El patrón tridimensional de biofilms de ingeniería con un Bioprinter hágalo usted mismo
May 16th, 2019
Este artículo describe un método para transformar una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora 3D bacteriana que puede facilitar la impresión de biofilms estampados. Se describen todos los aspectos necesarios de la preparación del bioprintro y la bio-tinta, así como los métodos de verificación para evaluar la formación de biofilms.
La bioimpresión 3D con bacterias es una técnica recientemente desarrollada. Este protocolo proporciona una forma fácil de construir biopelículas de ingeniería 3D impresas con bacterias. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de producir biopelículas impresas en 3D utilizando una impresora 3D casera de bajo costo.
Una posible aplicación de nuestra impresora 3D es crear biopelículas de modelos reproducibles que se pueden utilizar para desarrollar nuevas terapias antibacterianas. Nuestro enfoque de impresión 3D se puede aplicar a cualquier tipo de bacteria que sea compatible con nuestro bioenlacimiento a base de alginato. La preparación del bioenlado y de los sustratos de impresión son procedimientos bastante estándar, mientras que el proceso de impresión 3D, especialmente la calibración del eje Z es un paso crucial que requiere cierta práctica.
La calibración de la altura de acceso establecida influirá en la resolución de nuestra impresora 3D y depende en gran medida de la experiencia personal. Este procedimiento requiere ajustes manuales y es difícil describirlo en un formato escrito. Conecte una punta de pipeta de 200 microlitros a una longitud de tubería de silicona y monte la punta de la pipeta en el cabezal del extrusor de la impresora 3D como reemplazo del extrusor original.
A continuación, añadir cuatro mililitros de una solución de cloruro de calcio molar a 400 mililitros de 1%agar disuelto en caldo Luria-Bertani, y complementarlo con los antibióticos e inductores adecuados. A continuación, dispensar 20 mililitros de la solución de agar LB en cada plato Petri de 150 milímetros por 15 milímetros. Seque el plato durante 30 minutos a temperatura ambiente, con la tapa medio abierta.
Preparar una solución de alginato de sodio al 3% y calentarla hasta el punto de ebullición tres veces para esterilizar la solución. A continuación, guarde la solución estéril a cuatro grados centígrados hasta que se utilice. Para preparar el componente bacteriano del bioenlaz, las bacterias E.coli transportan plásmidos para la expresión constitutiva de la GFP en 50 mililitros de medio LB que contienen antibióticos.
Agitar el cultivo a 250 RPM y 37 grados Celsius durante la noche. Después del crecimiento nocturno del cultivo, peletizar las bacterias durante cinco minutos a 3, 220 veces la gravedad y luego eliminar el sobrenadante. Resuspender el gránulo de bacterias en 10 mililitros de medio LB, y añadir 10 mililitros de 3%alginato de sodio.
Conecte la impresora 3D a un ordenador y abra el software de impresión 3D. Haga clic en el botón Inicio de los ejes X, Y y Z para mover el cabezal de impresión a su posición inicial. Para cada impresión, coloque un sustrato de impresión preparado en una ubicación particular de la cama de impresión.
Levante el cabezal de impresión a una altura de más de 22 milímetros bajo control manual, para que no colisione con el borde de la placa Petri durante el movimiento. Coloque el cabezal de impresión sobre la parte superior de la placa y muévalo hacia abajo hasta que la punta de la pipeta entre en contacto con la superficie de impresión. Asigne esta posición del eje Z como Z1, la altura de la superficie de impresión.
A continuación, levante el cabezal de impresión y muévalo manualmente fuera del área de la placa. Si la distancia de trabajo entre el cabezal de impresión y la superficie de la placa se define como Z2, introduzca la altura de la superficie de impresión más la distancia de trabajo en el programa de impresión como el valor Z durante la impresión. Cargue un archivo de código G preprogramado que contenga comandos para imprimir la forma deseada.
En cada línea de comando, la posición del cabezal de impresión se puede cambiar en los ejes X, Y y Z. Asegúrese de introducir el valor Z durante todos los pasos de impresión como la altura de la superficie de impresión más la distancia de trabajo. Cargue el bioenergiente líquido en jeringas y móntelo en la bomba de jeringa de la bioimpresora 3D.
A continuación, establezca la velocidad de extrusión en 0,3 mililitros por hora. Imprima el bioenlaciente en el sustrato de impresión haciendo clic en el botón Imprimir. Espere a encender la bomba de la jeringa hasta que haya comenzado la impresión y antes de que el cabezal de impresión entre en contacto con la superficie de impresión.
Durante la impresión, controle el movimiento del cabezal de impresión por completo mediante el software. Detenga la bomba de la jeringa tan pronto como el cabezal de impresión llegue al último punto de impresión, de lo contrario el exceso de bioenlaces caerá sobre el sustrato de impresión y reducirá la resolución de impresión. Para la construcción de estructuras 3D, todos los movimientos del cabezal de impresión se controlan en el editor de código G.
Para aumentar la altura de impresión de la segunda capa, escriba la altura de impresión de la primera capa y aumente el valor Z en el código en 0,2 milímetros. A partir de entonces, aumente el valor Z en 0,1 milímetros, cuando se mueva a una capa superior. Incubar las muestras impresas a temperatura ambiente durante tres a seis días para permitir la producción de los componentes del biofilm como las fibras Curli.
A continuación, coloque la placa en un escáner fluorescente e imagine las placas. Para disolver la matriz de alginato, agregue 20 mililitros de una solución de citrato sódico molar de 0,5 al pH 7, al sustrato impreso. Incubar la placa a temperatura ambiente durante dos horas mientras se agita a 30 rpm.
A continuación, deseche el líquido e vuelva a poner la imagen de las placas, para compararlas con las imágenes de las placas antes y después del tratamiento con citrato. La bioimpresora 3D puede crear bacterias encapsulando hidrogeles en una variedad de formas bidimensionales y tridimensionales. Estas formas impresas se pueden utilizar para evaluar si la formación de biopelícula fue exitosa o si la matriz de alginato se disuelve completamente utilizando una solución de citrato de sodio.
En el caso del bioenergía sin el plásmido de producción inducible Curli, el patrón impreso se disolvió por completo después del tratamiento del citrato de sodio, lo que significa que no se había formado ninguna red Curli de biopelícula. Las bacterias que contenían el plásmido de producción Inducible Curli no se disolvieron después del tratamiento de citrato de sodio, lo que indica que las bacterias impresas fueron capaces de formar una red Curli lo suficientemente extensa como para estabilizar el patrón impreso de bacterias. Para construir estructuras de varias capas, se pueden imprimir capas adicionales controlando el editor de código G.
El aumento del número de capas impresas en una muestra hizo que el ancho y la altura de las estructuras impresas aumentaran incrementalmente. Cuando E.coli diseñó para producir induciblemente proteínas Curli se imprimieron en estructuras multicapa, el tratamiento de citrato de sodio no disuelvió las muestras, mientras que las estructuras multicapa que contenían E.coli no produce Curli se disolvieron. Las partes más críticas del procedimiento de impresión 3D son la calibración del eje Z y la coordinación de iniciar la impresión e iniciar la bomba de la jeringa.
El bioencáner desarrollado para este proceso es bastante suave, con baja tenacidad. Se podrían hacer más modificaciones en el bioenlado, con el fin de proporcionar y mejorar la estabilidad mecánica. Esta técnica de impresión 3D permite la producción de biopelículas con excelentes propiedades mecánicas, lo que puede permitir la fabricación de materiales biomiméticos.
Cuando manipule estas bacterias, use una protección adecuada, como guantes.
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Visión general
Este artículo presenta un método para transformar una impresora 3D comercial de bajo costo en una impresora 3D bacteriana capaz de imprimir biopelículas con patrones. Se detalla la preparación de la bioimpresora, la biotinta y los métodos de verificación para evaluar la formación de biopelículas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Bioimpresión 3D
- Microbiología
- Bioingeniería
Antecedentes
- La bioimpresión 3D con bacterias es una técnica emergente.
- Este método permite la construcción de biopelículas diseñadas.
- Utiliza una impresora 3D casera económica.
- Las aplicaciones incluyen el desarrollo de nuevas terapias antibacterianas.
Propósito del estudio
- Crear biopelículas modelo reproducibles.
- Facilitar el desarrollo de terapias antibacterianas.
- Demostrar la versatilidad de la impresión 3D con varias bacterias compatibles.
Métodos utilizados
- Preparación de biotinta a base de alginato.
- Calibración del eje Z de la impresora 3D.
- Procedimientos estándar para la impresión de sustratos.
- Métodos de verificación para la formación de biopelículas.
Principales resultados
- Impresión exitosa de biopelículas con patrones.
- Compatibilidad demostrada con varias bacterias.
- Reproducibilidad establecida de las biopelículas modelo.
- Solución rentable para la ingeniería de biopelículas.
Conclusiones
- El método mejora la accesibilidad a la tecnología de bioimpresión 3D.
- Abre vías para la investigación en terapias antibacterianas.
- Se fomenta la optimización adicional del proceso de impresión.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables reproducible, engineerable biofilm model systems for antibacterial therapeutic development and environmental applications. By providing a low-cost, accessible platform for spatially-controlled biofilm fabrication, it supports early-stage target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery pipelines. The approach facilitates predictive confidence in biofilm-related mechanisms without requiring specialized bioprinting infrastructure.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of biofilm formation mechanisms through inducible expression of matrix proteins like Curli.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of genetic and environmental factors influencing biofilm stability and antibiotic resistance.
- Predictive Value: Provides quantifiable biofilm output via resistance to sodium citrate dissolution, enabling go/no-go decisions on target pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, spatially-patterned biofilm substrates for consistent compound screening against biofilm-associated phenotypes.
- Operational Value: Uses alginate-based bioink compatible with various bacteria, allowing assay adaptation across target strains without reformulation.
- Scalability: Enables multi-layered structure production with incremental Z-axis adjustments, supporting dose-response and time-course screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Produces biofilm models that mimic extracellular matrix-mediated antibiotic resistance, relevant for preclinical efficacy testing.
- Mechanistic De-risking: Allows visualization of biofilm components (e.g., Curli fibers) via fluorescence imaging before and after matrix dissolution, confirming target engagement.
- Continuity: Supports progression from discovery-scale biofilm modeling to preclinical evaluation of antibiofilm agents.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for antimicrobial programs focusing on biofilm-associated tolerance.
- Discovery Biology: Tests therapeutic hypotheses by engineering biofilm-deficient strains and assessing structural integrity post-treatment.
- Screening: Delivers reproducible biofilm formats with quantifiable readouts (e.g., fluorescence, dissolution resistance) for high-content compound evaluation.
- Analytics: Enables comparison of biofilm formation across conditions via imaging and biochemical extraction, supporting data-driven prioritization.
- Translational Research: Connects in vitro biofilm models to preclinical validation by demonstrating matrix-dependent phenotypic resistance.
- Enterprise Reuse: Represents a modular, adaptable platform applicable across bacterial targets and biofilm-related indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in biofilm formation by linking genetic induction to matrix production and structural stability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized bioink preparation and Z-axis calibrated printing, minimizing variability across runs.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling biofilm model generation on low-cost, modified consumer-grade printers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying compounds that disrupt biofilm matrix without affecting planktonic growth.
Implementation Considerations
- Requires microbiological expertise for sterile bioink preparation and bacterial handling under biosafety guidelines.
- Depends on precise Z-axis calibration and synchronization of print head movement with syringe pump extrusion to maintain resolution.
- Necessitates standardization of substrate preparation (e.g., calcium chloride-agar plates) and induction timing for consistent biofilm protein expression.
- Adaptation to alternative bacterial strains may require optimization of inducer concentration and alginate concentration for viability and printability.
- Practical limitations include bioink softness and low toughness, which may restrict mechanical testing applications without further crosslinking or polymer modification.
