deposición precisa de minerales a través de complejas interacciones moleculares^{y físicas.} Esclarecer estos mecanismos es crucial para comprender condiciones patológicas como la osteoporosis y la caries dental, y para desarrollar materiales biomiméticos para terapias^{regenerativas 4}.

El diámetro de las fibras de colágeno en tejidos duros varía entre aproximadamente 50 y 100 nm, siendo las partículas de hidroxiapatita (HAP) aún más pequeñas (típicamente de 2–5 nm de grosor y 20–30 nm de longitud) e intercaladas dentro de huecos^{fibrilares 5}. Aunque las zonas de gap pueden actuar como sitios de nucleación, en los tejidos nativos los minerales se forman inicialmente en espacios interfibrilares y posteriormente se expanden hacia compartimentos intrafibrilares. Los métodos tradicionales de caracterización incluyen tinción histológica, microscopía láser^{confocal 6,7} y microscopía electrónica ^8,9. La tinción histológica proporciona una evaluación macroscópica, pero no puede evaluar estados de mineralización a nanoescala. La microscopía confocal permite la observación de componentes específicos pero está limitada por difracción (~200 nm lateralmente), incapaz de resolver la mineralización intrafibrilar frente a^{extrafibrillar 10}. La microscopía electrónica ofrece alta resolución pero carece de especificidad molecular. Aunque el marcado con inmunogold puede proporcionar especificidad molecular para la microscopía electrónica, requiere un procesamiento especializado y es menos susceptible de visualizar multiplexados y tridimensionales múltiples componentes en comparación con STORM, además de implicar largos ciclos experimentales y altos^{costes 11}.

La microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) supera el límite de difracción localizando fluoróforos individuales con alta precisión, alcanzando una resolución lateral de ~20^{nm 12}. En comparación con otras técnicas de superresolución como la microscopía de depleción de emisión estimulada (STED⁾¹³y la microscopía de iluminación estructurada (SIM⁾¹⁴, STORM ofrece una mayor precisión de localización (~20 nm lateralmente y ~50 nm axialmente) y es compatible con una gama más amplia de fluoróforos orgánicos. En particular, STED requiere tintes especializados y altas potencias láser que pueden dañar muestras biológicas, mientras que SIM ofrece solo una resolución de ~100 nm, insuficiente para resolver características a escala de fibrilla (50–100 nm). STORM proporciona un equilibrio práctico entre resolución, capacidad de multiplexación y compatibilidad de muestras. Las directrices publicadas han descrito muestras de prueba estandarizadas para facilitar la optimización de los parámetros de imagen STORM y la evaluación^{de resolución 15}. Cuando se combina con capacidades de imagen tridimensional, 3D-STORM permite la visualización a nanoescala de múltiples componentes^{simultáneamente 16}. Los avances recientes han extendido STORM a imágenes multicolor y multiplexadas, permitiendo la visualización de múltiples objetivos dentro de la misma muestra ^17,18.

Este protocolo utiliza un modelo biomimético in vitro basado en fibrillas de colágeno tipo I recombinantes autoensambladas y está diseñado explícitamente para modelos de fibrillas autoensambladas de colágeno recombinante tipo I in vitro, con el fin de distinguir la mineralización intrafibrilar de extrafibrilar a nanoescala. No es adecuado para la imagen de células vivas, ya que STORM requiere muestras fijas y amortiguadores de oxígeno. Tampoco es adecuado para tejidos nativos altamente mineralizados (por ejemplo, hueso maduro) sin una descalcificación previa o extracción de antígenos. Si solo es necesario evaluar la densidad mineral general o la morfología de grandes áreas, la microscopía confocal convencional o la microscopía electrónica es más eficiente.

El objetivo general de este protocolo es proporcionar un flujo de trabajo estandarizado y escalonado para usar 3D-STORM multicolor y visualizar la distribución nanométrica de minerales y proteínas no colágenas dentro de fibrillas individuales de colágeno, con énfasis específico en distinguir la mineralización intrafibrilar de la extrafibrilar. Este protocolo integra un inmunomarcaje optimizado con un buffer de imagen adaptado para permitir el seguimiento simultáneo de múltiples componentes orgánicos (colágeno, proteínas no colágenas) y fases inorgánicas (ACP, HAP) en tres^{dimensiones 19}. Una innovación clave es la evaluación cuantitativa de los patrones de mineralización intrafibrilar frente a extrafibrilar. La cuantificación se logra mediante dos criterios independientes: (1) calcular el coeficiente de colocalización de Pearson entre los canales del mineral (un colorante indicador de calcio, por ejemplo, calcina) y colágeno (un colorante fluorescente de rojo lejano) utilizando el módulo de colocalización en el software de análisis de imágenes (coeficiente >0,8 indica fuerte asociación); (2) analizar la persistencia de la señal mineral a lo largo de las Z-cortes de fibrillas individuales: si la señal mineral está presente en cortes centrales (Z = 0 a ±120 nm del centro vertical de la fibrilla) a intensidad ≥50% del máximo, se clasifica como intrafibrilar. A diferencia de la microscopía electrónica o confocal convencional, este protocolo combina especificidad molecular con resolución a nanoescala, permitiendo una distribución espacial tridimensional de la mineralización intrafibrilar.

Este protocolo está diseñado para investigadores en ciencia de biomateriales, biomineralización e ingeniería de tejidos óseos que requieren conocimientos a nanoescala sobre la dinámica de mineralización. El procedimiento estandarizado también puede adaptarse para estudiar otros sistemas mineralizados de colágeno, como rodajas de dentina desmineralizadas o hidrogeles a base de colágeno, ajustando en consecuencia los pasos iniciales de preparación de la muestra.

Protocol

Todos los experimentos que involucraron muestras biológicas se realizaron conforme a las directrices y reglamentos de las Instalaciones Centrales de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang y fueron aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad (Certificado de Aprobación nº BSL20235710079). El protocolo experimental descrito aquí utiliza reactivos de origen comercial y sistemas biomiméticos in vitro. No involucra participantes humanos, sujetos animales ni muestras de tejido humano, por lo que no requiere la aprobación ética de un comité de revisión institucional.

PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos relacionados con productos químicos peligrosos deben realizarse en una campana extractora con el equipo de protección personal adecuado (bata de laboratorio, guantes, gafas de seguridad). Eliminar los residuos químicos según la normativa institucional. Para NaN₃, recoge los residuos en un recipiente dedicado marcado como "residuos azida" y no se mezclan con ácidos (riesgo de gas explosivo). Para el glutaraldehído, inactívale con un 10% de bisulfito de sodio en exceso antes de su eliminación. Para β-mercaptoetanol, oxidar con lejía (1:10 v/v) durante 1 hora antes de la eliminación por el drenaje.

NOTA: El marcaje por inmunofluorescencia DEBE realizarse ANTES de la mineralización para evitar el enmascaramiento de epítopos por depósitos minerales. Para aplicaciones que requieren marcaje post-mineralización, puede ser necesaria la recuperación de antígenos.

1. Preparación del medio mineralizado

1. Preparación de medio mineralizado para fibrillas de colágeno reconstituidas
   1. Preparar la solución de calcio añadiendo 100 μL de ácido poliaspártico de 5 mg/mL (p-Asp, Mw 9-11 kDa) gota a gota a 5 mL de solución de CaCl₂ de 3,44 mM en un tubo cónico de 15 mL.
   2. Mezcla vórtices en el tubo durante 30 segundos hasta que quede homogéneo.
   3. Añade p-Asp lentamente y mezcla bien para estabilizar el fosfato de calcio amorfo (ACP).
   4. Añade 5 mL de solución de fosfato (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) a la solución de calcio.
   5. Mezcla de vórtices durante 1 minuto.
      NOTA: Concentraciones finales tras mezclar: 1,67 mM CaCl₂, 9,5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl y 50 μg/mL p-Asp.
   6. Prepara el medio mineralizado inmediatamente antes de usarlo. No guardar; usar inmediatamente el precursor ACP inestable para lograr resultados consistentes.
      NOTA: El almacenamiento conduce a una cristalización prematura.
2. Preparación de un medio mineralizado para geles de colágeno/dentina desmineralizada
   1. Preparar una solución que contenga calcio disolviendo 8,77 g de NaCl, 0,01 g de NaN₃, 6,06 g de Tris y 1,11 g de CaCl₂ en 800 mL de agua desionizada.
   2. Reduce el volumen a 1 L con agua desionizada.
   3. Añade 350 μg/mL de ácido poliacrílico (PAA, Mw ~1800) a la solución que contiene calcio.
   4. Vórtice durante 1 minuto.
      NOTA: Usa PAA en lugar de p-asp para una mejor estabilización en concentraciones altas de calcio.
   5. Preparar la solución de fosfato disolviendo 0,85 g de Na₂HPO₄ en 1 L de agua desionizada para obtener 6 mM de Na₂HPO₄.
   6. Esteriliza la solución de fosfato con filtro usando una membrana de 0,22 μm.
   7. Combina volúmenes iguales (por ejemplo, 500 mL cada uno) de soluciones de calcio y fosfato con agitación magnética a 300 rpm.
   8. Ajusta el pH a 7,4 usando 1 M HCl o NaOH mientras monitorizas con un medidor de pH.
      NOTA: Mantener el pH en 7,4 ± 0,1. No permitas desviaciones de pH >0,2, que causen cristalización prematura.

2. Preparación de fibras de colágeno recombinante

1. Aminosilanización de platos de fondo de cristal
   NOTA: Este tratamiento utiliza (3-aminopropil) trietoxisilano (APTES) para introducir grupos amino cargados positivamente (-NH₂) en la superficie del vidrio, lo que favorece la adsorción electrostática y la estabilización de monómeros de colágeno cargados negativamente.
   1. Añadir 200 μL de solución APTES (5% v/v en etanol absoluto) a cada plato de cultivo con fondo de vidrio (35 mm, grosor #1,5H, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. Asegura una cobertura completa de la superficie del plato con la solución APTES.
   3. Incubar en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente (20–25 °C).
   4. Enjuaga los platos tres veces con etanol absoluto (2 mL por lavado).
   5. Ultrasonica en agua desionizada durante 10 minutos a 40 kHz. Elimina completamente los APTES residuales para evitar la unión inespecífica.
   6. Los platos silanizados pueden conservarse secos a 4 °C durante hasta una semana.
   7. (Opcional) Hornear para mayor estabilidad: Coloca los platos lavados y secados en el horno a 100–120 °C durante 30–60 minutos.
   8. Déjalo enfriar a temperatura ambiente antes de continuar.
      NOTA: Si usas platos de plástico, reduce la temperatura a menos de 80 °C para evitar deformaciones. Adapta el procedimiento de silanización de Bitter y^{Muir 20}.
2. Autoensamblaje de colágeno y reticulación
   1. Pipetear 100 μL de solución de colágeno-I (50 μg/mL en 0,1 M ácido acético) en cada plato silanizado.
   2. Incubar a 37 °C durante 10 horas en una cámara de humedad (> 90% de humedad relativa). Mantén una humedad estable para evitar la evaporación de la solución.
   3. Verificar la formación de fibrillas con microscopía de contraste de fase o confocal; Una preparación exitosa muestra una fina red de fibrillas, similar a una telaraña.
   4. Para verificar la formación correcta de fibrillas a nivel ultraestructural, preparar una muestra separada sobre una rejilla TEM formal/recubierta de carbono polivinilo siguiendo las mismas condiciones de autoensamblaje (colágeno-I 50 μg/mL, 37 °C, 10 h, humedad > 90%).
   5. Tinte con ácido fosfotongstico al 1% (pH 7,0) durante 10 minutos.
   6. Lava con agua desionizada.
   7. Examina bajo un microscopio electrónico de transmisión. La fibrillogénesis exitosa se indica por el característico patrón de bandas periódicas D de 67 nm (véase la Figura 3).
   8. Aspira cuidadosamente la solución residual de colágeno de los recipientes con fondo de cristal.
   9. Añade 2 mL de solución de sulfato de condroitina (CS) (50 mg/mL en PBS, pH 5,5) a cada plato.
   10. Incubar a 4 °C durante 12 horas para permitir la adsorción electrostática de CS sobre las fibrillas de colágeno.
   11. Preparar la solución de reticulación EDC/^{NHS 21}: disolver 0,2 M EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropilo) carbodiimida) y 0,05 M NHS (N-hidroxisuccinimida) en el tampón MES (0,1 M MES, pH 5,5).
       NOTA: El tampón MES puede prepararse disolviendo ácido libre MES en agua desionizada y ajustando el pH a 5,5 con NaOH.
   12. Quita la solución CS y añade 2 mL de la solución de reticulación EDC/NHS.
   13. Incuba a temperatura ambiente durante 2 horas para inmovilizar covalentemente el CS sobre el colágeno.
   14. Lava los platos tres veces con PBS (5 mL cada uno, 5 min cada uno) para eliminar los reactivos no reaccionados.
   15. Almacenar fibras de colágeno procesadas en PBS a 4 °C durante hasta 24 horas antes de mineralizar.

3. Marcado por inmunofluorescencia (realizado ANTES de la mineralización)

1. Preparación de muestras
   1. Enjuaga las fibrillas de colágeno tres veces con una solución de NaCl de 500 mM (10 mL por lavado, 5 min cada uno).
   2. Lávate tres veces con agua desionizada (10 mL por lavado, 5 min cada uno).
   3. Realiza lavados sobre una plataforma osciladora horizontal que gira a 50 rpm para asegurar un lavado completo minimizando las fuerzas de corte que podrían desprender fibrillas ensambladas.
2. Bloqueo e incubación primaria de anticuerpos
   1. Incubar con tampón bloqueante (albúmina sérica bovina al 5% en PBS) a 37 °C durante 1 hora en una cámara humidificada.
   2. Preparar cóctel de anticuerpos en un tampón bloqueante: anticolágeno-I de conejo (dilución 1:100) y sulfato anticondroitina de ratón (dilución 1:100).
   3. Añade 200 μL de cóctel de anticuerpos por muestra.
   4. Cubre las muestras con película de sellado de laboratorio.
   5. Incubar a 4 °C durante la noche (12–16 h).
   6. Protégelo de la luz con papel de aluminio. Tras la incubación primaria de anticuerpos, las muestras pueden almacenarse en PBS a 4 °C durante hasta 24 horas.
3. Tinción secundaria por anticuerpos
   1. Eliminar los anticuerpos primarios no unidos lavando los platos tres veces con tampón de lavado (0,1% Tween-20 en PBS), 10 minutos por lavado.
   2. Preparar la mezcla secundaria fluorescente de anticuerpos en un tampón bloqueador (200 μL por plato de 35 mm) que contiene: IgG anticonejo de cabra conjugado a un colorante fluorescente de rojo extremo (1:100) y IgM anti-ratón de cabra conjugado a un tinte fluorescente rojo (1:100).
      NOTA: A partir de este paso, protege las muestras de la luz para evitar el fotoblanqueamiento del fluoróforo.
   3. Incubar muestras a temperatura ambiente (20–25 °C) durante 1 hora en la oscuridad.
   4. Lava los platos tres veces con el tampón de lavado (10 min cada uno) para eliminar los anticuerpos secundarios no unidos.
      NOTA: Almacenar las muestras etiquetadas en PBS a 4 °C (protegidas de la luz) hasta 48 horas antes de la imagen. Incluye controles sin anticuerpos primarios para comprobar la autofluorescencia.

4. Mineralización de fibras de colágeno (realizada DESPUÉS del marcado)

1. Proceso de mineralización
   1. Añade 2 mL de medio mineralizado recién preparado por plato.
   2. Incubar a 37 °C durante 30 minutos (a corto plazo) para la formación mineral en fase temprana (ACP).
   3. Alternativamente, incubar a 37 °C durante 6 horas (a largo plazo) para la cristalización de minerales maduros (HAP).
      NOTA: Mantenga la temperatura exacta entre 37 °C ± 0,5 °C utilizando una incubadora calibrada.
   4. Aspira suavemente el medio de mineralización.
   5. Enjuaga tres veces con agua desionizada (5 mL por lavado, intervalos de 1 minuto).
2. Marcado con fosfato de calcio
   1. Añade 4 μM de un colorante indicador de calcio (por ejemplo, calciína) en PBS (200 μL por plato).
   2. Incuba a temperatura ambiente (20–25 °C) durante 30 minutos en la oscuridad.
      NOTA: El colorante indicador de calcio (por ejemplo, calcina) se une a iones de calcio y no discrimina entre fases amorfa y cristalina; la asignación de fases se basa en el tiempo de mineralización (30 min = ACP, 6 h = HAP). Debe protegerse de la luz con tubos ámbar o papel de aluminio.
   3. Enjuaga cinco veces: tres lavados con agua desionizada y dos lavados con etanol al 70% (1 min cada uno), alternando entre ambos.
3. Preparación de la muestra para imagen
   1. Sumergir muestras en un tampón de imagen: 10% (p/v) glicerol en PBS. Opcionalmente, añade un reactivo antifundido según las instrucciones del fabricante.
   2. Aplicar un volumen suficiente (20–50 μL) de tampón de imagen para cubrir la muestra.
   3. Coloca una cubierta sobre la muestra.
   4. Conserva las muestras a 4 °C en la oscuridad durante hasta 72 horas.

5. Observación bajo un microscopio confocal láser

1. Transferencia de muestras desde almacenamiento a 4 °C a temperatura ambiente (20–25 °C).
2. Deja 10 minutos de equilibrio para evitar condensación.
3. Mantén una protección ligera usando recipientes ámbar o envoltura de papel de aluminio.
4. Verifica que el buffer de imagen cubra toda la muestra.
5. Configura el microscopio confocal con los siguientes ajustes:
   1. Para imagen por colágeno (colorante fluorescente rojo lejano): láser de 647 nm, filtro de emisión de 650-710 nm.
   2. Para imagen con fosfato de calcio (colorante indicador de calcio (por ejemplo, calcina)): láser de 488 nm, filtro de emisión de 500-550 nm.
   3. Objetivo: 100× inmersión en aceite (NA 1,4).
   4. Diámetro del orificio estenopeico: 1 unidad de aireado (UA).
   5. Tiempo de permanencia del píxel: 1-2 μs.
      NOTA: Realizar alineación láser y calibración de orificios estenopeicos antes de la imagen.
6. Realizar escaneo secuencial: primer escaneo con excitación de 647 nm (colágeno).
7. Realizar un segundo escaneo con excitación de 488 nm (mineral).
   NOTA: Recoge canales secuencialmente para evitar que se filtren.
8. Para la reconstrucción 3D, se establece el tamaño del paso de la pila Z a 0,5 μm o menos para asegurar un muestreo adecuado.
9. Guarda archivos con metadatos preservados.
10. Para el análisis de colocalización, utiliza software de análisis de imágenes capaz de calcular el coeficiente de correlación de Pearson (por ejemplo, software disponible públicamente con plugins adecuados).

6. Imagen mediante microscopía de reconstrucción óptica estocástica tridimensional (3D-STORM)

1. Preparación del buffer de imagen^{STORM 22}
   NOTA: La glucosa oxidasa y la catalasa se añaden al tampón de imagen para extraer oxígeno, reduciendo así el fotoblanqueo y prolongando el parpadeo de los fluoróforos, esencial para la localización de moléculas individuales en STORM.
   1. Preparar una solución de stock de glucosa oxidasa (GOx) a 8 mg/mL en un tampón de acetato de sodio de 50 mM (pH 5,1).
   2. Prepara una solución de catalasa a 160 μg/mL en 1× PBS.
      NOTA: Alicuota las piezas enzimáticas, congelalas de repente usando nitrógeno líquido o un baño de hielo seco/etanol, y guárdalas a -20 °C o -80 °C. Evita ciclos repetidos de congelación y descongelación.
   3. Prepara un nuevo amortiguador de imágenes STORM sobre hielo, protegido de la luz.
   4. Combinar los siguientes componentes en el orden indicado para obtener un volumen final de 1 mL: H₂O estéril libre de nucleasas (hasta 1 mL), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM final), 1 M Tris-HCl pH 8,0 (50 μL, 50 mM final), 1 M cisteamina (MEA) recién preparada ajustada a pH ~7,0 (50 μL, 50 mM final), 50% (p/v) de glucosa (200 μL, 10% en carga y volumen final), acción GOx (200 μL, 1,6 mg/mL final), culata de catalasa (200 μL, 32 μg/mL final).
   5. Mezcla suavemente pipeteando o invirtiendo algo. No te pongas en vórtice.
      NOTA: El tampón debe prepararse fresco y mantenerse en hielo protegido de la luz. Úsalo dentro de los 30 minutos posteriores a la preparación. Para optimización detallada de las condiciones de imagen STORM, consulte los protocolos establecidos usando muestras^{de prueba 15}.
   6. Añade 200 μL de buffer de imagen STORM recién preparado para cubrir completamente la muestra.
2. Configuración del sistema 3D-STORM
   1. Asegúrese de que la trayectoria de imagen se dirige a una cámara CCD de multiplicación de electrones (EMCCD).
   2. Activa el módulo de lente cilíndrica para la imagen 3D.
   3. Pon el software en modo adquisición 3D STORM.
   4. Configura los filtros de camino óptico para los tintes utilizados.
   5. Enciende el láser de 647 nm y pon la potencia a un nivel bajo (1-5 mW).
   6. Utilizando un objetivo de inmersión en aceite del 100× (NA ≥1,4), localiza la región de interés en el modo de vista previa en campo amplio o en vivo TIRF.
   7. Adquiere una imagen convencional de fluorescencia de campo amplio para compararla posteriormente.
   8. Cambia al modo de iluminación TIRF.
   9. Calibra el ángulo TIRF para lograr un campo de iluminación fino (~100-200 nm) y así minimizar la fluorescencia de fondo.
   10. Ajusta el tiempo de exposición de la cámara (10-30 ms) en función de la intensidad inicial de la señal.
   11. Ajusta la potencia del láser de imagen en función de la intensidad inicial de la señal.
   12. Realiza una breve prueba de adquisición.
   13. Verifica que los parámetros estén correctamente configurados sin causar un fotoblanqueo rápido.
       NOTA: Asegúrese de alinear con precisión el eje cilíndrico de la lente con el plano de la muestra. La mayoría de los sistemas modernos cuentan con calibración automatizada. Para calibración manual, utiliza perlas fluorescentes de 100 nm para verificar funciones de dispersión simétricas y de punto redondo (PSF).
   14. Comienza con una exposición de 10–30 ms a una potencia láser de 647 nm de 1–2 kW/^cm2.
   15. Verifica que la densidad de parpadeo sea 0,1–1 molécula/^{μm 2}.
   16. Si la densidad es demasiado baja o demasiado alta, ajusta la potencia o el tiempo de exposición del láser en consecuencia.
   17. Repite la verificación y el ajuste hasta alcanzar la densidad ideal.
3. Adquisición de datos 3D-STORM
   1. Pon el software de adquisición en modo "Activación Continua".
   2. Ajusta el láser de imagen (647 nm) a alta potencia (entrada de fibra de 100-500 mW) para hacer pasar la mayoría de los fluoróforos al estado oscuro.
   3. Ajusta el láser de activación (405 nm) a baja potencia (0,1–5 mW).
   4. Optimizar empíricamente la potencia de 405 nm para mantener entre 100 y 200 moléculas localizadas por fotograma en una región de 256×256 píxeles.
   5. Establece el número total de fotogramas entre 10.000 y 20.000.
   6. Utiliza 1 fotograma de luz de activación (405 nm) seguido de 5 fotogramas de luz de imagen (647 nm) por ciclo.
   7. Empieza la adquisición.
   8. Operar el EMCCD con máxima sensibilidad (ganancia EM aplicada)
   9. Usa una exposición de 10–30 ms por fotograma.
   10. Durante la adquisición, monitorizar la densidad de moléculas activas.
   11. Ajusta la potencia láser de 405 nm para mantener un flujo constante de eventos de molécula única.
       NOTA: Los datos de películas en bruto pueden almacenarse en un disco duro estándar para un archivo a largo plazo antes de su reconstrucción.
4. Análisis de datos de mineralización de colágeno (utilizando software de análisis de imágenes con módulo STORM)
   1. En el software de análisis, selecciona el controlador de cámara adecuado (módulo STORM).
   2. Haz clic en [Interfaz de Análisis] en el panel STORM. Se abre la ventana de análisis.
   3. Haz clic en [Archivo abierto]. Selecciona el archivo de imagen de microscopía en bruto para analizar. Haz clic en Abrir.
   4. Determina el valor mínimo de fluorescencia (Altura Mínima) para señales válidas.
   5. Encuentra la mancha más oscura que aún sea reconocible como una señal de una sola molécula.
   6. Mueve el ratón hacia su centro.
   7. Lee el valor de altura de pico.
   8. Anota este valor.
   9. Haz clic en [Configuración de identificación]. En el diálogo, establece los siguientes parámetros: Altura mínima (introduce el valor registrado en el paso 6.4.8), Altura máxima (20000), Línea base CCD (100), y para datos 3D-STORM marca "3D" (desmarca 2D).
   10. Haz clic >> para ampliar más parámetros. Ajustado: Ancho mínimo (nm) a 200, ancho máximo (nm) a 700 (400 para 2D), ancho inicial de ajuste (nm) a 300, relación axial máxima a 2,5 (1,3 para 2D) y desplazamiento máximo (pix) a 1.
   11. Haz clic en OK para cerrar el diálogo.
   12. Realiza un análisis de prueba para validar los parámetros. Desmarca la corrección de deriva.
   13. Ponle los periodos a 1.
   14. Haz clic en [Probar].
   15. Tras el análisis, haz clic en OK en el cuadro de diálogo emergente.
   16. Comprueba que los puntos de señal estén correctamente identificados. No se debe seleccionar mal el ruido de fondo. No se deben perder los lugares verdaderos.
   17. Si no es satisfactorio, repite los pasos 6.4.9–6.4.16 para ajustar los parámetros hasta que sean correctos.
   18. Tras superar el análisis de prueba, realiza el análisis completo. Comprueba la corrección de deriva.
       NOTA: El software de análisis realiza corrección de deriva utilizando un algoritmo redundante de correlación cruzada (RCC) que maximiza la correlación entre segmentos de tiempo de localizaciones moleculares. No se requieren cuentas^{fiduciales 23}.
   19. Mantener los puntos = 1.
   20. Haz clic en [Inicio] (o haz clic en [Prueba] de nuevo, luego en [Iniciar]).
   21. Espera a que el análisis esté completo. Haz clic en OK en el cuadro de diálogo emergente.
   22. Tras el análisis, se generan dos archivos de resultados (.bin y .txt) en la misma carpeta que el archivo .nd2.
   23. Para el análisis de colocalización (canales de 647 nm y 488 nm), mostrar ambos canales simultáneamente en la lista de canales de la ventana de análisis.
   24. Selecciona una región de interés (ROI) adecuada.
   25. Utiliza el módulo de colocalización para calcular el coeficiente de correlación de Pearson. Si no se proporciona automáticamente, exporta manualmente los datos de la nube de puntos a un plugin de colocalización en el software de análisis de imágenes disponible públicamente. Anota el valor.
   26. Realizar análisis en Z-slice para confirmar la mineralización intrafibrilar. En el menú principal, selecciona Ver > paso en Z > Slice.
   27. Extraer planos individuales a intervalos de 60 nm.
   28. Observa la señal mineral (verde, canal de 488 nm). Comprueba si la señal persiste en las secciones centrales (Z = 0 nm ±120 nm). La persistencia confirma la mineralización intrafibrilar.
   29. Opcional: realizar filtrado de densidad para reducir el sobreconteo de emisores densamente empaquetados. Abre la imagen reconstruida de STORM en un software de análisis de imágenes disponible públicamente usando un plugin para análisis de localización de molécula^{única 24}.
   30. Para reducir el sobreconteo de emisores densamente empaquetados, aplica filtrado por densidad (por ejemplo, filtro mediano o umbral local de densidad) basado en la densidad de la señal.
   31. Si la corrección de deriva no estaba habilitada en el paso 6.4.18 o se necesita corrección adicional, realiza corrección por deriva. Correcto según el PSF de los marcadores fiduciales. Alternativamente, utiliza algoritmos de correlación cruzada (por ejemplo, corrección de deriva implementada en el mismo plugin).
   32. Realizar la mezcla espectral para eliminar la diafonía del canal. En la ventana de análisis STORM, haz clic en la herramienta de eliminación de diafonía (normalmente en la esquina inferior derecha).
   33. Configura el radio a 25,0 nm (recomendado). Selecciona el canal de origen. Selecciona el método de eliminación: Se recomienda estadístico.
   34. Para eliminar la activación cruzada causada por el láser de excitación, seleccione Restar además de NSA > Activación cruzada. Haz clic en OK. Se genera automáticamente un nuevo canal, Activación No Específica-Xt.
   35. Validar los niveles de autofluorescencia y las señales de fondo utilizando muestras de control sin teñir. Asegúrate de que todas las señales estén etiquetadas específicamente.
   36. Realiza visualización 3D. Selecciona una región de interés (ROI) en la ventana de análisis.
   37. Haz clic en el botón [3D] (o [Mostrar 3D]). Genera una proyección 3D o renderizado en volumen.
   38. Haz clic derecho para ajustar los parámetros de renderizado. Exporta vídeos en formatos comunes (por ejemplo, .avi o .mp4).
   39. Para clasificar una señal mineral como intrafibrilar, realiza un análisis de corte Z como en 6.4.26–6.4.28. Perfiles de intensidad de exportación.
   40. Define el centro de la fibrilla como el plano Z, donde la señal del colágeno es la más alta.
   41. Una señal mineral se considera intrafibrilar si su intensidad en Z = 0 (centro) y en Z = ±60 nm es el ≥50% de la intensidad máxima mineral en esa fibrilla. Si la señal baja del 30% en Z = 0, clasifique como extrafibrilar.
   42. Registrar la clasificación de al menos 50 fibrillas por condición para calcular el porcentaje de mineralización intrafibrilar.
       NOTA: También existen plugins alternativos disponibles públicamente para filtrado de densidad, corrección de deriva y desmezclado espectral.

Results

La implementación exitosa de este protocolo produce una visualización tridimensional de alta resolución de fibrillas mineralizadas de colágeno utilizando 3D-STORM multicolor. Los siguientes resultados ilustran resultados típicos, controles de calidad y evaluaciones cuantitativas.

La Figura 1 muestra una reconstrucción multicolor 3D-STORM de una red de colágeno mineralizada con fosfato de calcio amorfo (ACP). El colágeno (marcado c...

Discussion

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo integral para la visualización a nanoescala de la mineralización del colágeno utilizando 3D-STORM multicolor. Varios pasos críticos requieren especial atención para garantizar resultados exitosos.

En primer lugar, la preparación de la muestra es fundamental para la imagen de alta calidad de STORM. La aminosilización de platos de fondo de cristal debe ser exhaustiva para asegurar la fijación estable de las fibrilla...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ácido poliaspártico (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Estabilizador para fosfato de calcio amorfo
Cloruro de calcio (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Fuente de calcio
Fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Fuente de fosfato
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Ajustador de fuerza iónica
Ácido poliacrílico (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Estabilizador para calcio de alta concentración
Base de Tris	Sigma-Aldrich	T1503	Componente del búfer
Azida de sodio (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Agente antimicrobiano
(3-Aminopropil)trietoxisilano (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Agente de funcionalización de superficie de vidrio
Etanol absoluto	Sigma-Aldrich	459836	Solvente
Solución de colágeno tipo I (50 μg/mL en ácido acético 0.1 M)	Corning	354249	Andamio de autoensamblaje
Condroitín sulfato (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Mímica de proteína no colagénica
EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida)	Sigma-Aldrich	E7750	Agente reticulador
NHS (N-hidroxisuccinimida)	Sigma-Aldrich	130672	Activador del agente reticulador
Ácido libre MES	Sigma-Aldrich	M5287	Búfer para reticulación
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco	10010023	Búfer de lavado y dilución
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Agente de bloqueo
Anticuerpo anti-colágeno-I de conejo	Abcam	ab34710	Anticuerpo primario para colágeno
Anticuerpo anti-condroitín sulfato de ratón	Sigma-Aldrich	C8035	Anticuerpo primario para CS
IgG anti-conejo de cabra conjugado con colorante fluorescente de lejano rojo (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Anticuerpo secundario para colágeno
IgM anti-ratón de cabra conjugado con colorante fluorescente rojo (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Anticuerpo secundario para CS
Calceína (colorante indicador de calcio)	Sigma-Aldrich	C0875	Etiqueta de fosfato de calcio
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Detergente para el búfer de lavado
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516	Componente del búfer de imagen
Glucosa oxidasa (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Capturador de oxígeno
Catalasa	Sigma-Aldrich	C1345	Capturador de oxígeno
Cisteamina (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Tiol para parpadeo de fluoróforo
D-Glucosa	Sigma-Aldrich	G6152	Sustrato para glucosa oxidasa
Aceptato de sodio	Sigma-Aldrich	S2889	Búfer para stock de GOx
Ácido clorhídrico (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Ajuste de pH
Hidróxido de sodio (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	Ajuste de pH
Ácido fosfotúngstico	Sigma-Aldrich	P4006	Tinte negativo para TEM
Platos de cultivo con fondo de vidrio (35 mm, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Sustrato de muestra; espesor 0.17 mm
Limpiador ultrasónico (40 kHz)	Branson	B200	Dispositivo de limpieza
Cámara de humedad	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Para autoensamblaje de colágeno
Microscopio electrónico de transmisión	Hitachi	HT7800	Imágenes TEM
Rejillas TEM recubiertas de formvar/carbono (200 malla)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	Soporte de muestra para TEM
Plataforma de agitación horizontal	Labnet	S2030-RC	Lavado suave
Microscopio confocal de barrido láser	Nikon	A1	Pantalla preliminar
Sistema de microscopía 3D-STORM (con láseres 405/488/647 nm, lente cilíndrica, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Imágenes de superresolución
Objetivo de inmersión en aceite 100× (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	Imágenes de alta resolución
pH metro	Mettler Toledo	FiveGo F2	Control de pH
Software de adquisición y análisis STORM	Nikon	NIS-Elements (módulo STORM)	Adquisición y procesamiento de datos STORM
Formato de archivo.nd2 (archivo de imagen de microscopía sin procesar)	Nikon	N/A	Formato de archivo de imagen sin procesar generado por microscopios Nikon.
Software de análisis de imágenes de acceso público	Código abierto	N/A	p. ej., ImageJ con el complemento ThunderSTORM para el análisis de localización de moléculas individuales (colocalización, corrección de deriva)
Parafilm	Bemis	PM996	Cubriendo muestras durante la incubación
Papel de aluminio	Cualquier proveedor de laboratorio	N/A	Para protección contra la luz (por ejemplo, envolver muestras)
Tubos de microcentrífuga ámbar	Fisher Scientific	05-669-21	Para la protección contra la luz de los fluoróforos
Laminillas (Núm. 1.5)	Corning	2855-18	Montaje de muestra