Reconstruction et analyse 3D de structures neuronales subcellulaires minces à l’aide de données de microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisés

Summary

Un pipeline méthodologique flexible pour identifier, visualiser et quantifier les processus neuronaux subcellulaires minces dans des volumes d’images de microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés à l’aide de progiciels open source conviviaux.

Abstract

Les progrès récents des technologies de microscope électronique à balayage permettent désormais l’analyse tridimensionnelle (3D) rapide des processus subcellulaires ultraminces. Ici, un pipeline méthodologique est présenté pour identifier, visualiser et analyser les processus neuronaux minces, tels que ceux qui se projettent dans les boutons présynaptiques d’autres neurones (appelés « spinules »). À l’aide de progiciels disponibles gratuitement, ce protocole montre comment utiliser un arbre de décision pour identifier des structures subcellulaires neuronales communes à l’aide de critères morphologiques dans des volumes d’image de microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM), avec une attention particulière à l’identification d’une diversité de spinules projetés dans des boutons présynaptiques. En particulier, ce protocole décrit comment tracer les spinules dans les synapses neuronales pour produire des reconstructions 3D de ces projections subcellulaires minces, de leurs neurites parents et de leurs partenaires postsynaptiques. De plus, le protocole comprend une liste de logiciels open source disponibles gratuitement pour l’analyse des données FIB-SEM et offre des conseils (par exemple, lissage, éclairage) pour améliorer les reconstructions 3D à des fins de visualisation et de publication. Ce protocole adaptable offre un point d’entrée dans l’analyse rapide à l’échelle nanométrique des structures subcellulaires dans les volumes d’images FIB-SEM.

Introduction

Les études sur les relations structure-fonction des composants subcellulaires nanométriques bénéficient souvent de la visualisation et de l’analyse 3D¹. Cependant, les études de microscopie électronique à transmission de section en série ont été limitées dans le temps et l’espace par la nécessité d’utiliser un couteau diamanté pour couper et aligner des centaines à des milliers de sections ultraminces en série de ≥40 nm. Ces contraintes ont limité la capacité d’échantillonner et d’analyser efficacement des structures subcellulaires minces (<40 nm de diamètre), et la nécessité de maîtriser le sectionnement en série ultramince a entravé l’application des analyses structurelles 3D ^2,3. Cependant, les progrès récents de la microscopie électronique à balayage à faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM) ont révolutionné la vitesse et la résolution des volumes d’images disponibles et permettent désormais l’analyse quantitative de structures subcellulaires minces telles que le réticule endoplasmique lisse ^4,5, les synapses neuronales ^3,6 et les vésicules synaptiques ^7,8 à l’échelle. De plus, l’utilisation plus large des volumes d’images FIB-SEM a accéléré le développement de dépôts de volumes d’images FIB-SEM⁹ librement accessibles et de logiciels d’analyse 3D (par exemple, Espina¹⁰, IMOD¹¹, Neuromorph¹², Reconstruct¹³, TrakEM¹⁴) qui élargissent la portée de cette technologie et permettent désormais d’étudier la structure et la fonction des structures subcellulaires fines.

L’une de ces caractéristiques subcellulaires à l’échelle nanométrique est la « spinule » synaptique neuronale. Les spinules sont de fines projections (~0,06-0,15 μm de large, 0,1-1 μm de long), en forme de doigt, qui émanent d’un neurone et sont encapsulées par le neurite (par exemple, le bouton présynaptique) d’un autre neurone^15,16. Des spirules intégrées dans les processus neuronaux ont été signalées dans la littérature de microscopie électronique depuis près de 60 ans¹⁷, et les protubérances de type spinule sont une caractéristique conservée 18,19,20 et omniprésente^21,22 des synapses excitatrices. Néanmoins, malgré l’omniprésence des spinules synaptiques, leur fonction reste obscure et les données nécessaires pour expliquer leur abondance et leur conservation structurelle sont rares. Ce manque de caractérisation expérimentale des spinules est principalement dû à la difficulté d’analyser quantitativement la prévalence et la taille des spinules. Leurs petites dimensions sont les plus adaptées aux analyses utilisant une résolution z (profondeur) jusqu’alors inaccessible (c’est-à-dire ≤15 nm).

Ici, un pipeline d’analyse FIB-SEM est présenté pour identifier, visualiser et analyser des structures subcellulaires minces (avec des sections efficaces de ≤40 nm de large) qui peuvent servir de point d’entrée pour les nouveaux arrivants et les experts FIB-SEM. Ce protocole sert d’amorce à l’identification des structures subcellulaires neuronales dans un volume d’image 3D FIB-SEM, en mettant l’accent sur l’utilisation de critères spécifiques pour reconnaître et classer les sous-types de spinules et de synapses. De plus, le protocole montre comment importer des volumes d’images dans une plate-forme logicielle d’analyse 3D gratuite (Reconstruct), utiliser ce logiciel pour tracer des spinules dans des synapses neuronales excitatrices et produire des reconstructions 3D de ces projections subcellulaires, de leurs neurites parents et de l’encapsulation des boutons présynaptiques. Enfin, le protocole montre comment utiliser un logiciel de traduction 3D gratuit et open-source (Blender) pour lisser la « peau » des reconstructions 3D à des fins de visualisation et de publication potentielle, en détaillant les avantages et les pièges potentiels de cette technique.

Protocol

1. Données de volume d’image et taille de l’objet subcellulaire : considérations et enregistrement

1. Obtenir un volume d’image FIB-SEM de qualité de la zone d’intérêt contenant les objets subcellulaires d’intérêt.
   REMARQUE : Ce protocole utilise des segments d’un volume d’image FIB-SEM du cortex visuel primaire du furet adolescent (24,2 x 16,2 x 2,4 μm, voxels isotropes de 4 nm), et un volume FIB-SEM librement accessible de l’hippocampe CA1 du rat adulte (10,2 x 7,7 x 5,3 μm ; voxels isotropes de 5 nm) mis à disposition par le laboratoire Knott (https://www.epfl.ch/labs/cvlab/data/data-em/). Il est essentiel de préparer des blocs tissulaires pour la FIB-SEM à l’aide d’un protocole qui préserve les détails ultrastructuraux et produit un contraste élevé dans des conditions d’imagerie FIB-SEM^23,24. Il est important de noter que le tissu doit être imagé de telle sorte que la résolution du voxel de l’image FIB-SEM résultante soit de <0,5 × la taille du diamètre de la plus petite structure subcellulaire d’intérêt. Par exemple, parce que les sites de protrusion des spinules dans les boutons présynaptiques peuvent avoir un diamètre aussi petit que 30 nm, une taille de voxel de <15 nm serait appropriée pour échantillonner ces structures au-dessus du critère de Nyquist. De plus, il est utile d’imager les tissus à une résolution isotrope (égale dans toutes les dimensions) (par exemple, 5 x 5 x 5 nm voxels) pour permettre la visualisation et la reconstruction de structures fines ayant des dimensions égales dans tous les plans x/y/z.
2. Téléchargez et installez la distribution Fiji d’ImageJ²⁵ (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
3. Alignez le volume de l’image.
   REMARQUE : Alors que les systèmes FIB-SEM modernes produisent des volumes d’image grossièrement alignés, le recalage d’image à image peut toujours souffrir d’une dérive sous-pixel.
   1. Aux Fidji, accédez à Plugins | Inscription et choisissez Enregistrer les tranches de pile virtuelle. Consultez le manuel d’utilisation pour obtenir de l’aide (https://imagej.net/Register_Virtual_Stack_Slices). Commencez par un enregistrement Rigid puis utilisez une technique Affine si nécessaire.
4. Mettez à l’échelle le volume de l’image.
   1. Ouvrez le volume de l’image alignée dans Fidji en cliquant sur Fichier | Importation | Séquence d’images et en naviguant jusqu’au dossier avec les images alignées.
   2. Dans la fenêtre de dialogue, cliquez sur Trier les noms numériquement si les images sont nommées dans l’ordre numérique. Cliquez sur Utiliser la pile virtuelle pour des performances Fiji plus rapides.
   3. Une fois l’image ouverte, cliquez sur Image | et insérez la taille physique des pixels du volume de l’image en micromètres dans les zones hauteur, largeur et profondeur des pixels. Tapez um OU μm dans chacune des cases les plus à droite. Enregistrez ce volume d’image aligné en tant que fichier .tiff en cliquant sur Fichier | Enregistrer sous | Tiff.
      REMARQUE : Si l’image a été mise à l’échelle, le haut de l’image doit maintenant indiquer la taille de l’image en micromètres (par exemple, 9,82 x 8,65 μm).

2. Identification des neurites et des spinules synaptiques

1. Lorsque vous faites défiler la pile (à l’aide des touches fléchées ou de la molette de la souris), reportez-vous à l’arbre de décision d’identification des neurites (Figure 1) et à des exemples de neurites sectionnés (Figure 2) pour localiser et identifier les objets d’intérêt.
   1. Identifiez les spinules synaptiques comme des protubérances membranaires d’un neurite qui devient entièrement enveloppé dans un neurite présynaptique ou postsynaptique.
      REMARQUE : L’identification positive du spinule synaptique nécessite une preuve visuelle de l’invagination de la membrane de l’objet saillant dans la membrane inversée d’une structure présynaptique ou postsynaptique et de la présence du spinule lié à la membrane entièrement encapsulé par la membrane de la structure pré- ou postsynaptique dans au moins une image.
2. Création de régions d’intérêt (ROI) aux Fidji
   1. Cliquez sur un outil approprié dans la barre d’outils Fidji (par exemple, l’outil ovale), puis cliquez et faites glisser sur l’image pour former un retour sur investissement. Enregistrez ce retour sur investissement dans le gestionnaire de retour sur investissement en tapant la lettre « T ».
      REMARQUE : Le gestionnaire de retour sur investissement doit maintenant apparaître avec les coordonnées de l’image comme nom par défaut.
   2. Renommez le retour d’intérêt comme vous le souhaitez en cliquant sur le bouton Renommer dans le gestionnaire de retour au sol et en tapant le nom souhaité dans la zone de texte qui s’affiche. Renommez les zones d’intérêt en fonction de critères quantitatifs (par exemple, le 12^e bouton présynaptique qui est analysé et qui a deux synapses avec des épines postsynaptiques pourrait être nommé B12_s,s).
      REMARQUE : Pour associer chaque retour d’intérêt à une « tranche » d’image (plutôt que de l’avoir présent dans toute la pile d’images) et pour rendre les noms de retour d’intérêt visibles sur des images uniques, cliquez sur ces options dans le Gestionnaire de retour sur investissement | En savoir plus | Options , puis cliquez sur les cases à cocher Afficher tout et Étiquettes en bas du Gestionnaire de retour sur investissement. Notez que cette étape est cruciale lors de l’enregistrement des zones d’intérêt dans un volume d’image, car l’association de zones d’intérêt à l’ensemble du volume d’images plutôt qu’à des images individuelles peut entraîner un double comptage des objets dans le volume.
   3. Pour enregistrer tous les retours sur investissement actuellement dans le gestionnaire de retour sur investissement sous forme de fichier, cliquez d’abord sur le bouton Désélectionner dans le gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur le bouton Plus et faites défiler jusqu’à Enregistrer.
      REMARQUE : Ce fichier .zip enregistré peut maintenant être ouvert dans Fiji pour recharger tous ces retours sur investissement dans le gestionnaire de retour sur investissement.

3. Déterminez la zone d’intérêt et transférez le volume de l’image vers un logiciel d’analyse 3D

1. Déterminez s’il est souhaitable de transférer l’intégralité du volume d’images vers le logiciel de reconstruction et d’analyse 3D, ou si une sous-pile plus petite (voir 3.3.2) doit être créée pour analyser un plus petit nombre d’images et/ou de régions d’intérêt à partir de la pile d’origine.
2. Effectuer une petite étude pilote sur une zone relativement petite contenant le ou les objets d’intérêt afin d’estimer l’ampleur de l’effet et le nombre d’objets d’intérêt nécessaires pour obtenir la puissance souhaitée pour les comparaisons statistiques. Utiliser une estimation prudente de la taille du volume d’image nécessaire pour échantillonner les objets d’intérêt si ces objets subcellulaires ne sont pas répartis uniformément dans le volume d’image.
3. Pour utiliser une partie du volume d’image pour l’analyse 3D, dupliquez d’abord le volume d’image en cliquant sur Image | Dupliquer.
   1. Pour utiliser une partie recadrée de l’image à des fins d’analyse, choisissez l’outil Rectangle dans la barre d’outils Fidji et dessinez la région d’intérêt souhaitée. Si ce n’est pas souhaité, passez à l’étape suivante.
   2. Aller à l’image | Piles | Outils | Créez une sous-pile. Tapez la plage d’images à inclure dans la sous-pile (par exemple, inclure les images de 1 à 500 en tapant de 1 à 500) dans la zone de texte.
   3. Reportez-vous aux considérations d’échantillonnage ci-dessus (note après 1.1) pour déterminer la résolution z requise en fonction de la taille du ou des objets d’intérêt. Par exemple, si le volume de l’image a une profondeur de voxel de 5 nm, il est possible d’échantillonner l’objet d’intérêt à des intervalles de 10 nm dans la dimension z afin que Fidji conserve toutes les autres images de la sous-pile. Pour ce faire, tapez le numéro de la nième image après la plage (par exemple, pour n’inclure que toutes les autres images dans une plage de 1 à 500 images, tapez 1 - 500 - 2).
      REMARQUE : Chaque progiciel d’analyse 3D (voir Tableau 1) aura ses propres exigences en matière d’importation de fichiers. Ce protocole se concentre sur l’importation de volumes d’images enregistrés sous forme de fichiers .tiff dans le logiciel de volumes d’images, Reconstruct.

4. 3D reconstructions et l’analyse de structures subcellulaires minces dans Reconstruct

REMARQUE : Il est très avantageux d’utiliser une souris équipée d’une molette lors de l’utilisation de Reconstruct. De plus, si la plupart ou la totalité des traçages sont effectués manuellement, l’utilisation d’un stylet pour dessiner des contours sur un ordinateur doté d’un écran tactile peut augmenter considérablement l’efficacité du traçage.

1. Téléchargez et installez Reconstruct (https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0) pour une utilisation sur un ordinateur exécutant Microsoft Windows dans un environnement natif ou virtuel.
2. Démarrez une nouvelle reconstruction en créant un nouveau dossier pour les fichiers de reconstruction, en cliquant sur Série | Nouveau, et en enregistrant cette reconstruction (fichier .ser) avec le nom de fichier souhaité dans le dossier qui vient d’être créé.
3. Importez le volume d’images .tiff enregistré dans Reconstruct.
   1. Accéder à la série | Importation | Images, cliquez sur Sélectionner dans la fenêtre Importer des images et recherchez le fichier de volume d’image. Dans la fenêtre Importer des images , recherchez les fichiers de volume d’images qui apparaissent sur une ligne distincte pour chaque image du volume.
   2. Important : Saisissez la taille de pixel correcte dans la zone de texte Taille de pixel pour correspondre à la taille de pixel x/y (en μm) du volume de l’image. Une fois cela fait, cliquez sur le bouton Importer dans la fenêtre Importer des images .
      REMARQUE : Une fois les images importées, il doit y avoir une image au milieu de la fenêtre Reconstruire et la liste Importer des images doit être vide.
   3. S’il y a une image au milieu de la fenêtre Construire et que la liste Importer des images est vide, cliquez sur Quitter dans la fenêtre Importer des images .
   4. Définissez l’épaisseur de la section (c’est-à-dire la hauteur du voxel ou la dimension z) en cliquant sur Section | Listez les sections, en mettant en surbrillance toutes les sections répertoriées, puis cliquez sur Modifier | Epaisseur dans le menu Liste des sections et en saisissant l’épaisseur de la section (en μm) dans la zone de texte (par exemple, 0,005 pour une section de 5 nm d’épaisseur).
      REMARQUE : N’oubliez pas que si vous travaillez avec une sous-pile d’un volume d’image d’origine plus important qui ne comprend que chaque énième section (voir l’étape 3.3.3), il est nécessaire de tenir compte de ces sections « manquantes » dans l’épaisseur totale de la section. Par exemple, si l’épaisseur de la section du volume de l’image d’origine (c’est-à-dire la hauteur du voxel) était de 0,005 μm et que la sous-pile ne comprend qu’une section sur trois (par exemple, 1-500-3), l’épaisseur de la section de cette sous-pile est de 0,015 μm (c’est-à-dire 0,005 μm x 3 sections).
4. Faites des traces des objets d’intérêt.
   1. Aller à la série | Les options | Onglet/Noms pour donner un nom au nouvel objet. Choisissez une couleur pour le contour et le remplissage intérieur des traces de l’objet, puis cliquez sur OK.
      REMARQUE : Reconstruct tentera de connecter toutes les traces portant le même nom qu’un seul objet. Reportez-vous au manuel Reconstruct pour connaître les conventions de nommage des traces (par exemple, n’incluez pas d’espaces dans les noms). Les couleurs de trace servent simplement à visualiser les traces ; la couleur de la reconstruction 3D de cet objet peut être facilement modifiée par la suite.
   2. Dans la barre d’outils, sélectionnez l’outil Dessiner à main levée qui ressemble à un crayon. Maintenez le bouton gauche de la souris enfoncé et faites glisser la souris pour tracer la membrane de l’objet ; Relâchez le bouton gauche de la souris pour compléter automatiquement la trace. Cliquez sur Page précédente / Page suivante ou utilisez la molette de la souris pour passer à la section optique suivante dans le volume de l’image et effectuez progressivement des traces jusqu’à ce que la structure soit complète.
5. Tracer les spinules synaptiques
   REMARQUE : Les spinules intégrés dans les boutons présynaptiques apparaissent comme des structures transparentes liées à la membrane, parfois avec un matériau opaque aux électrons semblable à l’actine et/ou des plis membranaires à l’intérieur.
   1. Avancez dans le volume de l’image et localisez le site d’invagination des spinules dans le bouton présynaptique, en prenant soin de différencier les spinules des réticules endoplasmiques, des vacuoles, des endosomes, des autophagosomes et d’autres organites subcellulaires.
      REMARQUE : Contrairement aux organites liés à la membrane, assurez-vous que les spinules synaptiques projettent toujours à partir d’un neurite/glie (c’est-à-dire une membrane inversée) et sont reçues par (c’est-à-dire une membrane inversée) une structure pré- ou postsynaptique. Cette preuve visuelle d’invagination des spinules devrait se produire dans les images ≥2, et un spinule entièrement encapsulé lié à la membrane devrait être présent dans la structure pré- ou postsynaptique dans l’image ≥1. Les petites spinules peuvent être recouvertes de clathrine. Pour différencier les événements d’invagination des spinules de l’endocytose enrobée de clathrine dans le neurite pré- ou postsynaptique, assurez-vous que l’identification positive des spinules recouvertes de clathrine nécessite une confirmation visuelle de la membrane d’éversion coïncidente de l’objet parent du spinule projetée dans la membrane inverse d’une structure pré- ou postsynaptique dans la même image.
   2. Avancez dans le volume de l’image pour localiser le site de projection/origine de la spinule à partir de son neurite/glie parent ; reportez-vous à la figure 1 et à la figure 2 pour vous aider à identifier ces structures parentes.
   3. Commencez le traçage de la spinule au site de protubérance de la membrane dans la structure réceptrice (par exemple, le bouton présynaptique) et continuez à dessiner la spinule aussi longtemps qu’elle apparaît comme une structure liée à la membrane dans le neurite pré- ou postsynaptique d’encapsulation.
   4. Maintenez le bouton gauche de la souris enfoncé (ou continuez à dessiner le long de la membrane du spinule avec un stylet si vous utilisez un ordinateur à écran tactile) tout en traçant la membrane du spinule avec le pointeur de la souris.
   5. Lorsque le point de départ de la trace est atteint, relâchez le bouton gauche de la souris.
      REMARQUE : Relâcher le bouton gauche de la souris trop tôt complétera automatiquement la trace, souvent avec des résultats indésirables. Si cela se produit, appuyez simplement sur Supprimer pendant que cette trace est mise en surbrillance dans la liste des traces.
   6. Répétez les étapes 4.5.2 à 4.5.5 pour chaque section où le spinule apparaît.
      REMARQUE : N’oubliez pas de tracer le spinule comme une structure membranaire encapsulée à l’intérieur du bouton le cas échéant. Étant donné que Reconstruct ne permet pas la soustraction automatique de structures subcellulaires encapsulées (par exemple, des spinules, des organites subcellulaires) du volume de la structure d’encapsulation, cela peut être effectué a posteriori (par exemple, en soustrayant simplement le volume des spinules du volume total du bouton présynaptique).
6. Reconstruction d’objets en 3D dans Reconstruct
   1. Accéder à la série | Les options | 3D, et assurez-vous que vous cliquez sur le bouton radio Traces .
   2. Ouvrez la liste d’objets en cliquant sur Objets | Lister les objets.
   3. Une fois que les noms du ou des objets tracés se chargent dans la fenêtre, double-cliquez sur le nom du ou des objets dans la liste d’objets pour les visualiser en 3D. Attendez que la fenêtre Scène 3D s’affiche.
   4. Assurez-vous que le début, la fin et le nombre de traces sont corrects dans la liste d’objets pour chaque objet, de sorte que le nombre = fin - début. Si l’option Compter ≠ Fin - Début pour un objet, il se peut qu’une ou plusieurs traces de cet objet aient été omises par erreur.
   5. Faites pivoter les traces 3D du ou des objets en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé et en déplaçant la souris et/ou en maintenant le bouton droit de la souris enfoncé et en déplaçant la souris vers l’avant et vers l’arrière pour effectuer un zoom avant ou arrière. Assurez-vous que les traces de l’objet sont correctement alignées et qu’il semble y avoir une transition douce entre chaque trace successive.
   6. Si nécessaire, retracez les traces individuelles pour éliminer les erreurs qui entraînent des arêtes vives et/ou des transitions entre les traces.
   7. Placez une peau de maillage tétraédrique sur l’objet en accédant à Série | Objet | 3D et en cliquant sur le bouton radio Boissonnat surface .
   8. Dans la fenêtre Scène 3D , cliquez sur Scène | Effacez, puis double-cliquez sur le nom de l’objet souhaité dans la liste des objets.
   9. Faites pivoter le ou les objets pour assurer des transitions fluides entre les traces et redessinez les traces si nécessaire.
   10. Pour modifier les couleurs et la transparence de l’objet, cliquez sur le nom de l’objet dans la liste d’objets, puis cliquez sur Scène | Couleur/transparence... dans le menu Liste d’objets . Double-cliquez sur le nom de l’objet dans la liste des objets pour afficher cette modification dans la fenêtre de la scène 3D .
       REMARQUE : La couleur, la transparence et le lissage de l’objet peuvent être modifiés avec un plus grand degré de contrôle et de spécificité à l’aide de Blender (voir 5.4-5.6).
7. Analyse quantitative d’objets 3D
   1. Accéder à la série | Les options | Listes et cliquez sur toutes les mesures souhaitées dans les sections Liste d’objets et Liste de traces de cette fenêtre.
   2. Exportez les mesures de l’objet en ouvrant la liste des objets (Objet | Lister les objets...) puis en cliquant sur Liste | Sauvegardez.
   3. Enregistrez les mesures d’objet telles qu’elles sont affichées dans la liste d’objets sous forme de fichier délimité par des virgules (.csv).
   4. Importez le fichier .csv dans le logiciel d’analyse de données de votre choix. Pour importer dans une feuille de calcul (par exemple, Microsoft Excel), il suffit de double-cliquer sur le fichier ou d’ouvrir un nouveau classeur vierge, en cliquant sur Fichier | Importation | CSV et suivez les instructions.
   5. Pour mesurer les distances entre des objets en 3D (par exemple, pour mesurer la distance de projection d’un spinule synaptique à l’intérieur d’un bouton présynaptique), utilisez la fonction Z-trace dans Reconstruire.
   6. Tout d’abord, donnez un nouveau nom à la trace en accédant à la série | Les options | Noms/Couleurs et en saisissant un nom pour la trace Z.
   7. Ensuite, cliquez sur l’outil Z-trace dans la barre d’outils.
   8. Pour tracer le tracé Z de la distance de projection d’un spinule synaptique, cliquez sur le début du spinule synaptique en cliquant sur le bouton gauche de la souris, puis appuyez sur les boutons Page précédente ou Page suivante pour avancer dans le volume de l’image tout en cliquant sur les points successifs le long de la membrane du spinule synaptique à l’intérieur de chaque section.
   9. Complétez ce Z-trace en cliquant sur le bouton droit de la souris.
   10. Exportez les mesures du Z-trace en cliquant sur Trace | Lister les traces... pour afficher la liste de traces , puis en cliquant sur Liste | Enregistrer pour enregistrer les mesures de la liste de traces sous forme de fichier .csv.
8. Ajout d’un cube d’échelle
   1. Accéder à la première ou à la dernière image de la pile
   2. Aller à la série | Les options | Noms/Couleurs et tapez un nom pour le cube d’échelle.
   3. Dans la barre d’outils, choisissez l’outil Dessiner un rectangle et dessinez un petit carré (de taille sans importance) adjacent aux objets mais sans les masquer. Aller à la série | Les options | 3D, cliquez sur l’option case d’option Boîte dans la zone Générer, et spécifiez la taille du cube d’échelle (en μm) en tapant ses dimensions dans les cases A :, B :, C : dans la zone Taille (par exemple, tapez 0,5 pour A, B et C pour générer un cube d’échelle de 0,5 μm/côté).
      REMARQUE : Avant d’essayer de reconstruire le cube d’échelle en 3D, assurez-vous que les objets 3D souhaités ont déjà été reconstruits dans la scène 3D à l’aide de l’option de surface Traces ou Boissonnat . N’oubliez pas de changer l’option Générer pour revenir à la surface de Boissonnat et les tailles de A, B et C à -1 après avoir reconstruit le cube d’échelle (c’est-à-dire après l’étape 4.8.5).
   4. Ouvrez la liste d’objets et double-cliquez sur le nom du cube d’échelle ; attendez que le cube d’échelle apparaisse dans la fenêtre de la scène 3D .
   5. Pour déplacer le cube d’échelle par rapport aux autres objets, accédez à l’icône Série | Les options | 3D et tapez le nombre de μm souhaité pour déplacer le cube d’échelle dans les cases X, Y et/ou Z . Cliquez sur OK pour fermer la fenêtre, puis double-cliquez sur le nom du cube d’échelle dans la liste d’objets.
      REMARQUE : Alternativement, cela peut être fait à l’aide de Blender (voir ci-dessous).

5. Importer, recolorer, lisser et ajouter de la transparence aux reconstructions 3D dans Blender

REMARQUE : Pour une assistance détaillée dans l’utilisation de Blender, veuillez consulter le manuel de Blender et/ou la myriade de vidéos « comment faire » sur l’utilisation de chaque fonction Blender (il suffit d’effectuer une recherche sur le Web pour Blender ET la fonction souhaitée). Ce qui suit est une courte introduction sur la façon de recolorer, lisser et ajouter de la transparence aux reconstructions 3D.

1. Téléchargez et installez la dernière version de Blender, la suite logicielle 3D gratuite et open-source (www.blender.org).
2. Dans Reconstruire, enregistrez les reconstructions 3D en faisant apparaître le ou les objets souhaités dans la fenêtre de la scène 3D , puis en cliquant sur Scène | Exporter sous | VRML 2.0.
3. Dans Blender, accédez à Fichier | Importation | X3D Extensible 3D (.x3d/.wrl). Cliquez sur le fichier VRML 2.0 qui a été enregistré à partir de Reconstruct , puis cliquez sur le bouton Importer X3D/VRML2 .
4. Recolorez les reconstitutions.
   1. Dans la fenêtre Collection de scènes , dans le coin supérieur droit, désélectionnez/décochez l’icône en forme d’œil de l’objet Cube par défaut, puis cliquez sur les noms des objets individuels pour mettre en surbrillance chaque objet de la scène. Renommez ces objets selon vos besoins.
   2. Cliquez sur le nom du premier objet à recolorer dans la fenêtre Collection de scènes .
   3. Cliquez sur le Contexte circulaire. Matériau en bas de la bande d’icônes de droite, puis cliquez sur Ajouter un matériau. Une liste d’options devrait apparaître ci-dessous. Ensuite, cliquez sur la barre à côté de l’option Couleur de base et choisissez la luminance et la teinte souhaitées pour l’objet.
   4. Pour modifier l’aspect métallique, la brillance et les qualités réfléchissantes de l’objet, ajustez les options Métallique, Spéculaire, Rugosité et Brillance pour produire l’effet souhaité.
      REMARQUE : Pour que certaines options apparaissent dans la scène (par exemple, transparence, brillance), il peut être nécessaire de se trouver dans le paramètre Ombrage de la fenêtre : Look Dev ou Ombrage de la fenêtre : Fenêtre d’affichage rendue . Pour passer à l’un ou l’autre des paramètres de la fenêtre d’affichage, passez la souris sur les icônes de globe en haut à droite et cliquez sur le paramètre de fenêtre d’affichage souhaité.
   5. Pour modifier l’angle d’éclairage, cliquez sur l’objet Lumière dans la fenêtre Collection de scènes , cliquez sur l’icône Afficher le gizmo en haut à droite, puis faites glisser la lumière autour de la scène pour obtenir l’effet d’éclairage souhaité. Modifiez l’intensité lumineuse dans la fenêtre Données d’objet qui s’affiche sous la fenêtre Collection de scènes lorsque l’objet Lumière est sélectionné.
   6. Pour faire pivoter séparément les objets dans les axes sélectionnés, cliquez sur les noms des objets dans la fenêtre Collection de scènes , appuyez sur la touche R , puis cliquez sur la lettre de l’axe de rotation (touche x, y ou z ) et déplacez la souris pour produire la rotation souhaitée. Pour saisir et déplacer des objets, sélectionnez-les dans la fenêtre Collection de scènes , appuyez sur la touche G , puis utilisez la souris pour déplacer des objets dans la scène.
5. Remailler (c’est-à-dire lisser) les reconstructions.
   1. Cliquez sur le nom de l’objet qui vous intéresse dans la fenêtre Collection de scènes , puis utilisez la gigue et la molette de la souris pour centrer et zoomer sur l’objet.
   2. Cliquez sur l’icône de clé à molette Context.Modifiers sur la bande d’icônes de droite, cliquez sur Ajouter un modificateur, puis sur Remailler (sous l’en-tête Générer). Utilisez le menu déroulant pour sélectionner Lisser, cliquez sur le bouton Ombrage lisse et modifiez la profondeur et l’échelle de l’arbre pour obtenir le lissage souhaité.
      REMARQUE : Il est utile d’être dans la fenêtre Ombrage de la fenêtre : Filaire (option d’icône de globe en haut à droite) pendant le remaillage pour afficher directement les résultats. Le remaillage créera des maillages tétraédriques de différentes tailles sur l’objet. Lors du lissage de l’objet pour enlever les artefacts de coupe ou de traçage, veillez à conserver sa forme et ses contours d’origine. Commencez à une profondeur d’arbre = 7 et une échelle = 0,95, puis diminuez lentement ces nombres si nécessaire. Portez une attention particulière aux petits objets minces, tels que les spinules et les densités postsynaptiques, car le petit volume de ces objets diminue la plage de lissage qui peut être effectuée sans modifier leur forme d’origine.
6. Ajoutez de la transparence aux objets.
   REMARQUE : Il est important de rendre les objets transparents lorsqu’il est souhaitable de montrer la relation 3D d’un objet (par exemple, les spinules, les vésicules présynaptiques, les mitochondries, les endosomes) résidant dans un autre objet (par exemple, un bouton présynaptique).
   1. Cliquez sur le nom de l’objet souhaité dans la fenêtre Collection de scènes . Faites défiler vers le bas du contexte. Fenêtre Matériau (icône en bas à droite dans la liste de droite), ouvrez la section Paramètres et utilisez le menu déroulant pour changer le mode de fusion en Fusion alpha. Ensuite, ouvrez la section Surface , faites défiler jusqu’à Alpha et remplacez le nombre par une valeur inférieure à un (1 = entièrement opaque, 0 = entièrement transparent).
7. Exportez des instantanés des reconstructions 3D.
   1. Une fois que la coloration, le lissage et l’éclairage optimaux pour les reconstructions 3D ont été obtenus, enregistrez l’image dans la scène en cliquant sur l’en-tête du menu Fenêtre et en sélectionnant Enregistrer la capture d’écran.
   2. Dans les options d’enregistrement de la capture d’écran en bas à gauche, choisissez le type de fichier, le format de couleur et la compression souhaités.
   3. Tapez le nom de la nouvelle capture d’écran dans la zone de texte du nom de fichier ci-dessus, puis enregistrez la capture d’écran à l’emplacement souhaité.

Results

Quantification du pourcentage de spinules synaptiques dans la population de boutons présynaptiques excitateurs dans le cortex visuel primaire du furet
Bien que des protubérances spinuliennes des neurites dans les boutons présynaptiques excitateurs aient été observées pendant des décennies^19,26, leur importance potentielle pour la fonction synaptique est restée obscure. Ces expériences ont été conçues pour déterminer la proportion de boutons pr...

Discussion

Ce pipeline d’analyse du volume d’images FIB-SEM peut produire des reconstructions 3D fiables et des mesures quantitatives de structures subcellulaires minces. Alors que les techniques semi-automatisées actuelles utilisant des réseaux neuronaux profonds et des algorithmes de segmentation peuvent augmenter la vitesse et l’efficacité de la reconstruction de structures cellulaires possédant un contraste membranaire relativement élevé dans de grands volumes d’images^33,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fidji (ImageJ)			https://imagej.net/software/fiji/downloads
Reconstruire			https://synapseweb.clm.utexas.edu/software-0
Blender	Blender Foundation		https :/www.blender.org