Un protocole multicolore de visualisation 3D-STORM haute résolution pour la minéralisation du collagène dans les fibrilles de collagène de type I recombinant auto-assemblées

Summary

Nous présentons ici un protocole pour distinguer la minéralisation intrafibrillaire de la minéralisation extrafibrillaire dans les fibrilles de collagène recombinant à l’aide de 3D-STORM multicolore, intégrant un marquage optimisé, l’imagerie et l’analyse quantitative de la colocalisation.

Abstract

Ce protocole décrit une méthode multicolore de microscopie de reconstruction optique stochastique tridimensionnelle (3D-STORM) pour la visualisation à l’échelle nanométrique de la minéralisation du collagène dans un modèle de fibrille auto-assemblée de type I recombinant de type I. La méthode permet l’imagerie simultanée du collagène, des protéines non collagéniennes (par exemple, le sulfate de chondroïtine) et des phases minérales de phosphate de calcium. La préparation de l’échantillon implique une amino-silanisation et un auto-assemblage du collagène, suivie d’une minéralisation à l’aide d’un milieu phosphate de calcium qui forme du phosphate de calcium amorphe (ACP) à un stade précoce (30 minutes) et mûrit en hydroxyapatite (HAP) en 6 heures. Un marquage par immunofluorescence multiplexé est ensuite réalisé, et les échantillons sont d’abord évalués par microscopie confocale avant l’acquisition de l’image 3D-STORM à l’aide d’un tampon d’imagerie récupérant l’oxygène. Le traitement et l’analyse des données sont réalisés à l’aide de logiciels accessibles au public. Comparé à la microscopie électronique ou confocale conventionnelle, ce protocole combine spécificité moléculaire avec résolution à l’échelle nanométrique (précision latérale typique 20–30 nm, axiale 50–60 nm), permettant une visualisation tridimensionnelle des schémas de minéralisation intrafibrillaire versus extrafibrillaire. Les résultats représentatifs montrent une visualisation claire des réseaux de collagène, des protéines non collagéniennes associées et des phases minérales dans l’espace tridimensionnel. Des métriques quantitatives, dont le coefficient de corrélation de Pearson (0,89 ± 0,04) et le coefficient de chevauchement de Manders (0,91 ± 0,03), sont fournies dans la section Résultats. Ce protocole offre un outil puissant pour les chercheurs en science des biomatériaux, biominéralisation et ingénierie tissulaire osseuse qui ont besoin d’une compréhension nanométrique de la dynamique de la minéralisation.

Introduction

La minéralisation du collagène est un processus biologique fondamental et essentiel à la formation des tissus durs tels que les os et les^{dents 1}. La structure complexe des fibres de collagène, associée à une régulation finement réglée du dépôt minéral, confère à ces tissus une force mécanique et une intégrité structurelle^{remarquables.} Le collagène ne sert pas seulement d’échafaudage passif, mais aussi de participant actif, orchestrant une déposition minérale précise à travers des interactions moléculaires et physiques^{complexes 3}. Élucider ces mécanismes est crucial pour comprendre des pathologies telles que l’ostéoporose et la carie dentaire, ainsi que pour développer des matériaux biomimétiques destinés aux thérapies^{régénératrices 4}.

Le diamètre des fibres de collagène dans les tissus durs varie d’environ 50 à 100 nm, les particules d’hydroxyapatite (HAP) étant encore plus petites (généralement 2 à 5 nm d’épaisseur et 20 à 30 nm de longueur) et intercalées dans des espaces^{fibrillaires 5}. Bien que les zones de gap puissent agir comme des sites de nucléation, dans les tissus indigènes, les minéraux se forment d’abord dans les espaces interfibrillaires puis s’étendent ensuite en compartiments intrafibrillaires. Les méthodes traditionnelles de caractérisation incluent la coloration histologique, la microscopie laser^{confocale 6,7} et la microscopie^{électronique 8,9}. La coloration histologique permet une évaluation macroscopique mais ne peut pas évaluer les états de minéralisation à l’échelle nanométrique. La microscopie confocale permet d’observer des composants spécifiques mais est limitée par la diffraction (~200 nm latéralement), incapable de résoudre la minéralisation intrafibrillaire et^{extrafibrillaire 10}. La microscopie électronique offre une haute résolution mais manque de spécificité moléculaire. Bien que le marquage immunogold puisse fournir une spécificité moléculaire pour la microscopie électronique, il nécessite un traitement spécialisé et est moins adapté à la visualisation multiplexée et tridimensionnelle de plusieurs composants comparé à STORM, et implique de longs cycles expérimentaux et des coûts^{élevés 11}.

La microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) dépasse la limite de diffraction en localisant les fluorophores individuels avec une grande précision, atteignant une résolution latérale^{de ~20 nm 12}. Comparé à d’autres techniques de super-résolution telles que la microscopie à déplétion d’émission stimulée (STED⁾¹³et la microscopie à éclairage structuré (SIM)¹⁴, STORM offre une précision de localisation supérieure (~20 nm latéralement et ~50 nm axialement) et est compatible avec une gamme plus large de fluorophores organiques. En particulier, STED nécessite des colorants spécialisés et des puissances laser élevées pouvant endommager les échantillons biologiques, tandis que le SIM n’offre qu’une résolution de ~100 nm, insuffisante pour résoudre des caractéristiques à l’échelle du fibrille (50–100 nm). STORM offre un équilibre pratique entre résolution, capacité de multiplexage et compatibilité d’échantillons. Les lignes directrices publiées ont décrit des échantillons d’essai standardisés pour faciliter l’optimisation des paramètres d’imagerie STORM et l’évaluation^{de la résolution 15}. Combiné à des capacités d’imagerie tridimensionnelle, 3D-STORM permet la visualisation nanométrique de plusieurs composants^{simultanément 16}. Les avancées récentes ont étendu STORM à l’imagerie multicolore et multiplexée, permettant la visualisation de plusieurs cibles au sein du même échantillon^17,18.

Ce protocole utilise un modèle biomimétique in vitro basé sur des fibrilles de collagène de type I recombinant auto-assemblées et est explicitement conçu pour des modèles de fibrilles autoassemblées de type I recombinant in vitro afin de distinguer la minéralisation intrafibrillaire de l’extrafibrillaire à l’échelle nanométrique. Il n’est pas adapté à l’imagerie de cellules vivantes, car STORM nécessite des échantillons fixes et des tampons récupérant l’oxygène. Il n’est pas non plus adapté aux tissus natifs hautement minéralisés (par exemple, l’os mature) sans décalcification préalable ni prélèvement d’antigènes. Si seule la densité minérale globale ou la morphologie de grande surface nécessite une évaluation, la microscopie confocale conventionnelle ou électronique est plus efficace.

L’objectif global de ce protocole est de fournir un flux de travail standardisé et progressif pour l’utilisation de 3D-STORM multicolore afin de visualiser la distribution nanométrique des minéraux et des protéines non collagéniennes au sein des fibrilles individuelles de collagène, en mettant particulièrement l’accent sur la distinction entre minéralisation intrafibrillaire et extrafibrillaire. Ce protocole intègre un immunomarquage optimisé avec un tampon d’imagerie adapté permettant le suivi simultané de multiples composants organiques (collagène, protéines non collagéniques) et des phases inorganiques (ACP, HAP) en trois^{dimensions 19}. Une innovation clé est l’évaluation quantitative des schémas de minéralisation intrafibrillaire versus extrafibrillaire. La quantification est réalisée par deux critères indépendants : (1) calculer le coefficient de colocalisation de Pearson entre les canaux minéraux (un colorant indicateur de calcium (par exemple, la calcéine)) et le collagène (un colorant fluorescent rouge lointain) à l’aide du module de colocalisation dans un logiciel d’analyse d’image (coefficient >0,8 indique une forte association) ; (2) analyse de la persistance du signal minéral à travers les tranches Z de fibrilles individuelles : si le signal minéral est présent dans les tranches centrales (Z = 0 à ±120 nm du centre vertical de la fibrille) à une intensité ≥50 % du maximum, il est classé comme intrafibrillaire. Contrairement à la microscopie électronique ou confocale conventionnelle, ce protocole combine spécificité moléculaire avec résolution nanométrique, permettant une distribution spatiale tridimensionnelle de la minéralisation intrafibrillaire.

Ce protocole est conçu pour les chercheurs en science des biomatériaux, biominéralisation et génie tissulaire osseux nécessitant une compréhension nanométrique de la dynamique de la minéralisation. La procédure standardisée peut également être adaptée pour étudier d’autres systèmes minéralisés de collagène, tels que les tranches de dentine déminéralisées ou les hydrogels à base de collagène, en ajustant en conséquence les étapes initiales de préparation de l’échantillon.

Protocol

Toutes les expériences impliquant des échantillons biologiques ont été menées conformément aux directives et règlements des installations centrales de la Faculté de médecine de l’Université du Zhejiang et ont été approuvées par le Comité de biosécurité institutionnelle (certificat d’approbation n° BSL20235710079). Le protocole expérimental décrit ici utilise des réactifs d’origine commerciale et des systèmes biomimétiques in vitro. Il n’implique pas de participants humains, de sujets animaux ou d’échantillons de tissus humains, et ne nécessite donc pas d’approbation éthique d’un comité d’éthique institutionnel.

ATTENTION : Toutes les procédures impliquant des produits chimiques dangereux doivent être effectuées dans une hotte à fumée équipée d’un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants, lunettes de sécurité). Éliminer les déchets chimiques conformément aux règlements institutionnels. Pour le NaN₃, collectez les déchets dans un récipient dédié marqué « déchets azides » et ne les mélangez pas avec des acides (risque de gaz explosif). Pour le glutaraldéhyde, inactivez avec un excès de 10 % de bisulfite de sodium avant l’élimination. Pour le β-mercaptoéthanol, oxydez avec de l’eau de Javel (1:10 v/v) pendant 1 h avant l’élimination par le drain.

REMARQUE : Le marquage par immunofluorescence DOIT être effectué AVANT la minéralisation afin d’éviter le masquage des épitopes par les dépôts minéraux. Pour les applications nécessitant un marquage post-minéralisation, une récupération d’antigènes peut être nécessaire.

1. Préparation du milieu minéralisé

1. Préparation d’un milieu minéralisé pour les fibrilles de collagène reconstituées
   1. Préparez la solution de bouillon de calcium en ajoutant 100 μL d’acide polyaspartique de 5 mg/mL (p-Asp, Mw 9-11 kDa) goutte à goutte sur 5 mL de solution de 3,44 mM CaCl₂ dans un tube conique de 15 mL.
   2. Mélangez le vortex dans le tube pendant 30 secondes jusqu’à ce qu’il soit homogène.
   3. Ajoutez lentement le p-Asp et mélangez soigneusement pour stabiliser le phosphate de calcium amorphe (ACP).
   4. Ajoutez 5 mL de solution phosphatée (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) à la solution de calcium.
   5. Mélange vortex pendant 1 minute.
      REMARQUE : Concentrations finales après mélange : 1,67 mM de CaCl₂, 9,5 mM de Na₂HPO₄, 150 mM de NaCl et 50 μg/mL de p-Asp.
   6. Préparez le milieu de minéralisation immédiatement avant utilisation. Ne pas stocker ; utilisez immédiatement le précurseur ACP instable pour obtenir des résultats cohérents.
      REMARQUE : Le stockage conduit à une cristallisation prématurée.
2. Préparation d’un milieu de minéralisation pour gels de collagène/dentine déminéralisée
   1. Préparez une solution contenant du calcium en dissolvant 8,77 g de NaCl, 0,01 g de NaN₃, 6,06 g de Tris et 1,11 g de CaCl₂ dans 800 mL d’eau déionisée.
   2. Réduisez le volume à 1 L avec de l’eau déionisée.
   3. Ajoutez 350 μg/mL d’acide polyacrylique (PAA, MW ~1800) à la solution contenant du calcium.
   4. Vortex pendant 1 minute.
      REMARQUE : Utilisez du PAA au lieu du p-Asp pour une meilleure stabilisation à des concentrations de calcium élevées.
   5. Préparez la solution phosphate en dissolvant 0,85 g de Na₂HPO₄ dans 1 L d’eau déionisée pour obtenir 6 mM de Na₂HPO₄.
   6. Filtrez la solution phosphatée à l’aide d’une membrane de 0,22 μm.
   7. Combinez des volumes égaux (par exemple, 500 mL chacun) de solutions de calcium et de phosphate avec un brassage magnétique à 300 tr/min.
   8. Ajustez le pH à 7,4 avec 1 M HCl ou NaOH tout en surveillant avec un pH-mètre.
      REMARQUE : Maintenez un pH à 7,4 ± 0,1. Ne laissez pas de déviations de pH >0,2, qui provoquent une cristallisation prématurée.

2. Préparation des fibres de collagène recombinant

1. Amino-silanisation des plats à fond de verre
   REMARQUE : Ce traitement utilise du triethoxysilane (3-aminopropyl) (APTES) pour introduire des groupes aminés chargés positivement (-NH₂) sur la surface vitrée, ce qui favorise l’adsorption électrostatique et la stabilisation des monomères de collagène chargés négativement.
   1. Ajouter 200 μL de solution APTES (5 % v/v en éthanol absolu) à chaque bol de culture à fond de verre (35 mm, épaisseur #1,5H, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. Assurez-vous de couvrir complètement la surface de la vaisselle avec la solution APTES.
   3. Incubez dans l’obscurité pendant 2 heures à température ambiante (20–25 °C).
   4. Rincez la vaisselle trois fois avec de l’éthanol pur (2 mL par lavage).
   5. Ultrasoniser dans de l’eau déionisée pendant 10 minutes à 40 kHz. Retirez complètement les résidus d’APTES pour éviter la liaison non spécifique.
   6. Les plats silanisés peuvent être conservés secs à 4 °C pendant jusqu’à 1 semaine.
   7. (Optionnel) Cuire pour une meilleure stabilité : placez la vaisselle lavée et séchée au four à 100–120 °C pendant 30 à 60 minutes.
   8. Laissez refroidir à température ambiante avant de continuer.
      REMARQUE : Si vous utilisez des plats en plastique, baissez la température en dessous de 80 °C pour éviter la déformation. Adapter la procédure de silanisation de Bitter et^{Muir 20}.
2. Auto-assemblage du collagène et réticulation
   1. Pipeter 100 μL de solution de collagène-I (50 μg/mL dans 0,1 acide acétique M) sur chaque plat silanisé.
   2. Incubez à 37 °C pendant 10 heures dans une chambre d’humidité (> 90 % d’humidité relative). Maintenez une humidité stable pour éviter l’évaporation de la solution.
   3. Vérifier la formation de la fibrille par microscopie à contraste de phase ou confocale ; Une préparation réussie montre un réseau de fibrilles fin, semblable à une toile.
   4. Pour vérifier la formation correcte de fibrilles au niveau ultrastructurel, préparez un échantillon séparé sur une grille TEM formelle/revêtue de carbone en polyvinyle en suivant les mêmes conditions d’auto-assemblage (collagène-I 50 μg/mL, 37 °C, 10 h, humidité > 90 %).
   5. Colorez avec un acide phosphotingostique à 1 % (pH 7,0) pendant 10 minutes.
   6. Lavez-le à l’eau déionisée.
   7. Examinez sous un microscope électronique à transmission. La fibrillogenèse réussie est indiquée par le motif caractéristique de bandes périodiques D de 67 nm (voir Figure 3).
   8. Aspirez soigneusement la solution résiduelle de collagène provenant des plats à fond de verre.
   9. Ajoutez 2 mL de solution de sulfate de chondroïtine (CS) (50 mg/mL dans PBS, pH 5,5) dans chaque plat.
   10. Incubez à 4 °C pendant 12 heures pour permettre l’adsorption électrostatique du CS sur les fibrilles de collagène.
   11. Préparer la solution de réticulation EDC/^{NHS 21} : dissoudre 0,2 M EDC (1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide) et 0,05 M NHS (N-hydroxysuccinimide) dans un tampon MES (0,1 M MES, pH 5,5).
       REMARQUE : Le tampon MES peut être préparé en dissolvant l’acide libre MES dans de l’eau déionisée et en ajustant le pH à 5,5 avec NaOH.
   12. Retirez la solution CS et ajoutez 2 mL de la solution de réticulation EDC/NHS.
   13. Incubez à température ambiante pendant 2 h pour immobiliser covalentement le CS sur le collagène.
   14. Lavez la vaisselle trois fois avec du PBS (5 mL chacun, 5 min chacun) pour éliminer les réactifs non réagis.
   15. Conservez les fibres de collagène transformées dans des PBS à 4 °C pendant jusqu’à 24 h avant la minéralisation.

3. Marquage par immunofluorescence (réalisé AVANT la minéralisation)

1. Préparation de l’échantillon
   1. Rincez les fibrilles de collagène trois fois avec une solution de NaCl de 500 mM (10 mL par lavage, 5 min chacun).
   2. Laver trois fois avec de l’eau déionisée (10 mL par lavage, 5 min chacun).
   3. Effectuez les lavages sur une plateforme de vibration horizontale tournant à 50 tr/min pour assurer un nettoyage complet tout en minimisant les forces de cisaillement qui pourraient détacher les fibrilles assemblées.
2. Blocage et incubation primaire des anticorps
   1. Incubez avec un tampon bloqueant (albumine sérique bovine à 5 % dans PBS) à 37 °C pendant 1 heure dans une chambre humidifiée.
   2. Préparez un cocktail d’anticorps dans un tampon de blocage : anticollagène-I de lapin (dilution 1:100) et sulfate anti-chondoïtine de souris (dilution 1:100).
   3. Ajoutez 200 μL de cocktail d’anticorps par échantillon.
   4. Couvrez les échantillons avec un film de scellement de laboratoire.
   5. Incubez à 4 °C toute la nuit (12–16 h).
   6. Protège de la lumière avec du papier aluminium. Après l’incubation primaire des anticorps, les échantillons peuvent être conservés dans le PBS à 4 °C pendant jusqu’à 24 heures.
3. Coloration secondaire par anticorps
   1. Éliminez les anticorps primaires non liés en lavant la vaisselle trois fois avec un tampon de lavage (0,1 % Tween-20 dans PBS), 10 minutes par lavage.
   2. Préparez le mélange d’anticorps secondaires fluorescents dans un tampon de blocage (200 μL par plat de 35 mm) contenant : l’IgG anti-lapin de chèvre conjugué à un colorant fluorescent rouge lointain (1:100) et l’IgM anti-souris de chèvre conjugué à un colorant fluorescent rouge (1:100).
      REMARQUE : À partir de cette étape, protégez les échantillons de la lumière pour éviter le photoblanchiment du fluorophore.
   3. Incuber des échantillons à température ambiante (20–25 °C) pendant 1 heure dans l’obscurité.
   4. Lavez la vaisselle trois fois avec un tampon de lavage (10 min chacun) pour éliminer les anticorps secondaires non liés.
      REMARQUE : Conserver les échantillons marqués dans des PBS à 4 °C (protection de la lumière) jusqu’à 48 heures avant l’imagerie. Incluez des contrôles sans anticorps primaires pour vérifier l’autofluorescence.

4. Minéralisation des fibres de collagène (réalisée APRÈS marquage)

1. Procédé de minéralisation
   1. Ajoutez 2 mL de milieu de minéralisation fraîchement préparé par plat.
   2. Incuber à 37 °C pendant 30 minutes (à court terme) pour la formation minérale précoce (ACP).
   3. Sinon, incubez à 37 °C pendant 6 h (à long terme) pour la cristallisation des minéraux matures (HAP).
      REMARQUE : Maintenez une température exacte à 37 °C ± 0,5 °C à l’aide d’un incubateur calibré.
   4. Aspirez doucement le milieu de minéralisation.
   5. Rincez trois fois avec de l’eau déionisée (5 mL par lavage, intervalles de 1 minute).
2. Marquage au phosphate de calcium
   1. Ajoutez 4 μM d’un colorant indicateur de calcium (par exemple, la calcéine) dans un PBS (200 μL par bol).
   2. Incubez à température ambiante (20–25 °C) pendant 30 minutes dans le noir.
      REMARQUE : Le colorant indicateur de calcium (par exemple, la calcéine) se lie aux ions calcium et ne fait pas de distinction entre les phases amorphe et cristalline ; l’affectation des phases est basée sur le temps de minéralisation (30 min = ACP, 6 h = HAP). Il doit être protégé de la lumière avec des tubes ambrés ou du film aluminium.
   3. Rincez cinq fois : trois lavages à l’eau déionisée et deux lavages à 70 % d’éthanol (1 min chacun), en alternant entre les deux.
3. Préparation de l’échantillon pour l’imagerie
   1. Immergez les échantillons dans un tampon d’imagerie : 10 % (p/v) de glycérol dans le PBS. En option, ajoutez un réactif antifondu selon les instructions du fabricant.
   2. Appliquer un volume suffisant (20 à 50 μL) de tampon d’imagerie pour couvrir l’échantillon.
   3. Placez une enveloppe sur l’échantillon.
   4. Conservez les échantillons à 4 °C dans le noir pendant jusqu’à 72 heures.

5. Observation au microscope confocal laser

1. Transfert d’échantillons de stockage à 4 °C à température ambiante (20–25 °C).
2. Laissez 10 minutes d’équilibre pour éviter la condensation.
3. Maintenez une protection légère à l’aide de contenants ambrés ou de film aluminium.
4. Vérifiez que le tampon d’imagerie couvre l’ensemble de l’échantillon.
5. Configurez le microscope confocal avec les réglages suivants :
   1. Pour l’imagerie au collagène (colorant fluorescent rouge lointain) : laser 647 nm, filtre d’émission 650-710 nm.
   2. Pour l’imagerie au phosphate de calcium (colorant indicateur de calcium (par exemple, calcéine) : laser 488 nm, filtre d’émission 500-550 nm.
   3. Objectif : 100× immersion à l’huile (NA 1,4).
   4. Diamètre du trou d’épingle : 1 unité d’air (UA).
   5. Temps de permanence des pixels : 1-2 μs.
      REMARQUE : Effectuez l’alignement laser et la calibration des trous d’épingle avant l’imagerie.
6. Effectuer un balayage séquentiel : premier scan avec excitation de 647 nm (collagène).
7. Effectuer un second balayage avec une excitation minérale de 488 nm.
   REMARQUE : Collectez les canaux séquentiellement pour éviter le passage à travers.
8. Pour la reconstruction 3D, réglez la taille de pas de la pile Z à 0,5 μm ou moins pour garantir un échantillonnage adéquat.
9. Sauvegarder les fichiers avec les métadonnées préservées.
10. Pour l’analyse de colocalisation, utilisez un logiciel d’analyse d’images capable de calculer le coefficient de corrélation de Pearson (par exemple, des logiciels accessibles publiquement avec des plugins appropriés).

6. Imagerie par microscopie de reconstruction optique stochastique tridimensionnelle (3D-STORM)

1. Préparation du tampon d’imagerie^{STORM 22}
   REMARQUE : La glucose oxydase et la catalase sont ajoutées au tampon d’imagerie pour récupérer l’oxygène, réduisant ainsi le photoblanchiment et prolongeant le clignotement des fluorophores, essentiel à la localisation d’une seule molécule dans STORM.
   1. Préparez une solution de glucose oxydase (GOx) à 8 mg/mL dans un tampon d’acétate de sodium de 50 mM (pH 5,1).
   2. Préparez une solution de catalase à 160 μg/mL en 1× PBS.
      REMARQUE : On ajoute les stocks enzymatiques, on les fait congeler instantanément à l’aide d’azote liquide ou un bain de glace sèche/éthanol, et on les conserve à -20 °C ou -80 °C. Évitez les cycles répétés de gel-dégel.
   3. Préparez un tampon d’imagerie STORM frais sur glace, protégé de la lumière.
   4. Combinez les composants suivants dans l’ordre indiqué pour obtenir un volume final de 1 mL : H₂O stérile sans nucléase (à 1 mL), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM final), 1 M Tris-HCl pH 8,0 (50 μL, 50 mM final), 1 M de cystéamine (MEA) fraîchement préparé ajusté à pH ~7,0 (50 μL, 50 mM final), 50 % (p/v) de glucose (200 μL, 10 % en v/v final), action GOx (200 μL, 1,6 mg/mL final), stock de catalase (200 μL, 32 μg/mL final).
   5. Mélangez doucement par pipette ou inversion. Ne faites pas de vortex.
      REMARQUE : Le tampon doit être préparé frais et maintenu sur la glace, protégé de la lumière. À utiliser dans les 30 minutes suivant la préparation. Pour une optimisation détaillée des conditions d’imagerie STORM, consultez les protocoles établis utilisant les échantillons^{d’essai 15}.
   6. Ajoutez 200 μL de tampon d’imagerie STORM fraîchement préparé pour couvrir complètement l’échantillon.
2. Configuration du système 3D-STORM
   1. Assurez-vous que le chemin d’imagerie est dirigé vers une caméra CCD à multiplication d’électrons (EMCCD).
   2. Activez le module de lentille cylindrique pour l’imagerie 3D.
   3. Réglez le logiciel en mode acquisition 3D STORM.
   4. Configurez les filtres de chemin optique pour les colorants utilisés.
   5. Allumez le laser 647 nm et réglez la puissance à un niveau bas (1-5 mW).
   6. À l’aide d’un objectif d’immersion en huile de 100× (NA ≥1.4), localisez la région d’intérêt en mode aperçu en champ grand ou en mode TIRF en temps réel.
   7. Acquérir une image de fluorescence large champ conventionnelle pour une comparaison ultérieure.
   8. Passer en mode éclairage TIRF.
   9. Calibrez l’angle TIRF pour obtenir un champ d’illumination mince (~100-200 nm) afin de minimiser la fluorescence de fond.
   10. Ajustez le temps d’exposition de l’appareil photo (10-30 ms) en fonction de l’intensité initiale du signal.
   11. Ajustez la puissance du laser d’imagerie en fonction de l’intensité initiale du signal.
   12. Effectuez un bref test d’acquisition.
   13. Vérifiez que les paramètres sont correctement réglés sans provoquer un photoblanchiment rapide.
       REMARQUE : Assurez-vous d’aligner précisément l’axe cylindrique de la lentille avec le plan d’échantillon. La plupart des systèmes modernes disposent d’un étalonnage automatisé. Pour l’étalonnage manuel, utilisez des billes fluorescentes de 100 nm pour vérifier les fonctions d’écartement symétriques et de points ronds (PSF).
   14. Commencez par une exposition de 10 à 30 ms à une puissance laser de 647 nm de 1 à 2 kW^/cm2.
   15. Vérifiez que la densité de clignement est de 0,1 à 1 molécule/^{μm 2}.
   16. Si la densité est trop faible ou trop élevée, ajustez la puissance du laser ou le temps d’exposition en conséquence.
   17. Répétez la vérification et l’ajustement jusqu’à atteindre la densité idéale.
3. Acquisition de données 3D-STORM
   1. Réglez le logiciel d’acquisition en mode « Activation continue ».
   2. Réglez le laser d’imagerie (647 nm) à haute puissance (entrée fibre de 100-500 mW) pour faire passer la plupart des fluorophores à l’état sombre.
   3. Réglez le laser d’activation (405 nm) à faible puissance (0,1–5 mW).
   4. Optimiser empiriquement la puissance de 405 nm pour maintenir 100 à 200 molécules localisées par image dans une région de 256×256 pixels.
   5. Fixez le nombre total d’images entre 10 000 et 20 000.
   6. Utilisez 1 image de lumière d’activation (405 nm) suivie de 5 images de lumière d’imagerie (647 nm) par cycle.
   7. Commencez l’acquisition.
   8. Fonctionne l’EMCCD avec une sensibilité maximale (gain EM appliqué)
   9. Utilisez une exposition de 10 à 30 ms par image.
   10. Lors de l’acquisition, surveillez la densité des molécules actives.
   11. Ajustez la puissance laser de 405 nm pour maintenir un flux constant d’événements à une seule molécule.
       REMARQUE : Les données brutes du film peuvent être stockées sur un disque dur standard pour un archivage à long terme avant reconstruction.
4. Analyse des données de la minéralisation du collagène (utilisant un logiciel d’analyse d’images avec le module STORM)
   1. Dans le logiciel d’analyse, sélectionnez le pilote caméra approprié (module STORM).
   2. Cliquez sur [Interface d’analyse] dans le panneau STORM. La fenêtre d’analyse s’ouvre.
   3. Cliquez sur [Ouvrir le fichier]. Sélectionnez le fichier image brute de microscopie à analyser. Cliquez sur Ouvrir.
   4. Déterminer la valeur minimale de fluorescence (hauteur minimale) pour les signaux valides.
   5. Trouvez la tache la plus sombre encore reconnaissable comme un signal à une seule molécule.
   6. Déplacez la souris vers son centre.
   7. Lisez la valeur de hauteur de pic.
   8. Note cette valeur.
   9. Cliquez sur [Paramètres d’identification]. Dans la boîte de dialogue, définissez les paramètres suivants : Hauteur minimale (entrez la valeur enregistrée à l’étape 6.4.8), Hauteur maximale (20000), Base CCD (100), et pour les données 3D-STORM, cochez « 3D » (décochez pour 2D).
   10. Cliquez >> pour développer plus de paramètres. Réglé : largeur minimale (nm) à 200, largeur maximale (nm) à 700 (400 pour 2D), largeur d’ajustement initiale (nm) à 300, rapport axial max à 2,5 (1,3 pour 2D), et déplacement maximal (pix) à 1.
   11. Cliquez sur OK pour fermer la boîte.
   12. Effectuez une analyse test pour valider les paramètres. Décochez la correction de dérive.
   13. Fixez les périodes à 1.
   14. Cliquez sur [Test].
   15. Après analyse, cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
   16. Vérifiez que les points de signalisation sont correctement identifiés. Le bruit de fond ne doit pas être mal sélectionné. Les vrais endroits ne doivent pas être manqués.
   17. Si cela ne satisfait pas, répétez les étapes 6.4.9–6.4.16 pour ajuster les paramètres jusqu’à ce que les paramètres soient corrects.
   18. Après la validation de l’analyse test, effectuez l’analyse complète. Vérifiez la correction de dérive.
       REMARQUE : Le logiciel d’analyse effectue la correction de dérive à l’aide d’un algorithme de corrélation croisée redondante (RCC) qui maximise la corrélation entre les segments temporels des localisations moléculaires. Aucune perle fiduciaire n’est requise²³.
   19. Conserver les règles = 1.
   20. Cliquez sur [Démarrer] (ou cliquez sur [Test] à nouveau, puis sur [Démarrer]).
   21. Attendez que l’analyse soit terminée. Cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle.
   22. Après analyse, deux fichiers résultats (.bin et .txt) sont générés dans le même dossier que le fichier .nd2.
   23. Pour l’analyse de colocalisation (canaux 647 nm et 488 nm), affichez les deux canaux simultanément dans la liste des canaux de la fenêtre d’analyse.
   24. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) appropriée.
   25. Utilisez le module de colocalisation pour calculer le coefficient de corrélation de Pearson. Si cela n’est pas automatiquement fourni, exportez manuellement les données du nuage de points vers un plugin de colocalisation dans un logiciel d’analyse d’images accessible publiquement. Notez la valeur.
   26. Effectuer une analyse par tranche Z pour confirmer la minéralisation intrafibrillaire. Dans le menu principal, sélectionnez Afficher > pas en Z > Tranche.
   27. Extraire les plans individuels à des intervalles de 60 nm.
   28. Observez le signal minéral (vert, canal 488 nm). Vérifiez si le signal persiste dans les tranches centrales (Z = 0 nm ±120 nm). La persistance confirme la minéralisation intrafibrillaire.
   29. Optionnel : effectuer un filtrage de densité pour réduire le surcomptage causé par des émetteurs densément compacts. Ouvrez l’image reconstruite STORM dans un logiciel d’analyse d’image accessible publiquement à l’aide d’un plugin pour l’analyse de localisation à une seule^{molécule 24}.
   30. Pour réduire le surcomptage causé par les émetteurs densément compacts, appliquez un filtrage de densité (par exemple, filtre médian ou seuil local de densité) basé sur la densité du signal.
   31. Si la correction de dérive n’a pas été activée à l’étape 6.4.18 ou si une correction supplémentaire est nécessaire, effectuer une correction de dérive. Exact, basé sur le PSF des marqueurs fiduciaires. Sinon, utilisez des algorithmes de corrélation croisée (par exemple, la correction de dérive implémentée dans le même plugin).
   32. Effectuer le démélange spectral pour éliminer la diaphonie du canal. Dans la fenêtre d’analyse STORM, cliquez sur l’outil de suppression de diaphonie (généralement en bas à droite).
   33. Réglez le rayon à 25,0 nm (recommandé). Sélectionnez le canal source. Sélectionnez la méthode de retrait : Statistique est recommandée.
   34. Pour éliminer l’activation croisée causée par le laser d’excitation, sélectionnez Soustraire en plus de NSA > Activation croisée. Cliquez sur OK. Un nouveau canal, Activation Non spécifique-Xt, est automatiquement généré.
   35. Validez les niveaux d’autofluorescence et les signaux de fond à l’aide d’échantillons témoins non colorés. Assurez-vous que tous les signaux sont spécifiquement étiquetés.
   36. Effectuez une visualisation 3D. Sélectionnez une région d’intérêt (ROI) dans la fenêtre d’analyse.
   37. Cliquez sur le bouton [3D] (ou [Afficher 3D]). Générez une projection 3D ou un rendu volumineux.
   38. Faites un clic droit pour ajuster les paramètres de rendu. Exportez des vidéos dans des formats courants (par exemple, .avi ou .mp4).
   39. Pour classer un signal minéral comme intrafibrillaire, effectuer une analyse Z-slice comme dans 6.4.26–6.4.28. Profils d’intensité d’exportation.
   40. Définissons le centre de la fibrille comme le plan Z où le signal du collagène est maximal.
   41. Un signal minéral est considéré comme intrafibrillaire si son intensité en Z = 0 (centre) et en Z = ±60 nm est ≥50 % de l’intensité minérale maximale dans cette fibrille. Si le signal descend en dessous de 30 % à Z = 0, classez comme extrafibrillaire.
   42. Enregistrer la classification pour au moins 50 fibrilles par condition afin de calculer le pourcentage de minéralisation intrafibrillaire.
       REMARQUE : Des plugins publics alternatifs sont également disponibles pour le filtrage de densité, la correction de dérive et le démixage spectral.

Results

La mise en œuvre réussie de ce protocole permet une visualisation tridimensionnelle à haute résolution des fibrilles de collagène minéralisés à l’aide de 3D-STORM multicolore. Les résultats suivants illustrent les résultats typiques, les contrôles qualité et les évaluations quantitatives.

La Figure 1 montre une reconstruction multicolore 3D-STORM d’un réseau de collagène minéralisé avec du phosphate de calcium amorphe (ACP). Le co...

Discussion

Ce protocole offre un flux de travail complet pour la visualisation nanométrique de la minéralisation du collagène à l’aide du multicolore 3D-STORM. Plusieurs étapes cruciales nécessitent une attention particulière pour garantir des résultats réussis.

Tout d’abord, la préparation de l’échantillon est fondamentale pour une imagerie STORM de haute qualité. L’amino-silanisation des plats à fond de verre doit être approfondie afin d’assurer une fixation stable des...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyacide aspartique (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Stabilisateur pour le phosphate de calcium amorphe
Chlorure de calcium (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Source de calcium
Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Source de phosphate
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Régulateur de force ionique
Acide polyacrylique (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Stabilisateur pour le calcium à haute concentration
Base de tris	Sigma-Aldrich	T1503	Composant tampon
Azide de sodium (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Agent antimicrobien
(3-Aminopropyl)triéthoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Agent de fonctionnalisation de surface en verre
Éthanol absolu	Sigma-Aldrich	459836	Solvant
Solution de collagène de type I (50 μg/mL dans de l'acide acétique 0,1 M)	Corning	354249	Échafaudage d'auto-assemblage
Chondroitine sulfate (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Protéine non collagène mimétique
EDC (1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide)	Sigma-Aldrich	E7750	Réticulant
NHS (N-hydroxysuccinimide)	Sigma-Aldrich	130672	Activateur de réticulation
Acide MES	Sigma-Aldrich	M5287	Tampon pour la réticulation
Tampon phosphate (PBS)	Gibco	10010023	Tampon de lavage et de dilution
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Agent bloquant
Anticorps anti-collagène I de lapin	Abcam	ab34710	Anticorps primaire pour le collagène
Anticorps anti-chondroïtine sulfate de souris	Sigma-Aldrich	C8035	Anticorps primaire pour le CS
IgG anti-lapin conjugué à un colorant fluorescent rouge lointain (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Anticorps secondaire pour le collagène
IgM anti-souris conjugué à un colorant fluorescent rouge (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Anticorps secondaire pour le CS
Calcéine (colorant indicateur de calcium)	Sigma-Aldrich	C0875	Marqueur de phosphate de calcium
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Détergent pour le tampon de lavage
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516	Composant du tampon d'imagerie
Glucose oxydase (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Détecteur d'oxygène
Catalase	Sigma-Aldrich	C1345	Détecteur d'oxygène
Cystéamine (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Thiol pour le clignotement du fluorophore
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152	Substrat pour la glucose oxydase
Acétate de sodium	Sigma-Aldrich	S2889	Tampon pour le stock de GOx
Acide chlorhydrique (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Ajustement du pH
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	Ajustement du pH
Acide phosphotungstique	Sigma-Aldrich	P4006	Coloration négative pour la TEM
Plats de culture à fond en verre (35 mm, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Substrat d'échantillon; épaisseur de 0,17 mm
Nettoyeur à ultrasons (40 kHz)	Branson	B200	Appareil de nettoyage
Chambre d'humidité	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	Pour l'auto-assemblage du collagène
Microscope électronique à transmission	Hitachi	HT7800	Imagerie TEM
Grilles TEM revêtues de Formvar/carbone (200 mailles)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	Support d'échantillon TEM
Plateforme d'agitation horizontale	Labnet	S2030-RC	Lavage délicat
Microscope confocal à balayage laser	Nikon	A1	Dépistage préliminaire
Système de microscope 3D-STORM (avec lasers 405/488/647 nm, lentille cylindrique, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Imagerie à super-résolution
Objectif à immersion d'huile 100× (NA 1,49)	Nikon	MRD01991	Imagerie haute résolution
pH-mètre	Mettler Toledo	FiveGo F2	Contrôle du pH
Logiciel d'acquisition et d'analyse STORM	Nikon	NIS-Elements (module STORM)	Acquisition et traitement des données STORM
Format de fichier.nd2 (fichier d'image microscopique brute)	Nikon	N/A	Format de fichier d'image brute généré par les microscopes Nikon.
Logiciel d'analyse d'image accessible au public	Source ouverte	N/A	Par exemple, ImageJ avec le plugin ThunderSTORM pour l'analyse de localisation des molécules uniques (colocalisation, correction de dérive)
Parafilm	Bemis	PM996	Couverture de l'échantillon pendant l'incubation
Papier aluminium	Tout fournisseur de laboratoire	N/A	Pour la protection contre la lumière (par exemple, enveloppement des échantillons)
Tubes de microcentrifugation en ambre	Fisher Scientific	05-669-21	Pour la protection contre la lumière des fluorophores
Lamelles de couverture (No. 1.5)	Corning	2855-18	Montage d'échantillon